專利名稱：：牛支原體疫苗的制作方法牛支原體疫苗相關(guān)申請(qǐng)本申請(qǐng)要求2007年10月29日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)60/983，482和2008年6月25日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)61/075，552的優(yōu)先權(quán)，這些申請(qǐng)的教導(dǎo)和內(nèi)容引入本文做參考。序列表本申請(qǐng)包含紙件形式和計(jì)算機(jī)可讀形式的序列表，其教導(dǎo)和內(nèi)容引入本文做參考。背景牛支原體(Mycoplasmabovis,M.bovis)被認(rèn)為是支原體屬中較有致病性的物種之一，它在全世界范圍內(nèi)導(dǎo)致顯著的經(jīng)濟(jì)損失。支原體在所有年齡段的牛(cattle)中引起嚴(yán)重的臨床癥狀。牛支原體是被發(fā)現(xiàn)引起牛的肺炎(pneumonia)、乳腺炎(mastiffs)、以及關(guān)節(jié)炎(arthritis)的最常見(jiàn)支原體病原，其病因?qū)W角色還與母牛(cows)和公牛(bulls)的耳炎(otitis)、角膜結(jié)膜炎(keratoconjuctivitis)、滑膜炎(synovitis)、以及生殖疾病(r印roductivedisorder)相關(guān)。一般而言，支原體很難治，因?yàn)樗鼈內(nèi)狈?xì)胞壁或膜，使得它們耐受多類常用的廣譜抗生素治療。支原體區(qū)別于病毒之處在于，支原體比大多數(shù)病毒大，其通過(guò)附著細(xì)胞表面并破壞該表面而不是進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部來(lái)?yè)p傷組織。被牛支原體感染的動(dòng)物免疫應(yīng)答水平降低，可出現(xiàn)諸如發(fā)燒、抑郁癥(expression)、厭食(anorexia)、呼吸吃力(laboredbreathing)、、流鼻涕、流目艮淚(nasalandoculardischarge)、咳嗽、打噴嚏(sneezing)、喘(gasping)、打呼嚕(grunting)、跛(lameness)和關(guān)節(jié)腫脹(swollenjoints)、乳腺炎、中耳感染、流產(chǎn)(abortion)、慵懶(recumbence)和死亡等等牛支原體感染癥狀。這種生物在不潔的溫暖潮濕環(huán)境中能存活很長(zhǎng)時(shí)間。支原體能在奶中存活，在因響應(yīng)于感染而出現(xiàn)大量白細(xì)胞的情況下甚至可能茁壯成長(zhǎng)。本領(lǐng)域有多篇文獻(xiàn)披露牛支原體疫苗。專利6，548，069披露了一種疫苗組合物，其摻入了含有至少兩種殺滅的牛支原體菌株的全細(xì)胞滅活菌苗(inactivatedbacterin)0能找到的其它文獻(xiàn)披露了將牛支原體菌株傳代不到10次以制備滅活疫苗，但它們未描述將傳染性或病原性牛支原體菌株通過(guò)連續(xù)傳代而減毒、或者將任何這類減毒活牛支原體菌株作為無(wú)毒力活培養(yǎng)疫苗的基本成分?，F(xiàn)有技術(shù)未發(fā)現(xiàn)，殺滅的牛支原體在減輕與牛支原體感染有關(guān)的臨床癥狀嚴(yán)重程度方面并不是有效的。即使是低水平傳代也不能產(chǎn)生能導(dǎo)致臨床癥狀大大減輕的高效的疫苗?，F(xiàn)有的極少數(shù)較少傳代的(lowpassage)滅活牛支原體疫苗未顯示出使臨床癥狀嚴(yán)重程度大幅降低。此外，與將多次傳代的(highpassage)牛支原體減毒菌株用作免疫原性組合物或疫苗組合物的想法相比，上述‘069專利的教導(dǎo)是完全背道而馳的，它指出“因支原體分離物在培養(yǎng)中可能快速改變其抗原，傳了50代以上的多次傳代的菌株當(dāng)用在本發(fā)明的菌苗中時(shí)可能失去感染力，并激發(fā)較弱的免疫應(yīng)答。因此，優(yōu)選應(yīng)用新鮮分離的菌株或者經(jīng)過(guò)培養(yǎng)但仍有毒力的菌株；即，保留了感染宿主動(dòng)物的能力的菌株。