本發(fā)明涉及一種測(cè)定孕婦igg抗-a和抗-b血型抗體或人血型反定型的免疫層析試紙條，可用于測(cè)定孕婦產(chǎn)前igg抗-a和抗-b抗體及效價(jià)的測(cè)定，預(yù)測(cè)新生兒溶血??；也可用于鑒定個(gè)體血型的反定型，屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

眾多發(fā)明專利采用免疫層析試紙條技術(shù)建立特定的檢測(cè)方法，它們的技術(shù)基本相同，不同的是，或檢測(cè)對(duì)象不同，或檢測(cè)目的不同。

數(shù)個(gè)發(fā)明專利或?qū)嵱眯滦蛯＠?，包括被駁回或未授權(quán)的專利申請(qǐng)資料，均闡述采用免疫層析試紙條技術(shù)測(cè)定人血型的反定型，但這些專利申報(bào)至今并無相應(yīng)的產(chǎn)品出現(xiàn)，原因是實(shí)踐和理論上都存在技術(shù)缺陷或障礙，這些專利陳述用于檢測(cè)血型抗體的抗原，為紅細(xì)胞或紅細(xì)胞膜提取物或紅細(xì)胞溶血溶液等，事實(shí)上，其一，這些物質(zhì)很難穩(wěn)定、均勻地固定在纖維素膜上，其二，也是最關(guān)鍵的一點(diǎn)，紅細(xì)胞血型抗原有200多種，采用免疫層析檢測(cè)時(shí)根本無法保證特異性檢測(cè)抗-a和抗-b來鑒定abo血型的反定型。

目前反定型常用的凝集法之所以可以檢測(cè)抗-a和抗-b抗體，是因?yàn)橐话闳搜褐兄挥锌?a和抗-b抗體能在鹽水中凝集紅細(xì)胞，但當(dāng)采用免疫層析法檢測(cè)時(shí)，樣本中的任何抗體都可以與固定在膜上的或示蹤物上的紅細(xì)胞物質(zhì)上的相應(yīng)抗原結(jié)合。

因此過往專利闡述的人血型反定型方法，并不能制備出免疫層析試紙條產(chǎn)品用于檢測(cè)abo血型抗體，特別是無法保證準(zhǔn)確率。

即便是新近有申請(qǐng)陳述使用人工合成的血型a抗原和b抗原，同樣在理論上和實(shí)踐中都是行不通的，因?yàn)閍抗原和b抗原的化學(xué)本質(zhì)為多糖，其無法包被在纖維素膜上，也不能直接偶聯(lián)蛋白或多肽。

孕婦產(chǎn)前血清免疫性即igg抗-a、抗-b抗體及效價(jià)的測(cè)定是預(yù)測(cè)abo血型新生兒溶血病的產(chǎn)前常規(guī)檢測(cè)項(xiàng)目，觀察效價(jià)的變化，可為下一步醫(yī)療行為和決策提供依據(jù)。目前世界范圍內(nèi)包括我國(guó)，產(chǎn)前igg抗-a、抗-b抗體的測(cè)定，均是采用抗人球蛋白試驗(yàn)測(cè)定法，基本流程為：先將被檢樣本血清或血漿與一定量的二巰基乙醇(2-me)或二硫蘇糖醇(dtt)等在37℃孵育1～2小時(shí)左右并不時(shí)搖動(dòng)以滅活igm抗體，然后取出混合物倍比稀釋，接著將每管稀釋液分別與制備好的3～5％的a型和b型紅細(xì)胞在37℃孵育0.5～1小時(shí)使igg抗-b或抗-a與紅細(xì)胞結(jié)合，取出每個(gè)反應(yīng)管用生理鹽水洗滌紅細(xì)胞3遍，然后加入抗人球蛋白抗體(二抗)混合離心，最后用顯微鏡觀察凝集判讀結(jié)果。由于測(cè)定過程過于復(fù)雜，目前大多醫(yī)院均采用微柱凝膠卡方法，可以省略紅細(xì)胞洗滌和顯微鏡判讀結(jié)果的步驟，但整個(gè)過程依然耗時(shí)長(zhǎng)、步驟繁瑣、費(fèi)用高。

申請(qǐng)人從事血型研究20多年，一直認(rèn)為臨床實(shí)驗(yàn)室孕婦產(chǎn)前血清igg抗-a、抗-b抗體效價(jià)的測(cè)定，耗費(fèi)了常規(guī)崗位工作人員過多的時(shí)間和精力，且差錯(cuò)或失準(zhǔn)時(shí)常發(fā)生，因此傳統(tǒng)的測(cè)定方法亟待改進(jìn)或被替代。

