本發(fā)明涉及一種疫苗效力的測定方法，尤其是一種雞毒支原體疫苗效力測定方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
雞毒支原體病是由雞毒支原體（mg）感染引起的雞、火雞慢性呼吸道?。╟rd），臨床上主要表現(xiàn)為咳嗽、流鼻涕，呼吸時有啰音，嚴(yán)重時張口呼吸等癥狀，感染雞剖檢經(jīng)?？梢姎饽已缀透]炎癥狀。據(jù)有關(guān)報道，mg感染雞群后，雛雞、蛋雞、肉雞的生產(chǎn)性能均會受到不同程度的影響，且其造成的免疫抑制極易引起其他疾病的繼發(fā)或伴發(fā)感染，成為危害養(yǎng)雞業(yè)的重要疾病之一。有效的疫苗免疫是預(yù)防雞毒支原體感染的重要手段。
目前雞毒支原體疫苗效力測定方法主要是免疫攻毒保護(hù)法，根據(jù)攻毒后雞氣囊病變積分情況進(jìn)行結(jié)果判定。上述試驗(yàn)的實(shí)施需要有負(fù)壓的工作環(huán)境，每次都需要剖殺試驗(yàn)雞，且評價結(jié)果時受主觀因素的影響較大，以致經(jīng)常會造成檢驗(yàn)結(jié)果的誤差；同時強(qiáng)毒攻擊也存在生物安全隱患，易散毒；在實(shí)際工作中還受個體、環(huán)境、飼養(yǎng)等因素的影響，重復(fù)性差，為疫苗效力的研究帶來諸多的困難。本發(fā)明方法可替代免疫攻毒保護(hù)法，結(jié)果客觀、重復(fù)性強(qiáng)、操作簡單，更適于實(shí)際臨床應(yīng)用。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)之缺陷、提供一種新型的雞毒支原體疫苗效力測定方法，以提高檢測精確度，縮短檢測周期。
本發(fā)明所述技術(shù)問題是由以下技術(shù)方案解決的。
一種雞毒支原體疫苗效力測定方法，它包括以下步驟：
（1）免疫動物
選用spf雞作為實(shí)驗(yàn)動物，用所述雞毒支原體疫苗對實(shí)驗(yàn)動物進(jìn)行免疫。
（2）血清采集、稀釋
免疫程序結(jié)束后，無菌采集動物血清，滅活，對血清做倍比稀釋，得到不同稀釋度的血清，作為待檢樣品。
（3）支原體-血清結(jié)合、培養(yǎng)
取待檢樣品與雞毒支原體檢測用抗原等體積混合，每個樣品設(shè)置復(fù)孔，同時設(shè)陰、陽性對照，將培養(yǎng)板密閉，恒溫培養(yǎng)，定期觀察。
（4）結(jié)果判定
試驗(yàn)成立條件：陽性對照孔均變?yōu)辄S色，陰性對照孔均不變色。
判定時間：當(dāng)陽性對照孔全部變?yōu)辄S色時進(jìn)行結(jié)果判定。
判定標(biāo)準(zhǔn)：將不變色孔的待檢樣品最高稀釋倍數(shù)判定為所述待檢樣品的效價。
優(yōu)選地，步驟（2）中所述血清采集時間優(yōu)選免疫程序結(jié)束后28～35d，例如28d、30d、32d和34d等。
優(yōu)選地，步驟（2）中所述待檢血清做2~10倍系列倍比稀釋，優(yōu)選2～5倍系列稀釋。
優(yōu)選地，步驟（3）中所述雞毒支原體檢測用抗原為雞毒支原體培養(yǎng)物用液體培養(yǎng)基稀釋所得，其活菌滴度優(yōu)選10~10000ccu/ml，更優(yōu)選100~5000ccu/ml，進(jìn)一步優(yōu)選500~1000ccu/ml。
優(yōu)選地，步驟（3）中所述陰性對照孔僅含液體培養(yǎng)基，但不添加雞毒支原體和待檢血清。
優(yōu)選地，步驟（3）中所述陽性對照孔僅含雞毒支原體檢測用抗原，但不添加待檢血清。
優(yōu)選地，步驟（4）中所述判定時間為陽性對照孔全部變?yōu)辄S色時的時間，即陽性孔內(nèi)培養(yǎng)物ph低于7.0時的時間；此時，肉眼觀察陰性對照孔培養(yǎng)液顏色與陽性對照孔顏色有明顯差別；豬肺炎支原體檢測用抗原活菌滴度與判定時間負(fù)相關(guān)。