雖然不清楚關(guān)鍵的傳代次數(shù)是多少，但本發(fā)明優(yōu)選用那些在大規(guī)模生產(chǎn)前傳代不超過(guò)大約104次、優(yōu)選僅傳代大約5次以下的支原體菌株來(lái)開(kāi)始。我們相信，通過(guò)采用在培養(yǎng)中傳代較少次數(shù)的菌株，能保留抗原的天然狀態(tài)，因此能激發(fā)出抵抗感染性微生物的保護(hù)性免疫應(yīng)答?！毕鄳?yīng)地，本領(lǐng)域需要有效激發(fā)抗牛支原體的免疫應(yīng)答的免疫原性組合物。還需要有效減輕牛支原體感染癥狀的嚴(yán)重程度或減少牛支原體感染癥狀的發(fā)生率的免疫原性組合物。還需要有效減少或消除牛支原體感染癥狀的發(fā)生率的疫苗。還需要能安全給予有需要的動(dòng)物、有效減輕牛支原體感染癥狀的嚴(yán)重程度或減少牛支原體感染癥狀的發(fā)生率的免疫學(xué)組合物。還需要誘導(dǎo)交叉保護(hù)的上述免疫學(xué)組合物，而且所述組合物激發(fā)針對(duì)與所述組合物中所用菌株或分離物不同的牛支原體菌株和分離物的免疫應(yīng)答。還需要適于單劑或兩劑或多劑(先初次劑量再加強(qiáng)劑量)免疫接種方案的安全有效的免疫學(xué)組合物，適于且便于經(jīng)多種途徑給藥的免疫學(xué)組合物，以及能與其它免疫原和免疫學(xué)組合物相容以制備聯(lián)合疫苗的免疫學(xué)組合物。最后，還需要對(duì)有需要的動(dòng)物快速啟動(dòng)保護(hù)并提供長(zhǎng)期保護(hù)的上述免疫學(xué)組合物。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的免疫原性組合物或疫苗通過(guò)提供無(wú)毒力的和減毒的牛支原體菌株，優(yōu)選多次傳代的，能與可藥用或可獸用載體組合的菌株，以便能用做效力改進(jìn)的免疫原性組合物，使牛支原體感染的癥狀和/或牛支原體感染本身和/或發(fā)生率或嚴(yán)重程度，與野生型牛支原體菌株的感染相比，優(yōu)選還與現(xiàn)有疫苗相比而減輕。換而言之，給予了本發(fā)明疫苗的小牛(calves)發(fā)生牛支原體感染的風(fēng)險(xiǎn)較低，而且感染所致任何臨床癥狀都比未接受任何疫苗但感染了牛支原體、或接受了并非本發(fā)明的疫苗的動(dòng)物中的癥狀更不嚴(yán)重或更不明顯。此外，當(dāng)獸群中的動(dòng)物被給予了本發(fā)明的疫苗后，與未接種疫苗但感染的動(dòng)物相比，優(yōu)選與接種現(xiàn)有常規(guī)疫苗的動(dòng)物相比，被感染的動(dòng)物個(gè)數(shù)更少。有利的是，本發(fā)明的疫苗是穩(wěn)定、高效疫苗，既能快速啟動(dòng)保護(hù)作用，又能使保護(hù)作用維持較長(zhǎng)時(shí)間。根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)的教導(dǎo)，本發(fā)明的組合物提供的意外結(jié)果是，牛支原體菌株，優(yōu)選多次傳代的牛支原體菌株，作為免疫原性組合物的成分，是減毒的，有活力的，而且更高效的。本文公開(kāi)的發(fā)明提供無(wú)毒力的，以及減毒的牛支原體菌株或分離物，優(yōu)選多次傳代、給予動(dòng)物后能激發(fā)免疫應(yīng)答的牛支原體減毒菌株。有利的是，所述免疫應(yīng)答給施用了本發(fā)明組合物的動(dòng)物提供保護(hù)，使這些動(dòng)物個(gè)體與未接受所述組合物或接受了并非按照本發(fā)明制備的疫苗或組合物的動(dòng)物相比，出現(xiàn)牛支原體感染癥狀的風(fēng)險(xiǎn)更小，其癥狀更不嚴(yán)重或更不明顯。申請(qǐng)人:在此聲明，為了本發(fā)明的目的，術(shù)語(yǔ)“分離物，，和“菌株，，可互換使用，單個(gè)菌株或分離物之間的差異可以用DNA指紋技術(shù)來(lái)分辨(即，不同菌株或分離物具有不同指紋)。在一個(gè)實(shí)施方案中，公開(kāi)了包含多次傳代的牛支原體菌株和可藥用載體的免疫原性組合物。優(yōu)選，所述牛支原體菌株是減毒的和無(wú)毒力的。