本發(fā)明涉及一種阿爾茲海默癥標志物的檢測方法，特別涉及一種通過構建dna1/dna2-agncs熒光探針，通過熒光信號變化的方法來檢測阿爾茲海默癥標志物aβ1-40oligomer的方法，屬于生物納米傳感技術領域。

背景技術：

阿爾茲海默癥已經成為二十一世紀威脅人類健康的重大疾病之一，而且越來越趨向于年輕化。因此，阿爾茲海默病標志物含量的準確檢測成為亟待解決的問題。已有文獻報道β淀粉樣蛋白的單體、寡聚體和纖維體是阿爾茲海默癥致病的主要原因，可作為標志物進行檢測，目前對這些標志物檢測方法有共振光散射光譜(c.k.wang,d.j.liu,z.x.wang,chem.commun.2011,47,9339.)、毛細管電泳(r.picou,j.p.moses,a.d.wellman,i.kheterpal,s.d.gilman,analyst2010,135,1631.)、熒光光譜測定法(n.p.cook,v.torres,d.jain,a.a.martí,j.am.chem.soc.2011,133,11121)、電化學生物傳感法(a)m.vestergaard,k.kerman,m.saito,n.nagatani,y.takamura,e.tamiya,j.am.chem.soc.2005,127,11892；b)l.liu,q.g.he,f.zhao,n.xia,h.j.liu,s.j.li,r.l.liu,h.zhang,biosens.bioelectron.2014,51,208.)、spr免疫分析(n.xia,l.liu,m.g.harrington,j.x.wang,f.m.zhou,anal.chem.2010,82,10151.)和免疫分析(l.carlred,a.gunnarsson,s.solé-domènech,b.johansson,v.vukojevi,l.terenius,a.codita,b.winblad,m.schalling，f.p.j.am.chem.soc.2014,136,9973.)，雖然這些檢測方法具有高選擇性和高靈敏性，但是成本高，還需要引入復雜的生物活性分子或是基于抗體的免疫分析。適配體作為一種能與目標分子結合的人工合成寡聚核苷酸或肽分子，與抗體相比，核酸適配體具有高親和力、高穩(wěn)定性、特異性強、適當分割后還可精確地結合目標物等優(yōu)點，基于這些優(yōu)點可實現(xiàn)對目標物的超靈敏檢測。aβ1-40oligomer作為阿爾茲海默癥標志物之一，在腦脊液中廣泛存在，應用核酸適配體成功檢測aβ1-40oligomer含量對阿爾茲海默癥的預防和治療具有積極的作用。

技術實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術存在的缺陷，本發(fā)明的目的是在于提供一種信號強、特異性高、靈敏度高、檢測濃度范圍廣的檢測阿爾茲海默癥標志物的方法。

為了實現(xiàn)上述技術目的，本發(fā)明提供了一種基于三明治結構的銀納米簇探針對aβ1-40oligomer特異性熒光檢測的方法，其包括以下步驟：

1)以dna1為模板合成dna1-agncs銀納米簇；

2)所述dna1-agncs銀納米簇與dna2特異性結合，得到dna1/dna2-agncs熒光探針；

3)所述dna1/dna2-agncs熒光探針與一系列不同濃度的標準aβ1-40oligomer溶液反應后，進行熒光檢測，得到一系列熒光信號值，建立aβ1-40oligomer溶液濃度與熒光信號值的標準曲線；

4)將dna1/dna2-agncs熒光探針與待測aβ1-40oligomer溶液反應后，進行熒光檢測，得到的熒光信號值，并根據(jù)標準曲線，計算出待測aβ1-40oligomer溶液的濃度；

所述dna1包含與dna2互補的片段、合成銀納米簇模板的片段及與aβ1-40oligomer特異性結合的適配體片段splita；

所述dna2包含與dna1互補的片段、富g堿基片段及與aβ1-40oligomer特異性結合的適配體片段splitb。

所述適配體片段splita和適配體片段splitb是aβ1-40oligomer適配體經過分割后形成的兩個片段。

本發(fā)明的技術方案，通過兩條具有互補片段的dna1和dna2構建銀納米簇熒光探針，當dna1與dna2互補時，dna2中富含g堿基的片段靠近銀納米簇，dna1/dna2-agncs熒光探針的熒光得到增強，當加入aβ1-40oligomer后，熒光發(fā)生猝滅，主要是dna1與dna2的適配體片段splita與splitb分別與aβ1-40oligomer特異性結合并自動將aβ1-40oligomer進行包裹形成復合物結構，使得dna2富含g堿基的片段將遠離銀納米簇合成位點，使得g堿基與銀納米簇的距離拉大，從而導致熒光發(fā)生猝滅，通過熒光信號衰減來檢測阿爾茲海默癥標志物的含量，利用該原理，實現(xiàn)了aβ1-40oligomer特異性熒光檢測，檢測下限可達到2nm，并且在20nm～100nm范圍之間，熒光強度隨著濃度的增加呈線性減弱，檢測范圍相對傳統(tǒng)的方法較寬。