優(yōu)選地，步驟（4）中的所述判定標(biāo)準(zhǔn)的不變色孔是指其中的培養(yǎng)物顏色與陽性對照孔的顏色不同的孔。
有益效果：
一種雞毒支原體疫苗效力測定方法，由于采用如上所述的技術(shù)方案，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：
（1）本發(fā)明方法采用血清學(xué)檢驗(yàn)方法，重復(fù)性強(qiáng)，特異性好，精確度高，能直接反映疫苗保護(hù)效果。
（2）本發(fā)明方法利用雞毒支原體生長受血清抑制的特性，在特定的時間判定檢測結(jié)果，區(qū)別不同樣品的效價，以樣品孔出現(xiàn)顏色變化為判定標(biāo)準(zhǔn)，檢測結(jié)果更直觀可靠，減少主觀誤差。
（3）本發(fā)明方法與現(xiàn)有的免疫攻毒保護(hù)法相比，無需攻毒及剖殺動物，降低對檢測環(huán)境的要求，避免散毒，而且縮短檢測周期，提高檢測效率。
（4）本發(fā)明方法可適用于不同菌株雞毒支原體疫苗效力檢驗(yàn)，適用范圍廣。
（5）本發(fā)明方法通過稀釋血清、支原體培養(yǎng)物，僅需簡單設(shè)備即可實(shí)現(xiàn)，技術(shù)難度不高，有利于普遍推廣。
具體實(shí)施方案
現(xiàn)詳細(xì)說明本發(fā)明的多種示例性實(shí)施方式，該詳細(xì)說明不應(yīng)認(rèn)為是對本發(fā)明的限制，而應(yīng)理解為是對本發(fā)明的某些方面、特性和實(shí)施方案的更詳細(xì)的描述。
具體公開了該范圍的上限和下限具體公開了該范圍的上限和下限之間的每個中間值。在任何陳述值或陳述范圍內(nèi)的中間值以及具體公開了該范圍的上限和下限以及它們之間的每個中間值。在任何陳述值或陳述范圍內(nèi)的中間值以及任何其他陳述值或在所述范圍內(nèi)的中間值之間的每個較小的范圍也包括在本發(fā)明內(nèi)。這些較小范圍的上限和下限可獨(dú)立地包括或排除在范圍內(nèi)。
除非另有說明，否則本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有本發(fā)明所述領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)人員通常理解的相同含義。雖然本發(fā)明僅描述了優(yōu)選的方法和材料，但是在本發(fā)明的實(shí)施或測試中也可以使用與本文所述相似或等同的任何方法和材料。本說明書中提到的所有文獻(xiàn)通過引用并入，用以公開和描述與所述文獻(xiàn)相關(guān)的方法和/或材料。在與任何并入的文獻(xiàn)沖突時，以本說明書的內(nèi)容為準(zhǔn)。
實(shí)施例1本發(fā)明方法與免疫攻毒保護(hù)法之間的相關(guān)性
分別應(yīng)用本發(fā)明方法和免疫攻毒保護(hù)法同時對3批雞毒支原體滅活疫苗（cr株）進(jìn)行效力測定，對比兩種方法的檢測結(jié)果。
雞毒支原體滅活疫苗（cr株），瑞普（保定）生物藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號分別為161008、161109、161110，市場有售。
1.免疫動物
選擇40～60日齡spf雞70羽，隨機(jī)分為2組，其中免疫組40羽，每羽頸背部皮下或大腿部肌肉注射疫苗0.5ml，對照組30羽不免疫。
2.效力測定
a本發(fā)明方法
（1）血清采集
無菌采集spf雞免疫后1、2、3、4、5、6周齡時的全血，分離血清，分裝備用。
（2）血清稀釋
取適量待檢血清，56℃，30min水浴滅活；用0.01mol/lpbs對血清做2倍系列倍比稀釋，得到20～25六個稀釋度的血清，作為待檢樣品。
