【技術(shù)領(lǐng)域】

本發(fā)明涉及一種測定養(yǎng)殖水中多獸藥殘留的分析方法，特別是一種利用超聲輔助分散液液微萃取-超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜測定養(yǎng)殖水中多獸藥殘留的分析方法，屬于食品化學分析技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

現(xiàn)代養(yǎng)殖業(yè)日益趨向于規(guī)?；?、集約化，使用抗生素、激素等，更成為保障水產(chǎn)品養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展必不可少的一環(huán)。但是由于科學知識的缺乏和經(jīng)濟利益的驅(qū)使，在水產(chǎn)品養(yǎng)殖業(yè)中濫用藥物的現(xiàn)象普遍存在，在我國情況尤為嚴重。濫用獸藥的直接后果是導致獸藥在動物性食品中的殘留，攝入人體后，影響人類的健康。水產(chǎn)品中獸藥的使用與殘留越來越受到廣泛的關(guān)注，許多國家和國際組織均制定了水產(chǎn)品中藥物殘留的限制標準。日本從2006年5月29日實施的《食品中殘留農(nóng)藥的肯定列表制度》中對涉及水產(chǎn)品的134種化學藥物殘留量限定。美國fda對水產(chǎn)品進口要檢查221種化學藥物的殘留，嚴禁使用的藥品有10種。歐盟、加拿大、韓國等國家近幾年也相應地提高了水產(chǎn)品藥物殘留的限制。多數(shù)的獸藥是通過養(yǎng)殖水進入到水產(chǎn)品體內(nèi)，因此對養(yǎng)殖水進行監(jiān)控檢測能夠有效的從源頭對水產(chǎn)品中獸藥濫用情況進行控制。

養(yǎng)殖水中獸藥殘留檢測方法主要有酶聯(lián)免疫法、高效液相色譜法、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(gc-ms)、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(lc-ms/ms)和液相色譜-高分辨質(zhì)譜法。其中酶聯(lián)免疫法易出現(xiàn)假陽性結(jié)果和交叉反應；高效液相色譜法的抗干擾能力差，靈敏度低且不能滿足標準限值的要求；gc-ms方法需對樣品進行繁瑣的衍生化處理；lc-ms/ms技術(shù)無需衍生化處理，而且在滿足多組分同時檢測的情況下仍有較好的選擇性、靈敏度和特異性，彌補了前幾種方法的缺陷，但是其難以完全闡明化合物的結(jié)構(gòu)裂解信息，定性準確度方面尚有欠缺，容易產(chǎn)生假陽性的結(jié)果。養(yǎng)殖水中獸藥殘留的檢測的前處理方法包括固相萃取、液液萃取等方法，這些方法使用有機試劑多，易對環(huán)境造成污染，同時實驗所需時間較長。

四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜儀(q-exactive)具有分辨率高及定量能力好的優(yōu)點，不同于三重四極桿低分辨質(zhì)譜使用多反應監(jiān)測模式通過目標物的離子對進行定量分析，高分辨質(zhì)譜可以利用目標物母離子的精確分子量直接定量，無需對目標物逐個優(yōu)化子離子及相關(guān)參數(shù)，對于多目標物分析可以極大地降低檢測方法的時間，同時又能很好地避免低分辨質(zhì)譜易受基質(zhì)干擾而產(chǎn)生假陽性的現(xiàn)象。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種使用ua-dllem-uplc-qexactiveorbitrapms測定養(yǎng)殖水中21種獸藥殘留的的檢測方法，填補現(xiàn)有檢測技術(shù)的空白。

本發(fā)明為了實現(xiàn)上述目的，采用以下技術(shù)方案：

一種測定養(yǎng)殖水中多獸藥殘留的分析方法，其特征在于包括以下步驟：

(1)標準溶液配制；

(2)超聲輔助提取：

稱取50ml養(yǎng)殖水樣品，在10℃條件下14000r/min離心10min，取上清液5.0ml，50℃超聲提取10min，上清液移入10ml錐形離心管中并加入0.3gnacl，渦旋溶解2min，用乙酸溶液調(diào)ph至4.5；

(3)分散液液微萃取：將200μl分散劑異丙醇和50μl萃取劑chcl3混合，用1ml的玻璃注射器迅速注入(2)溶液中，輕晃離心管，混合形成水、異丙醇、三氯甲烷的乳濁液，以4500r/min離心5min，離心后的下層溶液用50μl微型注射器取20μl，進行超高效液相色譜—高分辨質(zhì)譜檢測；

(4)超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜儀分析。

目前，關(guān)于養(yǎng)殖水中21種獸藥殘留的測試技術(shù)較少，本發(fā)明將分散液液微萃取技術(shù)運用于養(yǎng)殖水中獸藥殘留的檢測，為了提高萃取效率，同時加入了超聲萃取作為輔助，并通過關(guān)鍵影響因子的實驗研究，確定了萃取過程最優(yōu)化條件。