免疫層析試紙條技術(shù)廣泛用于各種抗原、抗體的檢測(cè)，經(jīng)過反復(fù)構(gòu)思和驗(yàn)證，本專利克服多方面的技術(shù)障礙，成功用免疫層析試紙條技術(shù)測(cè)定孕婦產(chǎn)前免疫性igg抗-a和抗-b抗體效價(jià)和人血型反定型。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服上述不足之處，提供一種測(cè)定孕婦igg抗-a和抗-b血型抗體和人血型反定型的免疫層析試紙條。

按照本發(fā)明提供的技術(shù)方案，測(cè)定孕婦igg抗-a和抗-b血型抗體或人血型反定型的免疫層析試紙條，包括樣品墊、示蹤墊、纖維素膜、阻滯區(qū)、檢測(cè)區(qū)、質(zhì)控區(qū)、吸水墊和支撐板；所述支撐板位于底部，支撐板上設(shè)置纖維素膜，纖維素膜兩端分別搭接示蹤墊和吸水墊；所述示蹤墊另一端搭接樣品墊；

所述樣品墊上滴加待測(cè)樣本，示蹤墊上包被示蹤物；所述纖維素膜上依次設(shè)有阻滯區(qū)、檢測(cè)區(qū)和質(zhì)控區(qū)；

當(dāng)用于測(cè)定孕婦igg抗-a和抗-b血型抗體時(shí)，所述阻滯區(qū)上包被人igm特異性結(jié)合物；所述檢測(cè)區(qū)上包被血型a抗原偶合物、b抗原偶合物、抗人igg、蛋白a、蛋白g、人igg特異性結(jié)合物或示蹤物的反應(yīng)物中的一種或多種；

當(dāng)用于測(cè)定人血型反定型時(shí)，所述阻滯區(qū)上包被物質(zhì)為人igg特異性結(jié)合物；所述檢測(cè)區(qū)上包被血型a抗原偶合物、b抗原偶合物、抗人igm、人igm特異性結(jié)合物或示蹤物的反應(yīng)物中的一種或多種。

所述阻滯區(qū)的包被方式為做1～1000條包被物的劃線、分散涂層或浸泡包被物后干燥。

所述在同1條膜上，檢測(cè)區(qū)可設(shè)置1條至100條抗-a檢測(cè)線、1條至100條抗-b檢測(cè)線，或同時(shí)設(shè)置1條至100條抗-a檢測(cè)線和1條至100條抗-b檢測(cè)線。

所述阻滯區(qū)可設(shè)置或不設(shè)置；當(dāng)不設(shè)置時(shí)，可檢測(cè)igm與igg混合抗-a和抗-b抗體，為實(shí)現(xiàn)特異性測(cè)定孕婦igg抗-a和抗-b抗體的目的，需要預(yù)先采用傳統(tǒng)化學(xué)方法滅活igm抗體，然后測(cè)定處理后的樣本。

當(dāng)設(shè)置多條抗-a檢測(cè)線或多條抗-b檢測(cè)線時(shí)，樣本無需預(yù)先稀釋或低滴度稀釋后即可直接測(cè)定抗-a或抗-b抗體的效價(jià)，并根據(jù)預(yù)先的設(shè)定和陽性條帶的數(shù)目判讀結(jié)果；當(dāng)設(shè)置1條抗-a檢測(cè)線或1條抗-b檢測(cè)線時(shí)，首先測(cè)定預(yù)先稀釋好的樣本，然后根據(jù)不同稀釋度樣本的檢測(cè)結(jié)果判讀抗-a或抗-b抗體的效價(jià)；抗-a和抗-b抗體的檢測(cè)線能夠同時(shí)設(shè)置在同一條膜上，或單獨(dú)設(shè)置在不同的膜上；在同一條膜上的檢測(cè)區(qū)除設(shè)置抗-a和抗-b檢測(cè)線外，也能夠同時(shí)設(shè)置如乙肝表面抗原或多個(gè)其它抗原或抗體的檢測(cè)線。

所述質(zhì)控區(qū)包埋能與示蹤物結(jié)合的抗體或凝集素或蛋白。

所述檢測(cè)區(qū)和質(zhì)控區(qū)可同時(shí)設(shè)置，當(dāng)同一條膜上有多條檢測(cè)線時(shí)，質(zhì)控區(qū)可設(shè)立也可以不設(shè)立。