（3）支原體-血清結(jié)合、培養(yǎng)
取六個稀釋度的血清與雞毒支原體檢測用抗原（雞毒支原體培養(yǎng)物用液體培養(yǎng)基稀釋至活菌滴度為1000ccu/ml）各100ul等體積混合，每個樣品3個復(fù)孔，設(shè)陰性對照孔（僅含200ul的液體培養(yǎng)基，但不添加雞毒支原體和待檢血清）和陽性對照孔（僅含200ul雞毒支原體檢測用抗原，但不添加待檢血清）。將96孔細(xì)胞培養(yǎng)板密閉，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每24h觀察一次。
（4）結(jié)果判定
試驗(yàn)成立條件：陽性對照孔均變?yōu)辄S色，陰性對照孔均不變色。
判定時間：培養(yǎng)3日時，陽性對照孔全部變?yōu)辄S色，即孔內(nèi)培養(yǎng)物ph低于7.0時，進(jìn)行結(jié)果判定。此時，肉眼觀察陰性対照孔培養(yǎng)液顏色與陽性對照孔顏色有明顯差別。
判定標(biāo)準(zhǔn)：將不變色孔的待檢樣品最高稀釋倍數(shù)判定為所述待檢樣品的效價。
不變色孔是指其中的培養(yǎng)物顏色與陽性對照孔的顏色不同的孔。
b免疫攻毒保護(hù)法
疫苗免疫后每1周隨機(jī)抽取8只免疫組雞，連同對照組雞6只，在2~3m2的密室（室內(nèi)溫度為15~30℃，相對濕度為50%~70%）內(nèi)噴霧攻擊雞毒支原體r株培養(yǎng)物500~600ml（每1.0ml含活菌數(shù)108.0~109.0顏色變化單位），噴霧時間應(yīng)不少于5分鐘，霧滴在2.0um左右。觀察14日，剖檢，觀察氣囊病變，并進(jìn)行記分。對照組應(yīng)至少有4只雞的氣囊出現(xiàn)2分以上的病變，免疫雞的平均氣囊保護(hù)率應(yīng)≥60%，計算攻毒保護(hù)率。
3.結(jié)果
3批雞毒支原體滅活疫苗，同時應(yīng)用本發(fā)明方法和免疫攻毒保護(hù)法進(jìn)行疫苗效力測定，結(jié)果見表1。
表1血清抗體水平與免疫攻毒法相關(guān)性
注：上表中每一個血清效價數(shù)據(jù)代表一組血清樣本效價平均值。
由以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，血清效價隨免疫時間延長而逐漸上升，至免后5周達(dá)到高峰，且免后6周繼續(xù)維持，符合機(jī)體抗體產(chǎn)生的一般規(guī)律。本發(fā)明方法效價檢測范圍是20-25，最高與最低之間的差異是32倍，檢測結(jié)果精確度高，三批疫苗檢測的結(jié)果大致相同，批間差異小。
應(yīng)用本發(fā)明方法和免疫攻毒保護(hù)法同時對3批疫苗進(jìn)行效力測定，對比本發(fā)明方法血清效價與攻毒保護(hù)率結(jié)果，初步建立了雞毒支原體檢測用抗原活菌滴度1000ccu/ml時，兩種方法檢測疫苗效力的對應(yīng)關(guān)系：當(dāng)血清效價為23.88時，攻毒保護(hù)率可達(dá)到63%，證明疫苗效力檢驗(yàn)合格。本發(fā)明方法測定的血清效價與免疫攻毒保護(hù)率呈正相關(guān)。
實(shí)施例2本發(fā)明方法對多種雞毒支原體疫苗進(jìn)行效力測定
疫苗1：雞毒支原體滅活疫苗（cr株）；疫苗2：雞毒支原體滅活疫苗（r株）；疫苗3：雞毒支原體活疫苗（f36株），疫苗4：雞毒支原體活疫苗（mg6/85株）；疫苗5：雞毒支原體活疫苗（ts-11株），五種疫苗市場均有售。
使用雞毒支原體疫苗參照使用說明書免疫40~60日齡spf雞，8羽/組，同時設(shè)置不免疫組6羽作為對照，免疫后30天無菌采集翅靜脈血分離血清。同實(shí)施例1中本發(fā)明方法，分別測定5種雞毒支原體疫苗效力，結(jié)果如下表2。