本發(fā)明中標準溶液的配制包括：

準確稱取氯唑西林鈉和雙鈉青霉素鈉鹽水合物標準品約5.0mg，于各自的5ml容量瓶中，用體積比為乙腈:水＝30:70的乙腈水溶液溶解并定容至刻度，制成質(zhì)量濃度為1mg/ml的標準儲備液；

準確稱取2-氨基－5-苯并咪唑、妥曲珠利、克拉珠利、水楊酸、托滅酸、4-氨基安替比林、4-甲酰氨基安替比林、4-甲氨基安替比林、保泰松、17α-羥孕孕酮、醋酸美倫孕酮、乙酸甲地孕酮、甲羥孕酮、卡洛芬、地克珠利、雙氯芬酸、甲滅酸、萘丁美酮和妥曲珠利砜標準品約5.0mg，于各自的5ml容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，制成質(zhì)量濃度為1mg/ml的標準儲備液，置于4℃冰箱中保存。

本發(fā)明中超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜儀的參數(shù)為：

色譜：acquityuplcbehc18100mm×2.1mm，1.7μm；柱溫：40℃；進樣量：10μl；流動相：a為0.1％甲酸水溶液，b為0.1％甲酸乙腈溶液；梯度洗脫程序0～1.0min，保持95％a；1.0～7.0min，流動相a的比例由95％線性變化至5％；7.0～10.0min，保持5％a；10.1～13min，保持95％a；

質(zhì)譜：加熱電噴霧離子源溫度為350℃，離子傳輸溫度為320℃，鞘氣為40unit，輔助氣為40unit，毛細管電壓為3.2kv，離子傳輸管溫度為325℃；

fullscan/ddms2掃描模式：采集范圍為100～1500da，正負切換采集；一級質(zhì)譜分辨率為70000fwhm，二級質(zhì)譜分辨率為17500fwhm；碰撞池能量nce為20，40，60ev。

本發(fā)明各目標化合物的質(zhì)量分析參數(shù)見表1：

表1：各化合物質(zhì)量分析參數(shù)

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，有以下優(yōu)點：

本發(fā)明可以同時測定養(yǎng)殖水中21種獸藥殘留，靈敏度高，檢測限為0.1μg/kg～1.0μg/kg。

本發(fā)明只需少量分散劑、萃取劑就可實現(xiàn)前處理，能夠節(jié)省大量對人體有害的有機溶劑的使用，減少對檢測人員的毒害作用，保護環(huán)境。

本發(fā)明的樣品前處理時間短，小于25min，大大節(jié)省了分析時間，同時具有靈敏，準確，省時，穩(wěn)定，精密度高，重現(xiàn)性好等優(yōu)點，適用于大批量檢測養(yǎng)殖水樣品。

【附圖說明】

圖1為濃度分別1.0μg/l的21種獸藥標準混合溶液的色譜圖；

圖2是濃度分別為1.0μg/l的部分獸藥色譜圖之一；

圖3是濃度分別為1.0μg/l的部分獸藥色譜圖之二；

圖4是濃度分別為1.0μg/l的部分獸藥色譜圖之三；

圖5是濃度分別為1.0μg/l的部分獸藥色譜圖之四。

【具體實施方式】

下面結(jié)合具體實施方式對本發(fā)明作進一步詳細說明：

本發(fā)明首先確定最優(yōu)條件的控制參數(shù)。影響超聲輔助萃取(uae)和分散液液微萃取(dllme)效率的主要因素包括：萃取劑的類型和用量、超聲時間、分散劑的用量、ph值和鹽濃度的影響。

超聲輔助萃取(uae)考察了不同萃取劑(四氯化碳、環(huán)已烷、二氯甲烷和三氯甲烷)對回收率的影響，每組實驗平行測定三次。結(jié)果表明，三氯甲烷作為萃取劑對目標物的回收率達到最大。二氯甲烷與分散劑無法形成穩(wěn)定的兩相體系；相同體積下不同的萃取劑所形成的沉積相的體積液不同，沉積相體積四氯化碳為25μl，氯苯為50μl，三氯甲烷為50μl，實驗表明，三氯甲烷有較高的回收率，萃取效果最好，因此選用三氯甲烷作為萃取劑。

超聲時間的確定：充足的超聲時間能夠保證足夠的萃取效率，但是過長的時間存在導致分析物被破壞的可能，另外超聲的熱效應使得水溫上升，這些都會對萃取效果產(chǎn)生影響。對萃取時間分別是4、8、10、12、16min的萃取效率進行考察，結(jié)果表明，10-16min時各目標物萃取效率基本保持不變，因此，本發(fā)明選擇10min作為最優(yōu)超聲時間。