所述示蹤墊上結(jié)合有示蹤物；所述示蹤物包括示蹤粒子和示蹤粒子結(jié)合物，示蹤粒子結(jié)合物是血型a抗原偶合物、血型b抗原偶合物、人igm的特異性結(jié)合物、或人igg的特異性結(jié)合物中的一種或多種。

所述a抗原偶合物或b抗原偶合物，為人工合成的帶有修飾基團(tuán)的a抗原修飾物或b抗原修飾物通過合成酶法或化學(xué)合成法偶聯(lián)物后制備出來的，具有可以固定或包被在纖維素膜上或標(biāo)記示蹤粒子的特性，同時(shí)a抗原偶合物具有與人抗-a抗體結(jié)合的特性，b抗原偶合物具有與人抗-b抗體結(jié)合的特性，所述a抗原修飾物或b抗原修飾物為帶有修飾基團(tuán)的單糖、二糖、三糖、四糖、五塘、六糖或多糖鏈，修飾基團(tuán)是在人工合成a抗原糖鏈或b抗原糖鏈時(shí)連接上去的，或先合成a抗原糖鏈或b抗原糖鏈后再通過生物酶或化學(xué)修飾連接修飾基團(tuán)，人工合成可以手工方法為主完成，也可以通過多糖合成儀完成或協(xié)助完成，所得到的a抗原修飾物具有人血型a抗原特性或部分特性，b抗原修飾物具有b抗原的特性或部分特性，所述修飾基團(tuán)為氨基、羧基、巰基、羥基、胺和烴基中的一個(gè)或多個(gè)，所述偶合物為牛血清白蛋白(bsa)、卵清蛋白(ova)、乙?；椎鞍?、蛋白質(zhì)或多肽中的一種或多種；

a抗原偶合物或b抗原偶合物的合成，也可以通過構(gòu)建單元策略或固相合成法合成糖蛋白的方式實(shí)現(xiàn)，先對(duì)bsa或ova或蛋白質(zhì)或多肽中的某個(gè)或多個(gè)氨基酸進(jìn)行糖基化，然后再逐個(gè)連接單糖合成具有a抗原或b抗原特性的糖鏈，或直接連接具有a抗原或b抗原特性的糖鏈，制備出具有a抗原和b抗原特性或部分特性的糖蛋白，即可等同于所述a抗原偶合物或b抗原偶合物一樣使用；

a抗原偶合物或b抗原偶合物也可以委托它方實(shí)驗(yàn)室合成，也可以委托它方實(shí)驗(yàn)室合成a抗原修飾物或b抗原修飾物，然后自行偶聯(lián)偶合物的方式制備；所述免疫層析試紙條用于特異性測(cè)定人血液中的igg類抗體，和特異性測(cè)定抗-a和抗-b抗體；

當(dāng)免疫層析試紙條用于測(cè)定人血型反定型時(shí)，具體通過使用高純度的單一的血型a抗原偶合物和血型b抗原偶合物特異性測(cè)定抗-a和抗-b抗體實(shí)現(xiàn)；具體通過下列3種方式中的一種或多種來實(shí)現(xiàn)的；

a、在纖維素膜上設(shè)置igm阻滯區(qū)阻止igm繼續(xù)層析或延緩繼續(xù)層析；

b、使用特異性人igg抗體的反應(yīng)物標(biāo)記上示蹤粒子，使示蹤物只與樣本中的待檢igg類抗體結(jié)合，并在檢測(cè)區(qū)顯現(xiàn)出陽性反應(yīng)；

或c、在igg檢測(cè)區(qū)包被只與人igg特異性結(jié)合的反應(yīng)物。

所述測(cè)定孕婦igg抗-a和抗-b血型抗體或人血型反定型的免疫層析試紙條的檢測(cè)方法，具體步驟為：樣本為血清或血漿，或?yàn)榘刺囟ㄐr(jià)或稀釋度稀釋后的稀釋液，或上述樣本進(jìn)行了igm抗體滅活處理后的處理液，或稀釋液進(jìn)行了igm抗體滅活后的溶液，每次檢測(cè)的加樣量為1μl至1000μl，根據(jù)結(jié)果的陰性或陽性以及樣本的稀釋度可判讀igg、igm、igm與igg混合抗-a和抗-b抗體的有無、效價(jià)或人abo血型的反定型，當(dāng)樣本為全血或手指血時(shí)，試紙條組裝樣品墊使用全血樣本墊，當(dāng)樣本為血清或血漿時(shí)，使用血清樣本墊。

