技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種測定氨糖含量的方法，特別是涉及一種運(yùn)用高效液相色譜法測定氨糖含量的方法。
背景技術(shù)：
：氨糖的全稱是D-氨基葡萄糖，屬單糖成份，可從蟹蝦殼中萃取，是親水性極強(qiáng)的蛋白多糖的重要組成部分，是形成軟骨細(xì)胞的重要營養(yǎng)素之一，也是軟骨基質(zhì)和關(guān)節(jié)液的基本成分，工業(yè)提取的氨糖分為D-氨基葡萄糖鹽酸鹽、D-氨基葡萄糖硫酸鹽、高純硫酸氨糖三種，廣泛用于骨關(guān)節(jié)疾病的預(yù)防和治療。最新醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，人體內(nèi)缺乏氨糖會直接導(dǎo)致各種骨關(guān)節(jié)疾病的發(fā)生，而氨糖流失的過程在人們35歲左右就已經(jīng)開始了。氨糖不僅控制著人體骨關(guān)節(jié)的健康，還控制著關(guān)節(jié)軟骨滑膜的代謝平衡。氨糖是生物萃取得來，比較安全，沒有副作用及藥物依賴性，但成年人每日食用量最好控制在2000mg以下。所以任何氨糖補(bǔ)充劑中的氨糖含量還是需要控制測定。目前國內(nèi)外都有氨糖含量測定的方法，也包括一些法定方法，主要是HPLC法，它們普遍存在一些缺陷：比如方法對實(shí)驗(yàn)室檢測環(huán)境要求太高（溫度控制很嚴(yán)格），檢測結(jié)果重現(xiàn)性不好等。而很多實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境控制達(dá)不到方法的要求，就會出現(xiàn)檢測結(jié)果偏差大，不穩(wěn)定等現(xiàn)象，為了解決這一難題，本發(fā)明通過對樣品處理和色譜條件的改善，運(yùn)用高效液相色譜儀高效準(zhǔn)確的分析氨糖的含量。本方法降低了對實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境控制的要求，提高了樣品檢測的準(zhǔn)確性，也減少了檢測成本。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種運(yùn)用高效液相色譜法測定氨糖含量的方法，其準(zhǔn)確測定氨糖含量，減少實(shí)驗(yàn)室環(huán)境對方法的影響，降低實(shí)驗(yàn)室檢測成本，提高檢測準(zhǔn)確度、重現(xiàn)性，本發(fā)明對環(huán)境要求不高，樣品溶液也比較穩(wěn)定，存在檢測精度高，重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)；同時，該發(fā)明減少了溶劑使用量，分析成本大大降低，提供了一種簡便、快捷、準(zhǔn)確且低成本測定氨糖含量的高效液相色譜分析方法，檢測產(chǎn)品可以是原料、純氨糖片、氨糖MSM片、氨糖軟骨素片等產(chǎn)品，適用范圍廣，實(shí)用性強(qiáng)。本發(fā)明是通過下述技術(shù)方案來解決上述技術(shù)問題的：一種運(yùn)用高效液相色譜法測定氨糖含量的方法，其包括以下步驟：步驟一，對照品溶液的配制；步驟二，樣品處理；步驟三，確定液相色譜條件；所述，步驟一包括以下步驟：步驟十一，采用USP標(biāo)準(zhǔn)品作為氨糖對照品，精密稱定適量的D-氨基葡萄糖鹽酸鹽對照品置一容量瓶中，加入醋酸鈉溶液，超聲溶解；步驟十二，用醋酸鈉溶液稀釋至刻度，混勻作為標(biāo)準(zhǔn)儲備液；吸取適量標(biāo)準(zhǔn)儲備液至另一容量瓶中，加異硫氰酸苯酯，再加甲醇，超聲溶解，