本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種消除免疫反應(yīng)假陽(yáng)性的試劑。

背景技術(shù)：

化學(xué)發(fā)光免疫分析(chemiluminescenceimmunoassay,clia),是將具有高靈敏度的化學(xué)發(fā)光測(cè)定技術(shù)與高特異性的免疫反應(yīng)相結(jié)合，用于各種抗原、半抗原、抗體、激素、酶、脂肪酸、維生素和藥物等的檢測(cè)分析技術(shù)。

化學(xué)發(fā)光免疫分析包含兩個(gè)部分,即免疫反應(yīng)系統(tǒng)和化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)。羧基磁珠是免疫反應(yīng)系統(tǒng)中最常見(jiàn)的載體，其原理是借助交聯(lián)在磁珠表面的羧基與抗原或抗體的氨基結(jié)合，從而達(dá)到包被抗原或抗體的目的，抗原或抗體結(jié)合到磁珠上后，通常采用bsa或tris等含有氨基的蛋白或溶液去封閉未結(jié)合的羧基，以減少羧基磁珠與無(wú)關(guān)物質(zhì)的結(jié)合。該技術(shù)原理有很多文獻(xiàn)報(bào)道，如“王東升等，抗體包被免疫磁珠的研制及其應(yīng)用，細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志(jcellmolimmunol)2001；17(3)”，該文獻(xiàn)公開(kāi)了一種抗體免疫磁珠的制備方法，利用含bsa的pbs緩沖液，封閉磁珠表面未被結(jié)合的活性基團(tuán)，減少磁珠與無(wú)關(guān)生物物質(zhì)的非特異性結(jié)合。在磁珠包被抗原或抗體過(guò)程中，有大量羧基和氨基反應(yīng)，形成了酰胺鍵或其他中間體，因此有較多由羧基磁珠本身吸附而出現(xiàn)的假陽(yáng)樣本，即使沒(méi)有包被任何抗原或抗體的裸磁珠，在經(jīng)過(guò)活化和封閉過(guò)程后，樣本中的igg抗體同樣會(huì)直接吸附在磁珠上，引起假陽(yáng)反應(yīng)。通常我們會(huì)認(rèn)為是羧基磁珠的封閉不完全而導(dǎo)致這類(lèi)假陽(yáng)反應(yīng)，因此我們會(huì)著重尋找更有效的封閉羧基的試劑或方法，但我們卻忽略了羧基磁珠包被的實(shí)質(zhì)是羧基和氨基的反應(yīng)，而羧基和氨基的反應(yīng)不可避免會(huì)引入酰胺鍵或其他中間體，對(duì)于整個(gè)體系而言，酰胺鍵或其他中間體本身就是新出現(xiàn)的物質(zhì)，并且該類(lèi)物質(zhì)結(jié)合在磁珠端，也有可能會(huì)直接吸附igg抗體而引起假陽(yáng)反應(yīng)。因此，我們需要尋找一種試劑或方法，能解決上述這種由羧基和氨基反應(yīng)而出現(xiàn)的假陽(yáng)問(wèn)題，從而提高試劑的特異性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的是免疫反應(yīng)在磁珠包被抗原或抗體過(guò)程中，由羧基和氨基反應(yīng)形成的酰胺鍵或其他中間體，結(jié)合在磁珠端后，可能會(huì)直接吸附igg抗體而引起假陽(yáng)反應(yīng)，致使試劑特異性降低的問(wèn)題。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種消除免疫反應(yīng)假陽(yáng)性的試劑。

該試劑包含以下成分：

緩沖液a、活化液、載體蛋白、封閉劑以及緩沖液b；

所述活化液中活化物與載體蛋白質(zhì)量比為1:4～4:1，優(yōu)選為1:2,；所述封閉劑中封閉物與載體蛋白質(zhì)量比為1:4～4:1，優(yōu)選為1:1。

