本發(fā)明涉及生物殘留檢測技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種液相色譜測定孔雀石綠的方法。

背景技術(shù)：

孔雀石綠不僅是一種有毒而且可以致癌的三苯甲烷類化學(xué)物，而且是一種可以殺寄生蟲和殺菌的化學(xué)制劑。它可以快速治愈魚類的水霉病和原蟲病，同時(shí)可以有效控制魚類的三代蟲病、車輪蟲病、鰓霉病、指環(huán)蟲病、斜管蟲病、小瓜蟲病等細(xì)菌性疾病。由于市面上除孔雀石綠外，無其他化學(xué)制劑可以快速控制水霉病，加上孔雀石綠價(jià)格便宜、操作簡單、用量很小但功效特別大，所以被曾被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖卻屢禁不止。

19世紀(jì)末20世紀(jì)初，研究發(fā)現(xiàn)孔雀石綠有高度毒性、高殘留性等副作用。進(jìn)入水產(chǎn)品中會代謝成脂溶性的隱色孔雀石綠，當(dāng)孔雀石綠進(jìn)入人體時(shí)，會對人體有潛在的致癌、致畸、致突變的作用。在歐美等國家還有我國都禁止孔雀石綠用與食品動物，在水產(chǎn)品中不得檢出孔雀石綠殘留。在2002年，我國把孔雀石綠歸入《食品動物禁用獸藥及其化合物清單》。

當(dāng)前檢測水產(chǎn)品中孔雀石綠及其代謝物隱色孔雀石綠殘留量的方法主要有：分光光度法、薄層色譜法、高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用等。分光光度法雖然檢測較方便快捷但檢測限太高，靈敏度低并且準(zhǔn)確度較差。薄層色譜法也有檢測方便快捷的優(yōu)點(diǎn)但其無法檢測隱色孔雀石綠。而高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用雖然檢測限較低、靈敏度高且準(zhǔn)確度也高，但是操作過于繁瑣而且成本特別高，實(shí)用性太低。所以高效液相色譜法是檢測孔雀石綠的首選方法，因?yàn)樗某杀鞠鄬^低，且具有高效、高靈敏度的優(yōu)點(diǎn)。gb/t19857-2005中也將高效液相色譜法定為標(biāo)準(zhǔn)檢測方法。

高效液相色譜熒光法測定水產(chǎn)品中孔雀石綠的前處理包括取樣、提取、除雜、萃取轉(zhuǎn)移、洗脫五大步驟。

(1)取樣：將魚去皮鱗，取背脊肌肉部分。樣品不取魚腩等含高脂肪的部位，脂肪會影響提取、分離的效果。(2)提取:通常采用乙腈作為提取劑，提取過程中一般會加入硼氫化鉀溶液把孔雀石綠還原成無色孔雀石綠，加入鹽酸氫胺溶液來防止孔雀石綠的降解。(3)除雜：用酸性或中性氧化鋁來吸附樣品中的油脂。(4)萃取轉(zhuǎn)移：gb/t20361-2006中把二甘醇、硼氫化鉀加入上清液中振蕩，并繼續(xù)加入鹽酸羥胺溶液、對甲苯磺酸溶液乙酸銨緩沖液進(jìn)行提取離心，合并上清液并重復(fù)操作一次。往上清液加入二氯甲烷振搖，靜置分層后取下層有機(jī)相，上層溶液繼續(xù)用二氯甲烷和乙腈提取離心，離心后合并有機(jī)相旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，使孔雀石綠完全萃取于乙腈中。(5)洗脫：將prs柱安裝在固相萃取裝置上，上端連接酸性氧化鋁柱，用乙腈活化柱子后，將提取液過柱，移走酸性氧化鋁柱，吹干prs柱，用乙腈和乙酸銨溶液將孔雀石綠洗脫出來。國標(biāo)中水產(chǎn)品中孔雀石綠高效液相色譜熒光檢測法中條件為：色譜柱：ods-c18柱(250mm×4.6mm)、柱溫為35度；激發(fā)波長：265nm，發(fā)射波長360nm；流速為1.3ml/min，進(jìn)樣量為20μl；梁劍等的實(shí)驗(yàn)條件是：流速為1.0ml/min，進(jìn)樣量是100μl、其檢出限為0.6μg/kg。張宗祥等采用流速為1.0ml/min，進(jìn)樣量為10μl，其檢出限0.75μg/kg。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是：由于高效液相熒光法雖然具有靈敏度高、檢出限低、不需要昂貴的質(zhì)譜等特點(diǎn)，但其前處理步驟繁瑣，多次萃取合并，且要用到費(fèi)時(shí)費(fèi)力的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)步驟，大大降低了檢測效率，所以提供一種優(yōu)化后的液相色譜測定孔雀石綠的方法。