優(yōu)選的方案，所述dna1的序列號為：5’---gcctgtggtgttcccccttattccctaatatcgctgacatgatgcaa---3’；

優(yōu)選的方案，所述dna2的序列號為：5’---ttgcatcatgtcagcgatggtgggtggggtggggcgggtgcg---3’。

本發(fā)明的dna1與dna2可購買于生工生物工程(上海)股份有限公司。兩者的序列設計如下：dna1：5’---gcctgtggtgttcccccttattccctaatatcgctgacatgatgcaa---3’；dna2：5’---ttgcatcatgtcagcgatggtgggtggggtggggcgggtgcg---3’；其中dna1的3’端與dna2的5’端各有18個堿基互補；dna1序列中5’---gcctgtggtgtt---3’片段為aβ1-40oligomer適配體分割的片段splita，dna2序列中5’---ggggcgggtgcg---3’片段為aβ1-40oligomer適配體分割的片段splitb，其中，aβ1-40oligomer適體序列為5’---gcctgtggtgttggggcgggtgcg---3’，根據(jù)實驗證實我們將其分割為splita和splitb。splita和splitb同時存在的情況下對對aβ1-40oligomer有特異性結合，可作為檢測阿爾茲海默癥標志物aβ1-40oligomer的探針；且利用dna1中富含c堿基的片段來合成銀納米簇，當dna1與dna2互補時，dna2中富含g堿基的片段靠近銀納米簇，熒光信號得到增強。

優(yōu)選的方案，將dna1磷酸緩沖液與agno3溶液混合后，加入nabh4溶液混勻，在20～30℃恒溫下反應，即得dna1-agncs。更優(yōu)選的方案，先將dna1與硝酸銀溶液、磷酸緩沖液(20mm，ph7.0)室溫下震蕩混勻15min，隨后加入新鮮配制的硼氫化鈉，迅速震蕩混勻，隨后置于25℃恒溫水浴箱中反應2h，即可檢測其熒光信號，經實驗證明此方法合成銀納米簇僅需2h，整個dna1-agncs體系2h即可達到穩(wěn)定。

較優(yōu)選的方案，dna1、agno3和nabh4的摩爾比為1:5～7:5～7。更優(yōu)選為1:6:6。

優(yōu)選的方案，所述dna1-agncs銀納米簇與dna2等摩爾比混合，在室溫下反應，即得dna1/dna2-agncs熒光探針。本發(fā)明的技術方案中采用的dna2與dna1進行混勻一定時間之后，兩鏈的堿基會一一進行互補配對。經過實驗證明，兩鏈進行互補配對所需的時間為1h，也即dna1-agncs與dna2整個溶液混合反應1h之后，體系達到完全的穩(wěn)定，即得到檢測阿爾茲海默癥標志物的熒光探針。

較優(yōu)選的方案，步驟3)中，所述dna1/dna2-agncs熒光探針與標準aβ1-40oligomer溶液在室溫下反應2～6min。更優(yōu)選為2min。

較優(yōu)選的方案，步驟4)中，所述dna1/dna2-agncs熒光探針與待測aβ1-40oligomer溶液在室溫下反應2～6min。更優(yōu)選為2min。

本發(fā)明的dna2與dna1包含可以互補的基因片段，同時也包含可以與阿爾茲海默癥標志物aβ1-40oligomer特異性結合的適配體片段。當dna2與dna1互補后，利用dna2與dna1都含有阿爾茲海默癥標志物aβ1-40oligomer適配體片段的部分，從而使兩條dna鏈可以和阿爾茲海默癥標志物aβ1-40oligomer特異性結合。

相對現(xiàn)有技術，本發(fā)明的技術方案帶來的有益技術效果：

本發(fā)明的技術方案通過構建特殊的dna1/dna2-agncs熒光探針，實現(xiàn)了對阿爾茲海默癥標志物aβ1-40oligomer特異性的熒光檢測，具有信號強、特異性高、靈敏度高、檢測濃度范圍廣等優(yōu)點，有利于推廣應用。