本發(fā)明的免疫原性組合物在牛(cattle)中產(chǎn)生抗牛支原體感染的免疫應(yīng)答。因給予所述免疫原性組合物而生成或誘導(dǎo)的抗牛支原體感染的免疫應(yīng)答大大減輕了牛支原體感染癥狀的嚴(yán)重程度或減少了其發(fā)生率。在另一實(shí)施方案中，公開(kāi)了制備免疫原性組合物的方法，所述組合物包括多次傳代的牛支原體菌株，優(yōu)選多次傳代的、減毒、無(wú)毒力牛支原體菌株。在另一實(shí)施方案中，公開(kāi)了用所述免疫原性組合物在小牛中刺激快速、長(zhǎng)效血清學(xué)體液免疫應(yīng)答、并因此針對(duì)疾病提供保護(hù)作用的方法。在另一實(shí)施方案中，公開(kāi)了通過(guò)給予有效量的本發(fā)明免疫原性組合物使小牛對(duì)牛支原體感染產(chǎn)生免疫力的方法。本發(fā)明的免疫原性組合物或疫苗組合物給予小牛后，用野生型牛支原體菌株攻擊，表現(xiàn)出牛支原體感染癥狀減少，包括通常與牛支原體感染有關(guān)的臨床癥狀、肺病理學(xué)、跛、關(guān)節(jié)病理學(xué)減少。特別是，在疫苗接種組觀察到肺病理學(xué)減輕，關(guān)節(jié)臨床癥狀和與之相關(guān)的跛大大減輕。在本發(fā)明另一實(shí)施方案中，公開(kāi)了減少牛支原體感染的癥狀的方法，優(yōu)選通過(guò)施用本發(fā)明所述和/或本申請(qǐng)所公開(kāi)的任一種減毒的、無(wú)毒力的牛支原體細(xì)菌來(lái)實(shí)現(xiàn)。牛支原體感染癥狀的減輕通過(guò)給予本發(fā)明的免疫原性組合物來(lái)實(shí)現(xiàn)。在本發(fā)明一優(yōu)選實(shí)施方案中，給小牛施用三種活疫苗或免疫原性組合物之一，其中每一種均含有多次傳代的減毒牛支原體菌株和可藥用載體。所述牛支原體多次傳代的菌株優(yōu)選傳代10次以上，優(yōu)選至少20次，更優(yōu)選至少30次，還更優(yōu)選至少40次，更優(yōu)選至少50次，還更優(yōu)選至少55次，更優(yōu)選至少60次，還更優(yōu)選至少70次，更優(yōu)選至少80次，還更優(yōu)選至少90次，更優(yōu)選至少95次，還更優(yōu)選至少100次，更優(yōu)選至少102次，最優(yōu)選至少106次，優(yōu)選在體外的細(xì)胞培養(yǎng)中傳代。所述疫苗或免疫原性組合物中用到的牛支原體菌株可以是任何菌株或分離物。三種代表性菌株包括052823A106，2007年10月16日按布達(dá)佩斯條約保藏在ATCC(Manassas，VA)，保藏號(hào)PTA-8694；05249A102,2007年10月16日按布達(dá)佩斯條約保藏在ATCC(Manassas，VA)，保藏號(hào)PTA8696；0519021B106，2007年10月16日按布達(dá)佩斯條約保藏在ATCC(Manassas,VA)，保藏號(hào)PTA8695。這三種菌株在傳代前都是致病性的，但如上述傳代后，特別是傳代100次以上之后，所得菌株變?yōu)闇p毒、無(wú)毒力的，并且在接受所述菌株的免疫原性組合物的動(dòng)物中產(chǎn)生免疫應(yīng)答。隨后用得自天然爆發(fā)的疾病的牛支原體分離物攻擊小牛。在本文所述的所有情況中，所述攻擊分離物具有與用于接種疫苗的分離物不同的“指紋”(下文將確認(rèn))(即異源攻擊)。有利的是，給予經(jīng)傳代的菌株導(dǎo)致的免疫應(yīng)答使得用致病性菌株或野生型牛支原體菌株攻擊后，牛支原體感染的臨床癥狀嚴(yán)重程度減輕和/或發(fā)生率下降。因此，本發(fā)明另一方面涉及ATCC保藏號(hào)為PTA-8694、PTA8695、或PTA8696的任一種減毒牛支原體菌株，優(yōu)選也涉及上述任一種保藏的牛支原體菌株的任何下述減毒后代牛支原體菌株，它們可用在免疫原性組合物中，具有改進(jìn)的效力，使得牛支原體感染癥狀和/或牛支原體感染本身和/或發(fā)生率或嚴(yán)重程度，與野生型牛支原體菌株感染相比，優(yōu)選也與現(xiàn)有疫苗相比而減輕，并具有快速啟動(dòng)保護(hù)作用和提供長(zhǎng)期保護(hù)作用的高效力。