表2不同雞毒支原體疫苗效力測定結(jié)果（3d判定）
應(yīng)用本發(fā)明方法對5種疫苗樣品重復(fù)檢測3次，結(jié)果見表3。
表3不同疫苗效力測定結(jié)果（3d判定）
注：上表中每一個血清效價數(shù)據(jù)代表一組血清樣本效價平均值。
表2、3結(jié)果顯示，本發(fā)明方法對5種不同菌株的雞毒支原體疫苗進(jìn)行效力測定，各重復(fù)3次，3次檢測的結(jié)果基本一致，重復(fù)性好；血清抗體水平最高為疫苗1，效力平均值為24.59；疫苗2次之，效力平均值為24.21；疫苗4、5次之，效力平均值24.17；最低為疫苗3，效力平均值為23.95。本發(fā)明方法可以用于測定不同菌株的雞毒支原體疫苗效力，適用范圍廣。
實(shí)施例3不同判定時間對本發(fā)明方法結(jié)果的影響
將實(shí)施例2中已判定結(jié)果的96孔細(xì)胞板，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)至14d，每24h記錄一次結(jié)果。見表4。
表4不同判定時間對結(jié)果的影響
注：上表中每一個血清效價數(shù)據(jù)代表一組血清樣本效價平均值。
結(jié)果顯示，培養(yǎng)1～2天各孔均未變色，疫苗1～5血清效價均為25，不能判定結(jié)果；培養(yǎng)3～5d，陽性孔全變色，疫苗1～5血清效價有明顯區(qū)別，可判定結(jié)果；培養(yǎng)6～10d，疫苗1～5血清效價均為20，培養(yǎng)11～14d，疫苗1～5血清效價均為0，結(jié)果無差別。本發(fā)明方法中判定時間對結(jié)果的判定有較大的影響，本次試驗(yàn)檢測用抗原活菌滴度1000ccu/ml，判定時間3～5d。
多次試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證了本發(fā)明方法與常規(guī)的中和試驗(yàn)不同：中和試驗(yàn)抗原與抗體發(fā)生特異性結(jié)合產(chǎn)生抗原抗體復(fù)合物，抗原不再具備生長能力；本發(fā)明方法支原體與血清發(fā)生結(jié)合，抗原仍具有生長能力。產(chǎn)生上述情況的原因目前仍不清楚。不受理論束縛，發(fā)明人推測認(rèn)為本發(fā)明方法支原體與血清發(fā)生結(jié)合不是血清抗體對雞毒支原體抗原進(jìn)行了中和，而是抑制其生長，抗原仍具有生長能力，也有繼續(xù)生長的空間，隨著培養(yǎng)時間延長，當(dāng)雞毒支原體生長數(shù)量或能力突破血清抗體的抑制作用后，仍會繼續(xù)生長致使培養(yǎng)孔變色。
本發(fā)明方法是利用血清抗體抑制雞毒支原體抗原生長的特性實(shí)現(xiàn)的，在特定時間內(nèi)，可實(shí)現(xiàn)對雞毒支原體疫苗效力的定量檢測。
需要說明的是，本發(fā)明各實(shí)施例中均使用了某一活菌滴度來確定了結(jié)果判定的時間，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，豬肺炎支原體檢測用抗原活菌滴度與判定時間存在相關(guān)性。當(dāng)作為抗原的活菌滴度越高時，進(jìn)行判定的開始時間越短。例如，當(dāng)采用本發(fā)明實(shí)施例3所示的抗原活菌滴度，即1000ccu/ml時，判定時間為培養(yǎng)開始后第3天，但是當(dāng)采用更高滴度的抗原活菌時，則上述判定時間開始的時間將會進(jìn)一步縮短。
以上所述僅為本發(fā)明應(yīng)用較好的實(shí)施例而已，不能用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。