本發(fā)明解決其技術(shù)問題的解決方案是：一種液相色譜測定孔雀石綠的方法，包括以下步驟：

1)配制隱色孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)工作液；

2)樣品前處理；

3)將步驟2所收集的液體進(jìn)行高效液相色譜測定。

由于方法gb/t20361-2006高效液相色譜熒光法其前處理步驟繁瑣，多次萃取合并，且要用到費(fèi)時(shí)費(fèi)力的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)步驟，大大降低了檢測效率。所以要改良其前處理，來減化操作步驟，減少操作時(shí)間，增加檢測效率。

所述步驟2是在gb/t19857-2005的基礎(chǔ)上優(yōu)化而得，包括：

2-1)提取5g已搗碎樣品于離心管a，加入500μl濃度為50ng/ml的隱色孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)工作液，靜置10分鐘，加入3ml硼氫化鉀、4ml乙腈，超聲波震動15分鐘，振蕩混合10分鐘，再加2ml二氯甲烷、2.5ml對甲苯磺酸、1.5ml鹽酸羥胺、5ml乙酸胺、振蕩混合5分鐘；

2-2)加入氧化鋁6.10g、氯化鈉4.9克，振蕩混合5分鐘，玻璃棒攪拌均勻；

2-3)保持5℃的溫度，第一次8000轉(zhuǎn)離心5min，取上層溶液至離心管b；在離心管a中加入4ml二氯甲烷,第二次8000轉(zhuǎn)離心5分鐘，取上層溶液至離心管b；再在離心管a中加入4ml二氯甲烷，第三次8000轉(zhuǎn)離心5分鐘，取上層溶液至離心管b；在離心管b中加入10ml蒸餾水，以8000轉(zhuǎn)離心5分鐘，然后去掉上清層得到提取液；

2-4)prs柱下端接固相萃取裝置，上端與酸性氧化鋁固相萃取柱相連，將提取液以5ml乙腈活化后過prs柱；提取液過柱后去除酸性氧化鋁柱子，吹干prs柱，將1.5ml乙腈和1.5ml的0.1mol/l乙酸銨溶液混合后過prs柱；收集所有過柱液體待測定。

其中，步驟2-1)所述的對甲苯磺酸濃度為0.05mol/l；所述的鹽酸羥胺溶液是由2.5g鹽酸羥胺溶于于10ml水中制得；所述的乙酸胺濃度為0.125mol/l。

本發(fā)明的有益效果是：所述液相色譜測定孔雀石綠的方法是基于國標(biāo)gb/t20361-2006前處理方法的改良，用合并萃取的方式代替了繁瑣的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)步驟，減少了實(shí)驗(yàn)的整體耗時(shí)。改良法的加標(biāo)回收率在74％-95％之間，完全符合國標(biāo)中70-110％的要求，可用于實(shí)際水產(chǎn)品中殘留孔雀石綠的測定。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案，下面將對實(shí)施例描述中所需要使用的附圖作簡單說明。顯然，所描述的附圖只是本發(fā)明的一部分實(shí)施例，而不是全部實(shí)施例，本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他設(shè)計(jì)方案和附圖。

圖1是國標(biāo)法色譜圖；

圖2是本發(fā)明所述的改良法色譜圖。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例中未注明具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件(例如參考j.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》，第三版，科學(xué)出版社)或者按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

實(shí)施例1：標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

1-1)準(zhǔn)確吸取0.25ml的100μg/ml隱色孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)樣品液至25ml棕色容量瓶中，用乙腈定容，即為1μg/ml隱色孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)中間液，置于冰箱-18℃避光保存。

1-2)從1μg/ml的隱色孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)中間液中分別準(zhǔn)確吸取1.250ml于25ml棕色容量瓶中，用乙腈定容，即為50.0ng/ml的隱色孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)工作液。

實(shí)施例2：國標(biāo)法樣品前處理

鯇魚去鱗去皮，取背脊的肌肉部分，切成小塊后放進(jìn)攪拌機(jī)攪碎勻質(zhì)。

稱取5.00g攪碎好的樣品于50ml的離心管內(nèi)，往樣品中加入500μl的50ng/ml隱色孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)工作液，靜置10min，依次加入10ml乙腈、5g酸性氧化鋁后用旋渦混合器振蕩2min，用高速冷凍離心機(jī)離心于5℃中8000r/min離心5min，取上清液至125ml分液漏斗，再往分液漏斗中加入2ml二甘醇、3ml的0.2mol/l硼氫化鉀，振蕩2min。

繼續(xù)加入1.5ml的20％鹽酸羥胺溶液、2.5ml的0.05mol/l對甲苯磺酸溶液、5.0ml的0.125mol/l乙酸銨緩沖溶液于50ml離心管中，振蕩2min后加入10ml乙腈，再振蕩2min后離心5min，上層液合并在125ml分液漏斗中，并重復(fù)此操作一次。