本發(fā)明將免疫層析試紙技術(shù)應(yīng)用于孕婦產(chǎn)前免疫性血型抗體的測(cè)定、利用免疫阻滯原理聯(lián)合特異性結(jié)合作用替代傳統(tǒng)的化學(xué)滅活igm的方式實(shí)現(xiàn)特異性測(cè)定igg、使用高純度的a抗原偶合物或b抗原偶合物實(shí)現(xiàn)特異性測(cè)定抗-a和抗-b抗體以及設(shè)計(jì)血型抗原糖鏈修飾然后偶合蛋白或多肽的方案實(shí)現(xiàn)人工合成多糖abo血型抗原能在纖維素膜上穩(wěn)定包被或標(biāo)記示蹤粒子，真正實(shí)現(xiàn)了采用免疫層析試紙技術(shù)測(cè)定血型抗體，可用于測(cè)定孕婦產(chǎn)前igg抗-a和抗-b抗體效價(jià)或鑒定個(gè)體abo血型的反定型等。

本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明成功實(shí)現(xiàn)采用免疫層析試紙條技術(shù)特異測(cè)定孕婦產(chǎn)前免疫性igg抗-a和抗-b抗體和效價(jià)，國(guó)內(nèi)外未見，替代傳統(tǒng)抗人球方法的顯著效果至少包括：

1)傳統(tǒng)方法整個(gè)過程耗時(shí)4小時(shí)左右，本法只需要十?dāng)?shù)分鐘；

2)傳統(tǒng)方法操作步驟繁瑣，本法只需要2～3步，大大簡(jiǎn)化了操作流程；

3)本方法使檢測(cè)成本降低；

4)傳統(tǒng)方法抗-a和抗-b抗體必須分開測(cè)定，本法2種抗體可一步同時(shí)完成測(cè)定；

5)傳統(tǒng)方法滅活igm抗體耗時(shí)長(zhǎng)且使用有毒或有臭味的化學(xué)物質(zhì)，本申請(qǐng)利用免疫阻滯作用，結(jié)合igg分子量遠(yuǎn)小于igm的特性和使用人igg特異性示蹤物的方式，實(shí)現(xiàn)特異性測(cè)定igg的目的，簡(jiǎn)單快速無污染；

6)本法使用a抗原偶合物或b抗原偶合物捕獲抗-a或抗-b抗體，其具有高親和力，大大提高了檢測(cè)的靈敏度，使產(chǎn)品可用于測(cè)定被高度稀釋后的樣本，即實(shí)現(xiàn)測(cè)定樣本的抗體效價(jià)，靈敏度與傳統(tǒng)方法相近，但結(jié)果判讀更直觀。

相比以往血型反定型或抗體測(cè)定的專利資料，本法真正實(shí)現(xiàn)可制造用于特異性血型抗體測(cè)定的產(chǎn)品：

1)以往專利使用紅細(xì)胞膜提取物或人工合成血型抗原作為檢測(cè)抗體的物質(zhì)，事實(shí)上無法保證免疫層析實(shí)驗(yàn)中特異性檢測(cè)抗-a和抗-b抗體或包被nc膜或標(biāo)記示蹤粒子，因此是不能制備出相應(yīng)的產(chǎn)品；

2)本發(fā)明不直接使用人工合成a和b抗原，而是采取合成a抗原修飾物和b抗原修飾物后，利用修飾基團(tuán)制備出a抗原偶合物和b抗原偶合物，使其具備可包被性能或可標(biāo)記性能，實(shí)現(xiàn)可制備試紙條產(chǎn)品檢測(cè)抗-a和抗-b抗體或測(cè)定血型反定型；

3)a抗原偶合物和b抗原偶合物具有高純度，檢測(cè)時(shí)不受樣本中其它血型抗體非特異性結(jié)合的影響，實(shí)現(xiàn)特異性測(cè)定抗-a和抗-b抗體；

4)本法測(cè)定血型反定型時(shí)，增加igg抗體阻滯區(qū)，通過測(cè)定igm抗-a和抗-b抗體來判讀個(gè)體的反定型，從而與經(jīng)典abo血型反定型方法一致，排除了igg抗體的干擾，結(jié)果正確率大大提高。

附圖說明

圖1是本發(fā)明結(jié)構(gòu)示意圖。

附圖標(biāo)記說明：1、樣品墊；2、示蹤墊；3、纖維素膜；4、阻滯區(qū)；5、檢測(cè)區(qū)；6、質(zhì)控區(qū)；7、吸水墊；8、支撐板。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1測(cè)定孕婦igg抗-a和抗-b血型抗體或人血型反定型的免疫層析試紙條