加甲醇/水至刻度，混勻，水浴中加熱，冷卻至室溫；步驟十三，轉(zhuǎn)移上述溶液約適量至離心管中，加入庚烷，振搖，將甲醇層轉(zhuǎn)移至HPLC瓶中，進(jìn)樣；所述，步驟二包括以下步驟：步驟二十一，精密稱取一定量的供試品置一容量瓶中，加入適量醋酸鈉溶液，超聲溶解；步驟二十二，用醋酸鈉溶液稀釋至刻度，混勻；步驟二十三，吸取適量上述溶液至另一容量瓶中，加異硫氰酸苯酯，再加甲醇，超聲溶解，加甲醇/水至刻度，混勻，水浴中加熱，冷卻至室溫；步驟二十四，轉(zhuǎn)移上述溶液適量至離心管中，加入庚烷，振搖，將甲醇層轉(zhuǎn)移至HPLC瓶中，進(jìn)樣；所述，步驟三包括以下步驟：步驟三十一，選擇高效液相色譜儀和帶紫外檢測器；步驟三十二，選擇產(chǎn)品參數(shù)為C18，50mm×4.6mm，2.7μm的色譜柱；步驟三十三，設(shè)定流速為1.0mL/min；步驟三十四，設(shè)定第一流動相為磷酸溶液；第二流動相為乙腈；梯度如下表所示：時間（min）第一流動相第二流動相085%15%1.585%15%2.00%100%3.50%100%5.085%15%7.085%15%步驟三十五，設(shè)定檢測波長為UV240nm；步驟三十六，設(shè)定柱溫為25℃；步驟三十七，設(shè)定進(jìn)樣量為2μL。優(yōu)選地，所述步驟十一中氨糖的含量的計(jì)算公式如下式所示：其中：A對、A樣分別為對照品、樣品的峰面積；W對為對照品的重量，mg；W樣為樣品的重量，g；C對為對照品的含量。優(yōu)選地，所述步驟十二中的標(biāo)準(zhǔn)儲備液的配制為：精密稱定適量的D-氨基葡萄糖鹽酸鹽對照品置一容量瓶中，加入0.1mol/L醋酸鈉溶液，超聲溶解，用0.1mol/L醋酸鈉溶液稀釋至刻度，混勻作為標(biāo)準(zhǔn)儲備液，其濃度約為1.0mg/ml。優(yōu)選地，所述步驟一中的溶液的配制為：吸取標(biāo)準(zhǔn)儲備液適量至另一容量瓶中，加350μl異硫氰酸苯酯（PITC），再加10ml甲醇，超聲溶解，加甲醇/水（65/35）至刻度，混勻，80℃水浴中加熱10min，冷卻至室溫；轉(zhuǎn)移上述溶液5ml溶液至離心管中，加入5ml庚烷，振搖2min，將甲醇層轉(zhuǎn)移至HPLC瓶中，進(jìn)樣。優(yōu)選地，所述步驟二中的樣品處理為：稱取一定量的供試品置一容量瓶中，加入0.1mol/L醋酸鈉溶液，超聲溶解；用0.1mol/L醋酸鈉溶液稀釋至刻度，混勻；吸取上述溶液至另一容量瓶中，加350μl異硫氰酸苯酯，再加10ml甲醇，超聲溶解，加甲醇/水至刻度，混勻，80℃水浴中加熱10min，冷卻至室溫；轉(zhuǎn)移上述溶液5ml溶液至離心管中，加入5ml庚烷，振搖2min，將甲醇層轉(zhuǎn)移至HPLC瓶中，進(jìn)樣。本發(fā)明的積極進(jìn)步效果在于：本發(fā)明準(zhǔn)確測定氨糖含量，減少實(shí)驗(yàn)室環(huán)境對方法的影響，降低實(shí)驗(yàn)室檢測成本，提高檢測準(zhǔn)確度、重現(xiàn)性，用醋酸鈉、異硫氰酸苯酯對樣品進(jìn)行衍生化處理，再用甲醇水提取，最后用庚烷振搖萃取出未反應(yīng)的PITC，得到甲醇層溶液分析；對環(huán)境要求不高，樣品溶液也比較穩(wěn)定，存在檢測精度高，重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)；采用5cmC18柱代替?zhèn)鹘y(tǒng)的25cmC18柱，檢測速度提高了5倍，同時也減少了溶劑使用量，分析成本大大降低，提供了一種簡便、快捷、準(zhǔn)確且低成本測定氨糖含量的液相方法，檢測產(chǎn)品可以是原料、純氨糖片、氨糖MSM片、氨糖軟骨素片等產(chǎn)品，適用范圍廣，實(shí)用性強(qiáng)。