往分液漏斗中加入20ml二氯甲烷，帶塞劇烈振搖2min，再靜置分層，轉(zhuǎn)移下層溶液于250ml的茄形瓶中，再在分液漏斗中加入5ml乙腈，10ml二氯甲烷，振搖2min，并將所有溶液轉(zhuǎn)至50ml的離心管中，再次8000r/min離心5min，合并下層溶液于茄形瓶中，45度旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至剩一滴，用2.5ml乙腈溶解殘?jiān)?/p>

實(shí)施例3：改良法的樣品前處理

鯇魚去鱗去皮，取背脊的肌肉部分，切成小塊后放進(jìn)攪拌機(jī)攪碎勻質(zhì)。

2-1)提取5g已搗碎樣品于離心管a，加入500μl濃度為50ng/ml的隱色孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)工作液，靜置10分鐘，加入3ml硼氫化鉀、4ml乙腈，超聲波震動15分鐘，振蕩混合10分鐘，再加2ml二氯甲烷、2.5ml對甲苯磺酸、1.5ml鹽酸羥胺、5ml乙酸胺、振蕩混合5分鐘；

2-2)加入氧化鋁6.10g、氯化鈉4.9克，振蕩混合5分鐘，玻璃棒攪拌均勻；

2-3)保持5℃的溫度，第一次8000轉(zhuǎn)離心5min，取上層溶液至離心管b；在離心管a中加入4ml二氯甲烷,第二次8000轉(zhuǎn)離心5分鐘，取上層溶液至離心管b；再在離心管a中加入4ml二氯甲烷，第三次8000轉(zhuǎn)離心5分鐘，取上層溶液至離心管b；在離心管b中加入10ml蒸餾水，以8000轉(zhuǎn)離心5分鐘，然后去掉上清層得到提取液；

2-4)prs柱下端接固相萃取裝置，上端與酸性氧化鋁固相萃取柱相連，將提取液以5ml乙腈活化后過prs柱；提取液過柱后去除酸性氧化鋁柱子，吹干prs柱，將1.5ml乙腈和1.5ml的0.1mol/l乙酸銨溶液混合后過prs柱；收集所有過柱液體待測定。

乙酸銨緩沖溶液(0.125mol/l)：稱取9.64g無水乙酸銨溶解于1000ml蒸餾水中，4℃保存。

乙酸銨緩沖溶液(0.1mol/l)：稱取7.71g無水乙酸銨溶解于1000ml蒸餾水中。

硼氫化鉀溶液(0.2mol/l)：稱取0.54g硼氫化鉀魚溶解于50ml蒸餾水中，現(xiàn)配現(xiàn)用。

20％鹽酸羥胺溶液：稱取12.5g鹽酸羥胺溶解于50ml蒸餾水中。

對甲苯磺酸溶液(0.05mol/l)：稱取0.95g對甲苯磺酸溶解于100ml蒸餾水中。

實(shí)施例4：高效液相色譜測定

3-1)色譜條件

色譜柱：短柱：xb-c18柱，內(nèi)徑4.6*150mm，粒度5μm；長柱：athenac18-wp，內(nèi)徑4.6*250mm，粒度5μm；

流動相：乙腈+0.125mol/l乙酸銨緩沖溶液＝80+20(體積分?jǐn)?shù))；

流速：1.3ml/min，進(jìn)樣量：20μl；

柱溫：35℃，激發(fā)波長：265nm，發(fā)射波長：360nm。

3-2)色譜測定

按照色譜條件，分別對隱色孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)工作液、國標(biāo)法樣品及改良法樣品提取液進(jìn)行色譜分析，記錄保留時(shí)間和峰面積，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的保留時(shí)間定性，外標(biāo)法定量。得到圖1為國標(biāo)法色譜圖，圖2為改良法色譜圖。

測定結(jié)果如下：

鯇魚樣品測定孔雀石綠含量國標(biāo)法與改良法對比表

根據(jù)上表以及圖1和圖2可知國標(biāo)法的加標(biāo)回收率為92％，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.67％；而改良法加標(biāo)回收率為95％，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.03％。gb/t20361-2006中要求回收率為70％～110％，以上兩者都符合且相對標(biāo)準(zhǔn)偏差較小。其中改良法檢測減去了旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)這一繁瑣的操作，使得所花費(fèi)時(shí)間較少，檢測起來更加方便，成本更加低。

以上對本發(fā)明的較佳實(shí)施方式進(jìn)行了具體說明，但本發(fā)明創(chuàng)造并不限于所述實(shí)施例，熟悉本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不違背本發(fā)明精神的前提下還可作出種種的等同變型或替換，這些等同的變型或替換均包含在本申請權(quán)利要求所限定的范圍內(nèi)。