包括樣品墊1、示蹤墊2、纖維素膜3、阻滯區(qū)4、檢測(cè)區(qū)5、質(zhì)控區(qū)6、吸水墊7和支撐板8；所述支撐板8位于底部，支撐板8上黏有纖維素膜3，纖維素膜3兩端分別搭接示蹤墊2和吸水墊7；所述示蹤墊2另一端搭接樣品墊1；

所述樣品墊1上滴加待測(cè)樣本，示蹤墊2上包被示蹤物；所述纖維素膜3上依次設(shè)有阻滯區(qū)4、檢測(cè)區(qū)5和質(zhì)控區(qū)6；

所述阻滯區(qū)4上包被人igm特異性結(jié)合物；所述檢測(cè)區(qū)5上包被血型a抗原偶合物、b抗原偶合物、抗人igg、蛋白a、蛋白g、人igg特異性結(jié)合物或示蹤物的反應(yīng)物中的一種或多種；

所述阻滯區(qū)4的包被方式為做1～1000條包被物的劃線、分散涂層或浸泡包被物后干燥；

所述igm阻滯區(qū)4可設(shè)置或不設(shè)置；當(dāng)不設(shè)置時(shí)，可檢測(cè)igm與igg混合抗-a和抗-b抗體，為實(shí)現(xiàn)特異性測(cè)定孕婦igg抗-a和抗-b抗體的目的，需要預(yù)先采用傳統(tǒng)化學(xué)方法結(jié)合特定溫度孵育的方式滅活igm抗體，然后測(cè)定處理后的樣本；

所述在同1條膜上，檢測(cè)區(qū)5可設(shè)置1條至100條抗-a檢測(cè)線、1條至100條抗-b檢測(cè)線，或同時(shí)設(shè)置1條至100條抗-a檢測(cè)線和1條至100條抗-b檢測(cè)線；

所述檢測(cè)區(qū)5包埋血型a抗原偶合物、b抗原偶合物、抗人igg、蛋白a、蛋白g、人igg特異性結(jié)合物或示蹤物的反應(yīng)物中的一種或多種；在同1條膜上，igg檢測(cè)區(qū)5可設(shè)置1條至100條抗-a檢測(cè)線、1條至100條抗-b檢測(cè)線，或同時(shí)設(shè)置1條至100條抗-a檢測(cè)線和1條至100條抗-b檢測(cè)線；

當(dāng)設(shè)置多條抗-a檢測(cè)線或多條抗-b檢測(cè)線時(shí)，樣本無需預(yù)先稀釋或低滴度稀釋后即可直接測(cè)定抗-a或抗-b抗體的效價(jià)，當(dāng)設(shè)置1條抗-a檢測(cè)線或1條抗-b檢測(cè)線時(shí)，可測(cè)定預(yù)先稀釋好的樣本然后根據(jù)不同稀釋度樣本的檢測(cè)結(jié)果判讀抗-a或抗-b抗體的效價(jià)，抗-a和抗-b抗體的檢測(cè)線可以同時(shí)設(shè)置在同一條膜上，也可以單獨(dú)設(shè)置在不同的膜上，在同一條膜上的igg檢測(cè)區(qū)5除設(shè)置抗-a和抗-b檢測(cè)線外，也可增加檢測(cè)如乙肝表面抗原或多個(gè)其它抗原或抗體的檢測(cè)線；

所述質(zhì)控區(qū)6包埋能與示蹤物結(jié)合的抗體或凝集素或蛋白。

實(shí)施例2人血型反定型的免疫層析試紙條

結(jié)構(gòu)同實(shí)施例1，當(dāng)用于測(cè)定人血型反定型時(shí)，所述阻滯區(qū)4上包被物質(zhì)為人igg特異性結(jié)合物；所述檢測(cè)區(qū)5上包被血型a抗原偶合物、b抗原偶合物、抗人igm、人igm特異性結(jié)合物或示蹤物的反應(yīng)物中的一種或多種；

當(dāng)阻滯區(qū)上包被抗-人igg抗體或蛋白a或蛋白g或人igg特異性結(jié)合物中的一種或多種時(shí)，同時(shí)使用人igm抗體的特異性反應(yīng)物標(biāo)記示蹤粒子，此時(shí)可特異性測(cè)定igm抗-a和抗-b抗體；

igg檢測(cè)區(qū)5和質(zhì)控區(qū)6可同時(shí)設(shè)置，當(dāng)同一條膜上有1條或多條檢測(cè)線時(shí)，質(zhì)控區(qū)可設(shè)立也可以不設(shè)立；