進(jìn)一步地，

所述緩沖液a為不含氨基緩沖液，優(yōu)選為mes緩沖液；

所述載體蛋白為含羧基蛋白，優(yōu)選為bsa或酪蛋白或卵清蛋白的一種或幾種；

所述活化液中活化物為edc.hcl或dcc的一種或兩種；

所述封閉劑中封閉物為含氨基蛋白，優(yōu)選為bsa或酪蛋白或卵清蛋白的一種或幾種；

所述緩沖液b為含氨基緩沖液，優(yōu)選為tris緩沖液。

更進(jìn)一步地，

所述緩沖液a濃度為0.025mol/l-0.1mol/l，ph為5～7；

所述緩沖液b濃度為0.1mol/l-1mol/l，ph為6～8。

本發(fā)明試劑由以下步驟制備而成：

步驟一：將載體蛋白加入緩沖液a中，混勻；

步驟二：將活化物溶于緩沖液a中，混勻，活化液制備完成；

步驟三：將步驟二制備的活化液加入步驟一溶液中，混勻；

步驟四：將封閉物溶于緩沖液b中，混勻，封閉劑制備完成；

步驟五：將步驟四制備的封閉劑加入步驟三溶液中，混勻，本發(fā)明試劑制備完成。

本發(fā)明還提供一種試劑盒，其包含上述消除免疫反應(yīng)假陽(yáng)性的試劑。

本發(fā)明提供的一種消除免疫反應(yīng)假陽(yáng)性的試劑，具有以下優(yōu)點(diǎn)：

1、能有效解決免疫反應(yīng)在磁珠包被抗原或抗體過(guò)程中，由羧基和氨基反應(yīng)形成的酰胺鍵或其他中間體，結(jié)合在磁珠端后，可能會(huì)直接吸附igg抗體而引起假陽(yáng)反應(yīng)，致使試劑特異性降低的問(wèn)題；

2、不影響真陽(yáng)樣本的信號(hào)值，提高試劑特異性。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明試劑涉及組份配制方法：

1、0.1mol/lmes溶液配制：稱(chēng)取19.52gmes溶于1l純化水中,用naoh調(diào)ph值至5.8～6.2；

2、10mg/mledc.hcl溶液配制：稱(chēng)取10mg的edc.hcl溶于1ml2～8度冷藏放置的mes溶液中；

3、10mg/mldcc溶液配制：稱(chēng)取10mg的dcc溶于1mldmso中

4、作為載體蛋白，10mg/mlbsa溶液配制：稱(chēng)取10mgbsa，溶于1ml0.1mol/lmes溶液中；

5、作為載體蛋白，10mg/ml酪蛋白溶液配制：稱(chēng)取10mg酪蛋白，溶于1ml0.1mol/lmes溶液中；

6、作為載體蛋白，10mg/ml卵清蛋白溶液配制：10mg卵清蛋白，溶于1ml0.1mol/lmes溶液中；

7、1mol/ltris溶液配制：稱(chēng)取121.1gtris溶于1l純化水中,用濃hcl調(diào)ph值至7.3～7.4；

8、作為封閉劑，10mg/mlbsa溶液配制：稱(chēng)取10mgbsa，溶于1ml1mol/ltris溶液；

9、作為封閉劑，10mg/ml酪蛋白溶液配制：稱(chēng)取10mg酪蛋白，溶于1ml1mol/ltris溶液；

10、作為封閉劑，10mg/ml卵清蛋白溶液配制：稱(chēng)取10mg卵清蛋白，溶于1ml1mol/ltris溶液；

11、tbst溶液配制：稱(chēng)取3.03gtris溶于1l純化水中，再向上述溶液中加入8.775gnacl，用hcl溶液調(diào)ph值至7.3～7.4。

本發(fā)明涉及試劑來(lái)源如下：

mes(蘇州亞科cat：m0006)

edc.hcl(蘇州亞科cat：e0009)

dcc(sigmacat：bcbm3570v)

tris(angus)

bsa(bovogencat：bsas1.0)

酪蛋白(sigmacat：slbf5266v)

卵清蛋白(sigmacat：s7951)

naoh(廣東光華科技股份有限公司分析純)

dmso(成都長(zhǎng)聯(lián)化工試劑有限公司化學(xué)純)

hcl(成都科隆化學(xué)品有限公司分析純)

磁微粒(四川邁克生物新材料技術(shù)有限公司lot:xcl1137)

rnp抗原(四川邁克生物新材料技術(shù)有限公司cat:xcl1104)

scl-70抗原(四川邁克生物新材料技術(shù)有限公司cat:xcl1105)

hrp-抗人igg抗體(四川邁克生物新材料技術(shù)有限公司cat:xcl1158)

anti-rnpcontrol(bio-radlaboratoriescat:liquichek

^tmautoimmunecontrols116)

anti-scl-70control(bio-radlaboratoriescat:liquichek

^tmautoimmunecontrols117)

隨機(jī)臨床樣本(四川省人民醫(yī)院臨床樣本收集)

樣本稀釋液4號(hào)(邁克生物股份有限公司cat:im4212464)