本發(fā)明的技術方案通過兩條包含互補片段的特殊dna鏈構建銀納米簇熒光探針，再利用兩條dna互補時，dna2中富含g堿基的片段靠近銀納米簇，dna1/dna2-agncs熒光探針的熒光得到增強，當加入aβ1-40oligomer，這兩條dna鏈的適配體分割片段splita和splitb分別與aβ1-40oligomer特異性結合，形成復合物結構，從而使得dna2包含的g堿基的片段將遠離銀納米簇合成位點，導致dna1/dna2-agncs熒光探針熒光發(fā)生猝滅的原理，實現(xiàn)了aβ1-40oligomer特異性熒光檢測，具有檢測下限低，檢測范圍廣的特點，檢出下限可達到2nm，并且在20nm～100nm范圍之間，反應體系熒光強度隨著濃度的增加呈線性減弱，檢測范圍相對傳統(tǒng)的方法較寬。

本發(fā)明的技術方案銀納米簇熒光探針通過dna核酸序列來穩(wěn)定銀納米粒子，其穩(wěn)定性好，具有穩(wěn)定信號，且納米簇的尺寸小，耐環(huán)境影響力強；并且應用核酸適體的高選擇性和特異性的特點可以有效改善現(xiàn)有技術靈敏度低和檢測限的問題。

本發(fā)明的將阿爾茲海默癥標志物aβ1-40oligomer的適配體分成兩段，可以有效靈敏地結合阿爾茲海默癥標志物aβ1-40oligomer，形成復合物結構后，dna2序列中富含g堿基片段與銀納米簇的距離被拉大來引起熒光信號變化以實現(xiàn)對目標物的超靈敏檢測。

本發(fā)明的技術方案利用銀納米簇熒光探針對阿爾茲海默癥標志物aβ1-40oligomer的檢測，具有快速、高效，準確的特點，僅需2min作用即可達到穩(wěn)定的檢測，檢測的結果準確性高。

本發(fā)明的技術方案通過熒光信號變化的方法檢測阿爾茲海默癥標志物，性質更穩(wěn)定，操作更為簡便，有利于推廣應用。

附圖說明

【圖1】為通過熒光信號變化的方法檢測阿爾茲海默癥標志物的實驗方法的示意圖；

【圖2】為dna合成銀納米簇的激發(fā)和發(fā)射圖譜；

【圖3】為對目標物和干擾物做的特異性檢測圖；

【圖4】為在一定濃度范圍內檢測阿爾茲海默癥標志物aβ1-40oligomer含量的熒光圖。

【圖5】為一定濃度范圍內檢測阿爾茲海默癥標志物aβ1-40oligomer含量的線性關系圖。

具體實施方式

以下實施例旨在進一步說明本發(fā)明內容，而不是限制本發(fā)明權利要求的保護范圍。

實施例1

銀納米簇的制備方法，步驟如下：

取23μl的dna1(100μm)與112μl磷酸緩沖液(20mm，ph7.0)混勻，加入9.2μlagno3水溶液(1.5mm)室溫下震蕩混勻15min，然后加入9.2μl新鮮配制的nabh4(1.5mm)迅速混勻并移入25℃恒溫水浴鍋中反應2h，即可檢測其熒光。

dna1與dna2反應步驟如下：

取23μldna2(100μm)與銀納米簇溶液混勻反應1h，即可檢測其熒光信號。

aβ1-40oligomer的檢測步驟如下：

向已經反應好了的dna2與銀納米簇溶液中加入不同濃度的aβ1-40oligomer，反應2min后檢測其熒光信號。

特異性檢測步驟如下：

分別向已經反應好了的dna2與銀納米簇溶液中加入不同阿爾茲海默癥標志物aβ40-o(aβ1-40oligomer)、aβ42-o(aβ1-42oligomer)、aβ40-m(aβ1-40monomer)、aβ42-m(aβ1-42monomer)，5min后檢測熒光信號，最終檢測濃度為60nm。

建立坐標曲線步驟如下：

用磷酸緩沖液(20mm，ph7.0)配置不同濃度的aβ1-40oligomer溶液，每個溶液取相同體積加入到dna1/dna2-agncs熒光探針溶液中，5min后檢測其熒光信號，重復5組實驗，用origin軟件做出線性擬合曲線圖。

待測溶液檢測步驟如下：

用腦脊液配置不同濃度的aβ1-40oligomer溶液，每個溶液取相同體積加入到dna1/dna2-agncs熒光探針溶液中，5min后檢測其熒光信號。

從圖2可以看出a為銀納米簇的激發(fā)圖譜，激發(fā)波長在570nm處；b為發(fā)射圖譜，發(fā)射波長在636nm處；

從圖3可以看出適配體只對阿爾茲海默癥標志物aβ1-40oligomer有特異性結合，實驗干擾?。?/p>

從圖4可以看出熒光信號隨著aβ1-40oligomer濃度增大而減小。

從圖5可以看出在一定的濃度范圍內aβ1-40oligomer與其所對應的響應信號有一定的線性關系。