所述a抗原偶合物或b抗原偶合物，為人工合成的帶有修飾基團(tuán)的a抗原修飾物或b抗原修飾物偶聯(lián)偶聯(lián)物后制備出來的，具有可以固定或包被在纖維素膜上或標(biāo)記示蹤粒子的特性，同時(shí)a抗原偶合物具有與人抗-a抗體結(jié)合的特性，b抗原偶合物具有與人抗-b抗體結(jié)合的特性，所述修飾基團(tuán)為氨基、羧基、巰基、羥基、胺和烴基中的一個(gè)或多個(gè)，所述偶合物為牛血清白蛋白(bsa)、卵清蛋白(ova)、乙?；椎鞍?、蛋白質(zhì)或多肽中的一種或多種。

實(shí)施例3一種測(cè)定孕婦血清或血漿igg抗-a和抗-b抗體效價(jià)的免疫層析試紙條方法(蛋白a金標(biāo)法)，主要步驟如下：

1、樣品墊1選用血清樣品墊；

2、示蹤物和示蹤墊2的制作：示蹤物包括示蹤粒子和示蹤粒子結(jié)合物，示蹤粒子選用膠體金，示蹤粒子結(jié)合物為蛋白a，將膠體金標(biāo)記蛋白a后即為示蹤物，然后將示蹤物分散吸附于玻璃纖維墊凍干即示蹤墊2；

3、a抗原修飾物和b抗原修飾物的制備：采用固相合成法，連接臂選用氨基，載體選擇樹脂，將一個(gè)全保護(hù)的糖基供體(供體帶有一個(gè)離去基)在活化劑的作用下與含有一個(gè)游離羥基的連接臂偶聯(lián)，然后使偶聯(lián)的糖基供體脫保護(hù)，再偶聯(lián)第二個(gè)糖基供體，如此反復(fù)，從還原端向非還原端合成，直至合成三塘鏈或多糖鏈，本實(shí)施例合成六糖鏈，a抗原由n-乙酰-d-半乳糖胺和d-半乳糖和l-巖藻糖和n-乙酰-d-葡萄糖胺和d-半乳糖和n-乙酰-d-葡萄糖胺組成，b抗原由d-半乳糖和l-巖藻糖和d-半乳糖和n-乙酰-d-葡萄糖胺和d-半乳糖和n-乙酰-d-葡萄糖胺組成，最后切斷樹脂，保留連接臂；

4、偶合物包括a抗原偶合物和b抗原偶合物的制備：采用戊二醛法，偶聯(lián)物選擇牛血清白蛋白(bsa)或高品質(zhì)卵清蛋白(ova)，本實(shí)施例選擇bsa，將a抗原修飾物和b抗原修飾物分別與bsa混合于磷酸鹽緩沖液pbs中，緩慢滴加1％戊二醛，置振蕩器中輕微振蕩數(shù)小時(shí)，然后透析去掉游離多余的戊二醛；

5、纖維素膜阻滯區(qū)4和檢測(cè)區(qū)5和質(zhì)控區(qū)6的制備：纖維素膜選用硝酸纖維素膜，依次劃分阻滯區(qū)、檢測(cè)區(qū)和質(zhì)控區(qū)，在阻滯區(qū)包埋抗人μ鏈單克隆抗體，在膜上劃線2條；在檢測(cè)區(qū)同樣劃線2條，分別包被a抗原偶合物和b抗原偶合物；質(zhì)控區(qū)劃線1條，包埋抗蛋白a抗體；

6、試紙條的組裝：按附圖組裝，然后將2個(gè)或多個(gè)組裝好的試紙條同向并排扣合在1個(gè)組裝盒里；

7、加樣檢測(cè)：將孕婦血清或血漿用生理鹽水稀釋成1∶64、1∶128、1∶256、1∶512和1∶1024，分別加樣在5個(gè)試紙條的樣品墊上；

8、結(jié)果判讀：待質(zhì)控區(qū)出現(xiàn)可見條帶時(shí)，a抗原偶合物和b抗原偶合物檢測(cè)線陽性結(jié)果的最高稀釋度為所測(cè)樣本抗-a或抗-b的效價(jià)。