分散劑的用量：考察了環(huán)己烷體積100μl～600μl對回收率的影響。分散劑體積為200μl時21種獸藥殘留回收率最高。這是因為分散劑體積較小時，萃取劑不能均勻分散在水相中，回收率低；分散劑體積較大時，分析物在水中的溶解度增大不易被萃取。因此實驗選用環(huán)已烷的最佳體積為200μl。

ph值和鹽濃度的影響ph值影響獸藥殘留分子在水溶液中的存在方式，進而影響到萃取效率，因此，以乙酸和naoh溶液調(diào)節(jié)水樣的酸度，考察酸性(ph＝3.0)、(ph＝4.5)中性(ph＝7.0)和堿性(ph＝8.0)、(ph＝10.0)條件對萃取效率的影響，發(fā)現(xiàn)ph＝4.5時萃取效最好。向超純水溶液中加入nacl(0.00～0.045g)，考察了鹽效應對回收率的影響。實驗表明，在加入0.00～0.030g的nacl時，回收率隨著鹽濃度的增加而增加，并且在加入0.030gnacl時回收率最大；加入0.03～0.045g的nacl，回收率降低。因為增加離子強度，會降低目標化合物在水相的溶解度，提高其在有機相的分配系數(shù)；但當鹽濃度過大時，樣品溶液的粘度變大，目標物與鹽離子之間的靜電作用力增強，導致其傳質(zhì)能力降低，從而降低了回收率。因此，本實驗選擇加入0.030g的nacl。

實施例：

(1)標準溶液配制：準確稱取氯唑西林鈉和雙鈉青霉素鈉鹽水合物標準品約5.0mg，于各自的5ml容量瓶中，用乙腈水溶液(乙腈:水＝30:70，v/v)溶解并定容至刻度，制成質(zhì)量濃度為1mg/ml的標準儲備液；準確稱取2-氨基－5-苯并咪唑、妥曲珠利、克拉珠利、水楊酸、托滅酸、4-氨基安替比林、4-甲酰氨基安替比林、4-甲氨基安替比林、保泰松、17α-羥孕孕酮、醋酸美倫孕酮、乙酸甲地孕酮、甲羥孕酮、卡洛芬、地克珠利、雙氯芬酸、甲滅酸、萘丁美酮和妥曲珠利砜標準品約5.0mg，于各自的5ml容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，制成質(zhì)量濃度為1mg/ml的標準儲備液，置于4℃冰箱中保存；

(2)超聲輔助提取：稱取50ml養(yǎng)殖水樣品，在10℃條件下14000r/min離心10min，取上清液5.0ml，50℃超聲提取10min，上清液移入10ml錐形離心管中并加入0.3gnacl，渦旋溶解2min，用乙酸溶液調(diào)ph至4.5；

(3)分散液液微萃?。簩?00μl異丙醇(分散劑)和50μlchcl3(萃取劑)混合，用1ml的玻璃注射器迅速注入(2)溶液中，輕晃離心管，混合形成水、異丙醇、三氯甲烷的乳濁液，以4500r/min離心5min，離心后的下層溶液用50μl微型注射器取20μl，進行超高效液相色譜—高分辨質(zhì)譜檢測；

(4)超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜儀分析：超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜儀；色譜：acquityuplcbehc18100mm×2.1mm，1.7μm；柱溫：40℃；進樣量：10μl；流動相：a為0.1％甲酸水溶液，b為0.1％甲酸乙腈溶液。梯度洗脫程序0～1.0min，保持95％a；1.0～7.0min，流動相a的比例由95％線性變化至5％；7.0～10.0min，保持5％a；10.1～13min，保持95％a；質(zhì)譜：加熱電噴霧離子(hesi)源溫度為350℃；離子傳輸溫度為320℃；鞘氣為40unit；輔助氣為40unit；毛細管電壓為3.2kv；離子傳輸管溫度為325℃。

fullscan/ddms2掃描模式：采集范圍為100～1500da，正負切換采集；一級質(zhì)譜分辨率為70000fwhm，二級質(zhì)譜分辨率為17500fwhm；碰撞池能量(nce)為20，40，60ev。

方法線性范圍、相關(guān)系數(shù)和精密度試驗

將(1)的混合標準工作系列溶液按照實驗方法用uplc-qexactiveorbitrap進行測定，并繪制標準工作曲線，21種目標化合物組分的線性范圍、線性方程及相關(guān)系數(shù)r見表2。通過對加標陰性魚肉樣品的重復檢驗，相對標準偏差(rsd)(n＝6)為：1.09～7.98％，表3給出了加標陰性樣品的精密度實驗結(jié)果。

表2：21種目標化合物的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)

表3：陰性樣品加標回收率和相對標準偏差

本發(fā)明采用超聲與分散液液微萃取結(jié)合的方法對樣品進行前處理，有效地減少了基質(zhì)對目標化合物(包括β－內(nèi)酰胺類、非甾體類抗炎藥等21種獸藥殘留)的干擾影響。同時利用q-exactive高分辨的分析能力，能夠準確的對目標化合物進行定量、定性分析，避免了假陽性的現(xiàn)象出現(xiàn)。