附圖說明圖1A為本發(fā)明中實(shí)施例1的標(biāo)準(zhǔn)品測定的結(jié)果圖。圖1B為本發(fā)明中實(shí)施例1的樣品測定的結(jié)果圖。圖2A為本發(fā)明中實(shí)施例2的標(biāo)準(zhǔn)品測定的結(jié)果圖。圖2B為本發(fā)明中實(shí)施例2的樣品測定的結(jié)果圖。圖3A為本發(fā)明中實(shí)施例3的標(biāo)準(zhǔn)品測定的結(jié)果圖。圖3B為本發(fā)明中實(shí)施例3的樣品測定的結(jié)果圖。圖4為本發(fā)明運(yùn)用高效液相色譜法測定氨糖含量的方法的流程圖。具體實(shí)施方式下面結(jié)合附圖給出本發(fā)明較佳實(shí)施例，以詳細(xì)說明本發(fā)明的技術(shù)方案。如附圖4所示，本發(fā)明運(yùn)用高效液相色譜法測定氨糖含量的方法包括以下步驟：步驟一，對照品溶液的配制；步驟二，樣品處理；步驟三，確定液相色譜條件；所述，步驟一包括以下步驟：步驟十一，采用USP標(biāo)準(zhǔn)品作為氨糖對照品，精密稱定適量的D-氨基葡萄糖鹽酸鹽對照品置一容量瓶中，加入醋酸鈉溶液，超聲溶解；步驟十二，用醋酸鈉溶液稀釋至刻度，混勻作為標(biāo)準(zhǔn)儲備液；吸取適量標(biāo)準(zhǔn)儲備液至另一容量瓶中，加異硫氰酸苯酯（PITC），再加甲醇，超聲溶解，加甲醇/水至刻度，混勻，水浴中加熱，冷卻至室溫；步驟十三，轉(zhuǎn)移上述溶液約適量至離心管中，加入庚烷，振搖，將甲醇層轉(zhuǎn)移至HPLC瓶中，進(jìn)樣；所述，步驟二包括以下步驟：步驟二十一，精密稱取一定量的供試品置一容量瓶中，加入適量醋酸鈉溶液，超聲溶解；步驟二十二，用醋酸鈉溶液稀釋至刻度，混勻；步驟二十三，吸取適量上述溶液至另一容量瓶中，加異硫氰酸苯酯（PITC），再加甲醇，超聲溶解，加甲醇/水至刻度，混勻，水浴中加熱，冷卻至室溫；步驟二十四，轉(zhuǎn)移上述溶液適量至離心管中，加入庚烷，振搖，將甲醇層轉(zhuǎn)移至HPLC瓶中，進(jìn)樣；所述，步驟三包括以下步驟：步驟三十一，選擇高效液相色譜儀和帶紫外檢測器；步驟三十二，選擇產(chǎn)品參數(shù)為C18，50mm×4.6mm，2.7μm的色譜柱；步驟三十三，設(shè)定流速為1.0mL/min；步驟三十四，設(shè)定第一流動相為磷酸溶液；第二流動相為乙腈；梯度如下表所示時間（min）第一流動相第二流動相085%15%1.585%15%2.00%100%3.50%100%5.085%15%7.085%15%步驟三十五，設(shè)定檢測波長為UV240nm；步驟三十六，設(shè)定柱溫為25℃；步驟三十七，設(shè)定進(jìn)樣量為2μL。所述步驟十一中氨糖的含量的計(jì)算公式如下式所示：其中：A對、A樣分別為對照品、樣品的峰面積；W對為對照品的重量，mg；W樣為樣品的重量，g；C對為對照品的含量。所述步驟十二中的標(biāo)準(zhǔn)儲備液的配制為：精密稱定適量的D-氨基葡萄糖鹽酸鹽對照品置一容量瓶中，加入0.1mol/L醋酸鈉溶液，超聲溶解，用0.1mol/L醋酸鈉溶液稀釋至刻度，混勻作為標(biāo)準(zhǔn)儲備液，其濃度約為1.0mg/ml。所述步驟一中的溶液的配制為：吸取標(biāo)準(zhǔn)儲備液適量至另一容量瓶中，加350μl異硫氰酸苯酯（PITC），再加10ml甲醇，超聲溶解，加甲醇/水（65/35）至刻度，混勻，80℃水浴中加熱10min，冷卻至室溫；轉(zhuǎn)移上述溶液5ml溶液至離心管中，加入5ml庚烷，振搖2min，將甲醇層轉(zhuǎn)移至HPLC瓶中，進(jìn)樣。