實(shí)施例4一種測(cè)定孕婦血清或血漿igg抗-a和抗-b抗體效價(jià)的免疫層析試紙條方法(抗人igg單抗金標(biāo)法)，主要步驟如下：

1、樣品墊1選用血清樣品墊；

2、示蹤物和示蹤墊2的制作：示蹤物包括示蹤粒子和示蹤粒子結(jié)合物，示蹤粒子選用膠體金，示蹤粒子結(jié)合物為鼠抗人igg單抗，將膠體金標(biāo)記鼠抗人igg后即為示蹤物，然后將示蹤物分散吸附于玻璃纖維墊凍干即示蹤墊2；

3、a抗原修飾物和b抗原修飾物的制備：同實(shí)施例3；

4、偶合物包括a抗原偶合物和b抗原偶合物的制備：同實(shí)施例3；

5、纖維素膜阻滯區(qū)4、檢測(cè)區(qū)5和質(zhì)控區(qū)6的制備：纖維素膜選用硝酸纖維素膜，依次設(shè)置阻滯區(qū)和檢測(cè)區(qū)和質(zhì)控區(qū)，在阻滯區(qū)包埋抗人μ鏈單克隆抗體，在膜上劃線2條；在檢測(cè)區(qū)同樣劃線2條，分別包被a抗原偶合物和b抗原偶合物；質(zhì)控區(qū)劃線1條，包埋兔抗鼠免疫球蛋白血清；

6、試紙條的組裝：按附圖組裝；

7、加樣檢測(cè)：將孕婦血清或血漿用生理鹽水或pbs稀釋成1∶64、1∶128、1∶256、1∶512和1∶1024，分別加樣在5個(gè)試紙條的樣品墊上；

8、結(jié)果判讀：待質(zhì)控區(qū)出現(xiàn)可見條帶時(shí)，a抗原偶合物和b抗原偶合物檢測(cè)線陽性結(jié)果的最高稀釋度為所測(cè)樣本抗-a或抗-b的效價(jià)。

實(shí)施例5一種使用手指血測(cè)定abo血型反定型的免疫層析試紙條方法，主要步驟如下：

1、樣本墊1選用全血樣本墊；

2、示蹤物和示蹤墊2的制作：示蹤物包括示蹤粒子和示蹤粒子結(jié)合物，示蹤粒子選用膠體金，示蹤粒子結(jié)合物為鼠抗人igm抗體以及鼠抗人igg抗體，將膠體金標(biāo)記示蹤粒子結(jié)合物后即為示蹤物，將示蹤物分散吸附于玻璃纖維墊凍干即示蹤墊；

3、a抗原修飾物和b抗原修飾物的制備：同實(shí)施例3；

4、偶合物包括a抗原偶合物和b抗原偶合物的制備：同實(shí)施例3；

5、纖維素膜阻滯區(qū)4、檢測(cè)區(qū)5和質(zhì)控區(qū)6的制備：纖維素膜選用硝酸纖維素膜，不設(shè)置阻滯區(qū)，在檢測(cè)區(qū)設(shè)檢測(cè)線2條，分別包埋b抗原偶合物和a抗原偶合物，質(zhì)控區(qū)設(shè)質(zhì)控線1條，包埋兔抗鼠免疫球蛋白血清；

6、試紙條的組裝：按附圖組裝；

7、加樣檢測(cè)：加手指血1滴或50微升，直接加樣在樣品墊上；

8、結(jié)果：待質(zhì)控區(qū)出現(xiàn)可見條帶時(shí)，b抗原偶合物檢測(cè)線陽性和a抗原偶合物檢測(cè)陰性時(shí)為a型，反之為b型，均陽性為o型，均陰性為ab型。

實(shí)施例6：一種測(cè)定孕婦血清或血漿igg抗-a和抗-b抗體效價(jià)的免疫層析試紙條方法(蛋白a包被法)，主要步驟如下：

1、該例須抗-a和抗-b抗體分開在不同的試紙條上檢測(cè)，樣品墊1均選用血清樣品墊；

2、a抗原修飾物和b抗原修飾物的制備：同實(shí)施例3；

3、偶合物包括a抗原偶合物和b抗原偶合物的制備：同實(shí)施例3；

4、示蹤物和示蹤墊2的制作：示蹤物包括示蹤粒子和示蹤粒子結(jié)合物，示蹤粒子選用膠體金，檢測(cè)抗-a的試紙條，示蹤粒子結(jié)合物為a抗原偶合物，檢測(cè)抗-b的試紙條，示蹤粒子結(jié)合物為b抗原偶合物，分別將膠體金標(biāo)記a抗原偶合物或b抗原偶合物后即為示蹤物，然后將示蹤物分散吸附于玻璃纖維墊凍干即示蹤墊；