在以下實(shí)施例中，以自身免疫性疾病檢測(cè)項(xiàng)目中的rnp和scl-70兩個(gè)項(xiàng)目為例，分別向上述兩個(gè)項(xiàng)目試劑盒中加入本發(fā)明試劑，并設(shè)定為實(shí)驗(yàn)組，對(duì)照組為原始的不加本發(fā)明試劑的試劑盒。同時(shí)用實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的試劑盒檢測(cè)對(duì)應(yīng)項(xiàng)目的主校準(zhǔn)品和隨機(jī)臨床樣本(已確定這些隨機(jī)臨床樣本為以上兩個(gè)項(xiàng)目的陰性樣本)。比較實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組校準(zhǔn)品和隨機(jī)臨床樣本檢測(cè)信號(hào)值。

本發(fā)明中，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組信號(hào)值差異定義如下：

實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組差異＝(實(shí)驗(yàn)組檢測(cè)信號(hào)值/對(duì)照組檢測(cè)信號(hào)值)*100％

主校準(zhǔn)品檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組差異值越接近100％越好；

隨機(jī)臨床樣本檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組差異值越小越好。

實(shí)施例一本發(fā)明試劑制備方法

分別按以下試劑組份比例(方案一至方案五)制備本發(fā)明試劑：

步驟一：將載體蛋白bsa加入緩沖液a中，混勻；

步驟二：將edc.hcl溶于緩沖液a中，混勻，活化液制備完成；

步驟三：將步驟二制備的活化液加入步驟一溶液中，混勻；

步驟四：將bsa溶于緩沖液b中，混勻，封閉劑制備完成；

步驟五：將步驟四制備的封閉劑加入步驟三溶液中，混勻，本發(fā)明試劑制備完成。

實(shí)施例二rnp、scl-70項(xiàng)目實(shí)驗(yàn)

(一)rnp項(xiàng)目

rnp項(xiàng)目主校準(zhǔn)品制備方法如下：

cal1:樣本稀釋液4號(hào)

cal2:樣本稀釋液4號(hào)將anti-rnpcontrol高值點(diǎn)稀釋4096倍

cal3:樣本稀釋液4號(hào)將anti-rnpcontrol高值點(diǎn)稀釋512倍

cal4:樣本稀釋液4號(hào)將anti-rnpcontrol高值點(diǎn)稀釋128倍

cal5:樣本稀釋液4號(hào)將anti-rnpcontrol高值點(diǎn)稀釋32倍

cal6:樣本稀釋液4號(hào)將anti-rnpcontrol高值點(diǎn)稀釋16倍

rnp項(xiàng)目r1試劑制備方法如下：

1、清洗：取適量磁微粒，用0.1mol/lmes清洗磁微粒4次，再用0.1mol/lmes重懸磁微粒，使其濃度為10mg/ml；

2、活化：取現(xiàn)配edc.hcl溶液，按edc.hcl與磁微粒質(zhì)量比1:20的比例向重懸好的磁微粒中加入edc.hcl溶液，渦旋混勻后，室溫水平混勻30分鐘；

3、包被：按抗原與磁微粒質(zhì)量比為1:2000的包被比例向上述活化好的磁微粒中加入需包被的rnp抗原，渦旋混勻后，室溫水平混勻12小時(shí)；

4、再活化：取現(xiàn)配edc.hcl溶液，按edc.hcl與磁微粒質(zhì)量比1:20的比例向包被好rnp抗原的磁微粒中再次加入edc.hcl溶液，渦旋混勻后，室溫水平混勻2小時(shí)；

5、封閉：向上述磁微粒中加入1mol/ltris溶液，室溫水平混勻3小時(shí)；

6、清洗：用tbst溶液清洗上述磁微粒5次，完成r1試劑制備。

將rnp項(xiàng)目r1試劑中分別加入本發(fā)明實(shí)施例一(方案一至方案五)試劑，配套hrp-抗人igg抗體，設(shè)置為實(shí)驗(yàn)組一至實(shí)驗(yàn)組五。rnp項(xiàng)目不加本發(fā)明試劑的r1試劑配套hrp-抗人igg抗體作為對(duì)照組。用實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組試劑盒分別檢測(cè)rnp項(xiàng)目主校準(zhǔn)品和隨機(jī)臨床樣本。分別計(jì)算實(shí)驗(yàn)組一至實(shí)驗(yàn)組五與對(duì)照組差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1