所述步驟二中的樣品處理為：稱取一定量的供試品置一容量瓶中，加入0.1mol/L醋酸鈉溶液，超聲溶解；用0.1mol/L醋酸鈉溶液稀釋至刻度，混勻；吸取上述溶液至另一容量瓶中，加350μl異硫氰酸苯酯（PITC），再加10ml甲醇，超聲溶解，加甲醇/水（65/35）至刻度，混勻，80℃水浴中加熱10min，冷卻至室溫；轉(zhuǎn)移上述溶液5ml溶液至離心管中，加入5ml庚烷，振搖2min，將甲醇層轉(zhuǎn)移至HPLC瓶中，進(jìn)樣。本發(fā)明適用于氨糖原料、純氨糖片、含MSM的氨糖片、含硫酸軟骨素的氨糖片。實(shí)施例1氨基葡萄糖鹽酸鹽顆粒（21-727）中氨糖含量的測定：本發(fā)明所用試劑及配制：醋酸鈉（分析純）、異硫氰酸苯酯（分析純）、甲醇（色譜純）、庚烷（色譜純）、乙腈（色譜純）、磷酸（分析純）；標(biāo)準(zhǔn)儲備液的配制：精密稱定適量的D-氨基葡萄糖鹽酸鹽對照品置一容量瓶中，加入0.1mol/L醋酸鈉溶液，超聲溶解。用0.1mol/L醋酸鈉溶液稀釋至刻度，混勻作為標(biāo)準(zhǔn)儲備液，其濃度約為1.0mg/ml。標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制：吸取標(biāo)準(zhǔn)儲備液適量至另一容量瓶中，加350μl異硫氰酸苯酯（PITC）,再加10ml甲醇，超聲溶解，加甲醇/水（65/35）至刻度，混勻，80℃水浴中加熱10min，冷卻至室溫；轉(zhuǎn)移上述溶液約5ml溶液至離心管中，加入約5ml庚烷，振搖2min，將甲醇層轉(zhuǎn)移至HPLC瓶中，進(jìn)樣。樣品處理：稱取一定量的供試品置一容量瓶中，加入約0.1mol/L醋酸鈉溶液，超聲溶解。用0.1mol/L醋酸鈉溶液稀釋至刻度，混勻；吸取上述溶液至另一容量瓶中，加350μl異硫氰酸苯酯（PITC），再加10ml甲醇，超聲溶解，加甲醇/水（65/35）至刻度，混勻，80℃水浴中加熱10min，冷卻至室溫；轉(zhuǎn)移上述溶液5ml溶液至離心管中，加入5ml庚烷，振搖2min，將甲醇層轉(zhuǎn)移至HPLC瓶中，進(jìn)樣。液相色譜條件：儀器：高效液相色譜儀,帶紫外檢測器；色譜柱：C18柱，50mm×4.6mm，2.7μm流速：1.0mL/min檢測波長：UV240nm柱溫：30℃進(jìn)樣量：2μL第一流動相：磷酸溶液；第二流動相：乙腈；梯度如下表所示：時間（min）第一流動相第二流動相085%15%1.585%15%2.00%100%3.50%100%5.085%15%7.085%15%計(jì)算公式如下式所示：樣品檢測結(jié)果如附圖1A、附圖1B所示。實(shí)施例2GlucosamineSulfate2KCL1000mgTablet（GT2L）（江蘇艾蘭得營養(yǎng)品有限公司生產(chǎn)）樣品中氨糖含量的測定：具體步驟同第一實(shí)施例1，樣品檢測結(jié)果如附圖2A、附圖2B所示。實(shí)施例3氨糖軟骨素維生素D鈣片（GT0Q）（江蘇艾蘭得營養(yǎng)品有限公司生產(chǎn)）樣品中氨糖含量的測定：具體步驟同第一實(shí)施例1，樣品檢測結(jié)果如附圖3A、附圖3B所示。以上所述的具體實(shí)施例，對本發(fā)明的解決的技術(shù)問題、技術(shù)方案和有益效果進(jìn)行了進(jìn)一步詳細(xì)說明，所應(yīng)理解的是，以上所述僅為本發(fā)明的具體實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所做的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁1 2 3