5、纖維素膜阻滯區(qū)4、檢測(cè)區(qū)5和質(zhì)控區(qū)6的制備：纖維素膜選用硝酸纖維素膜，不設(shè)立阻滯區(qū)，只設(shè)立檢測(cè)區(qū)和質(zhì)控區(qū)，檢測(cè)抗-a的試紙條，在檢測(cè)區(qū)設(shè)置檢測(cè)線1條，包被蛋白a；質(zhì)控區(qū)劃線1條，包埋抗bsa抗體。檢測(cè)抗-b的試紙條，在纖維素膜設(shè)立檢測(cè)區(qū)和質(zhì)控區(qū)，所有包被物均與檢測(cè)抗-a的試紙條相同；

6、示蹤墊上的示蹤物和igg檢測(cè)區(qū)包被的蛋白a使用濃度的調(diào)整，將購(gòu)買的或本實(shí)驗(yàn)室制備的示蹤物和蛋白a分別按1∶1、1∶2、1∶4等倍比稀釋，并分別制備不同的示蹤墊和包被不同的檢測(cè)區(qū)，組裝成不同的試紙條，取采用傳統(tǒng)方法測(cè)定好效價(jià)為1∶64、1∶128、1∶256、1∶512和1∶1024等的樣本，然后按效價(jià)稀釋成不同稀釋度的稀釋液，在不同的試紙條上加樣檢測(cè)，直至獲得結(jié)果與傳統(tǒng)方法相同，即選用該濃度的示蹤物和蛋白a制備試紙條；

7、試紙條的組裝：檢測(cè)抗-a和檢測(cè)抗-b的試紙條均按附圖組裝；

8、加樣檢測(cè)：將孕婦血清或血漿用生理鹽水或pbs稀釋成1∶64、1∶128、1∶256、1∶512和1∶1024，分別加樣在5個(gè)檢測(cè)抗-a的試紙條和5個(gè)檢測(cè)抗-b的試紙條的樣品墊上；

9、結(jié)果判讀：待試紙條的質(zhì)控區(qū)出現(xiàn)可見條帶時(shí)，檢測(cè)抗-a的試紙條檢測(cè)線陽性結(jié)果的最高稀釋度為所測(cè)樣本抗-a的效價(jià)，檢測(cè)抗-b的試紙條檢測(cè)線陽性結(jié)果的最高稀釋度為所測(cè)樣本抗-b的效價(jià)。

實(shí)施例7：一種測(cè)定孕婦血清或血漿igg抗-a和抗-b抗體效價(jià)的免疫層析試紙條方法(抗人igg單抗金標(biāo)競(jìng)爭(zhēng)法)，主要步驟如下：

1、樣品墊1選用血清樣品墊；

2、示蹤物和示蹤墊2的制作：示蹤物包括示蹤粒子和示蹤粒子結(jié)合物，示蹤粒子選用膠體金，示蹤粒子結(jié)合物為鼠抗人igg單抗，將膠體金標(biāo)記鼠抗人igg后即為示蹤物，然后將示蹤物分散吸附于玻璃纖維墊凍干即示蹤墊2；

3、a抗原修飾物和b抗原修飾物的制備：同實(shí)施例3；

4、偶合物包括a抗原偶合物和b抗原偶合物的制備：同實(shí)施例3；

5、纖維素膜阻滯區(qū)4、檢測(cè)區(qū)5和質(zhì)控區(qū)6的制備：纖維素膜選用硝酸纖維素膜，不設(shè)置阻滯區(qū)；在檢測(cè)區(qū)同樣劃線2條，分別包被a抗原偶合物和b抗原偶合物；質(zhì)控區(qū)劃線1條，包埋兔抗鼠免疫球蛋白血清；

6、試紙條的組裝：按附圖組裝；

7、加樣檢測(cè)：將孕婦血清或血漿用生理鹽水或pbs稀釋成1∶64、1∶128、1∶256、1∶512和1∶1024，分別加樣在5個(gè)試紙條的樣品墊上；

8、結(jié)果判讀：待質(zhì)控區(qū)出現(xiàn)可見條帶時(shí)，a抗原偶合物和b抗原偶合物檢測(cè)線陽性結(jié)果的最高稀釋度為所測(cè)樣本抗-a或抗-b的效價(jià)。