(二)scl-70項(xiàng)目

scl-70項(xiàng)目主校準(zhǔn)品制備方法如下：

cal1:樣本稀釋液4號(hào)

cal2:樣本稀釋液4號(hào)將anti-scl-70control高值點(diǎn)稀釋4096倍

cal3:樣本稀釋液4號(hào)將anti-scl-70control高值點(diǎn)稀釋512倍

cal4:樣本稀釋液4號(hào)將anti-scl-70control高值點(diǎn)稀釋256倍

cal5:樣本稀釋液4號(hào)將anti-scl-70control高值點(diǎn)稀釋64倍

cal6:樣本稀釋液4號(hào)將anti-scl-70control高值點(diǎn)稀釋32倍

scl-70項(xiàng)目r1試劑制備方法如下：

1、清洗：取適量磁微粒，用0.1mol/lmes清洗磁微粒4次，再用0.1mol/lmes重懸磁微粒，使其濃度為20mg/ml；

2、活化：取現(xiàn)配dcc溶液，按dcc與磁微粒質(zhì)量比1:1的比例向重懸好的磁微粒中加入dcc溶液，渦旋混勻后，室溫水平混勻30分鐘；

3、包被：按抗原與磁微粒質(zhì)量比為1:200的包被比例向上述活化好的磁微粒中加入需包被的scl-70抗原，渦旋混勻后，室溫水平混勻12小時(shí)；

4、再活化：取現(xiàn)配dcc溶液，按dcc與磁微粒質(zhì)量比1:1的比例向包被好scl-70抗原的磁微粒中再次加入dcc溶液，渦旋混勻后，室溫水平混勻2小時(shí)；

5、封閉：向上述磁微粒中加入1mol/ltris溶液、10％bsa溶液以及10％酪蛋白溶液的混合封閉液，室溫水平混勻3小時(shí)；

6、清洗：用pbs溶液清洗上述磁微粒5次，完成scl-70項(xiàng)目r1試劑配制。

將scl-70項(xiàng)目r1試劑中分別加入本發(fā)明實(shí)施例一(方案一至方案五)試劑，配套hrp-抗人igg抗體，設(shè)置為實(shí)驗(yàn)組一至實(shí)驗(yàn)組五。scl-70項(xiàng)目不加本發(fā)明試劑的r1試劑配套hrp-抗人igg抗體作為對(duì)照組。用實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組試劑盒分別檢測(cè)scl-70項(xiàng)目主校準(zhǔn)品和隨機(jī)臨床樣本。分別計(jì)算實(shí)驗(yàn)組一至實(shí)驗(yàn)組五與對(duì)照組差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2

比較上述兩個(gè)項(xiàng)目校準(zhǔn)品和隨機(jī)臨床樣本檢測(cè)結(jié)果，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組差異可看出：實(shí)驗(yàn)組試劑對(duì)校準(zhǔn)品測(cè)值影響較小；對(duì)個(gè)別隨機(jī)臨床樣本而言，卻能明顯降低其檢測(cè)信號(hào)值，有效消除假陽(yáng)反應(yīng)。

實(shí)施例三本發(fā)明試劑制備組份篩選實(shí)驗(yàn)

將本發(fā)明實(shí)施例一方案二中活化液中活化物替換為dcc，載體蛋白替換為酪蛋白，封閉劑中封閉物替換為酪蛋白溶于緩沖液b中，形成實(shí)驗(yàn)組二(a)；將本發(fā)明實(shí)施例一方案二中活化物替換為dcc，載體蛋白替換為卵清蛋白，封閉劑中封閉物替換為卵清蛋白溶于緩沖液b中，形成實(shí)驗(yàn)組二(b)。按照實(shí)施例二方法分別對(duì)rnp、scl-70項(xiàng)目檢驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3、表4。

表3

表4

在本發(fā)明制備過(guò)程中,發(fā)明人經(jīng)過(guò)多次實(shí)驗(yàn)表明，將活化液中活化物edc替換為dcc，或同時(shí)使用兩種；將載體蛋白替換為酪蛋白或卵清蛋白或同時(shí)使用多種；將封閉劑中封閉物替換為酪蛋白或卵清蛋白或同時(shí)使用多種，只要活化物、封閉物總質(zhì)量與載體蛋白總質(zhì)量之比符合以上實(shí)施例的要求，都不會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響。

以上內(nèi)容是結(jié)合具體的優(yōu)選實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明所作的進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，不能認(rèn)定本發(fā)明的具體實(shí)施只局限于這些說(shuō)明。對(duì)于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡(jiǎn)單推演或替換，都應(yīng)當(dāng)視為屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。