本發(fā)明另一方面還提供本文所述免疫原性組合物，其包含以ATCC保藏號(hào)PTA-8694、PTA8695、或PTA8696保藏的任一種減毒牛支原體菌株，或上述任一種保藏的牛支原體菌株任何減毒的后代牛支原體菌株。優(yōu)選包含以ATCC保藏號(hào)PTA-8694、PTA8695、或PTA8696保藏的任一種減毒牛支原體菌株的免疫原性組合物?？梢圆捎蒙鲜鋈我环N具體的牛支原體菌株。而且，本發(fā)明還涉及本文所述任一種特異性減毒牛支原體菌株的獸用用途，例如用于減少牛支原體的致病性菌株或野生型菌株攻擊后牛支原體感染臨床癥狀的嚴(yán)重程度和/或發(fā)生率。本發(fā)明另一方面還涉及與以ATCC保藏號(hào)PTA-8694、PTA8695、或PTA8696保藏的6牛支原體菌株具有相同特性的減毒牛支原體。術(shù)語(yǔ)“與以ATCC保藏號(hào)PTA-8694、PTA8695、或PTA8696保藏的牛支原體菌株具有相同特性”是指，所述菌株是減毒的，經(jīng)皮下或鼻內(nèi)途徑給小牛施用一劑2.1E9CFU后的14天內(nèi)，能在小牛中引起體液免疫應(yīng)答，且不引起通常由致病性牛支原體野生型菌株感染引起的臨床癥狀。作為一種參考方法，體液免疫應(yīng)答采用BIOVET牛支原體ELISA-試劑盒按說(shuō)明書進(jìn)行測(cè)定。優(yōu)選，這些菌株每一種都在經(jīng)皮下或鼻內(nèi)途徑給小牛施用一劑2E9CFU后的14天內(nèi)誘導(dǎo)出體液免疫應(yīng)答，該應(yīng)答的相對(duì)ELISA評(píng)分在BIOVET牛支原體ELISA試劑盒中用該試劑盒提供的方法測(cè)定、并以光密度(0.D.)讀數(shù)表示時(shí)，為至少1.5。本發(fā)明的組合物可以用任何常規(guī)方式施用。施用方式的例子包括任何能使免疫系統(tǒng)的細(xì)胞接觸免疫原性組合物的方式口服，經(jīng)皮/皮內(nèi)，靜脈，皮下，肌肉，眼內(nèi)(intraocular),Mfix.(intraperitoneal),(intrarectal),(intravaginal),Sl內(nèi)，胃內(nèi)，氣管內(nèi)(intratracheal)，肺內(nèi)(intrapulmonarial)，或它們的任何組合。施用方式優(yōu)選肌肉，皮下和鼻內(nèi)，特別優(yōu)選皮下和鼻內(nèi)。需要時(shí)或必要時(shí)，可以間隔不同時(shí)間給予一或多次加強(qiáng)免疫。施用這樣的疫苗后，在所述動(dòng)物體內(nèi)激起免疫應(yīng)答，當(dāng)用有毒力的牛支原體攻擊后，能減少暴露于野生型菌或分離物時(shí)牛支原體感染癥狀的發(fā)生率和/或嚴(yán)重程度。此外，本發(fā)明的疫苗或免疫原性組合物對(duì)于為減毒目的進(jìn)行傳代、并隨后被用作抗原成分的菌株以外的牛支原體菌株表現(xiàn)出有效的交叉保護(hù)作用。在優(yōu)選實(shí)施方式中，所述疫苗的劑量體積不超過(guò)5ml，更優(yōu)選不超過(guò)3ml，更優(yōu)選不超過(guò)2ml。在最優(yōu)選實(shí)施方案中，所述劑量為2ml，優(yōu)選鼻內(nèi)施用，每個(gè)鼻孔Iml，還更優(yōu)選皮下施用，最優(yōu)選在同一次作為單個(gè)劑量對(duì)鼻內(nèi)和皮下都施用。在一些優(yōu)選形式中，在第一次施用后，第二次或隨后施用所述免疫原性組合物。所述隨后施用優(yōu)選發(fā)生在首次施用的至少10天后，更優(yōu)選至少10-32天之間，更優(yōu)選至少12-30天之間，更優(yōu)選至少14天，最優(yōu)選至少14-28天之間。在最優(yōu)選形式中，所述疫苗既可以是在第0天作為單個(gè)劑量施用，或者，在備選形式中，在第0天施用，并在14-28天后未暴露于病原性牛支原體的期間施用，直至免疫接種方案完成后。在最優(yōu)選形式中，無(wú)需加強(qiáng)免疫，所述疫苗僅施用一次。接種這種疫苗的動(dòng)物從1日齡到成年都可，優(yōu)選從1日齡到2歲的幼年小牛，更優(yōu)選從1日齡到16周齡的小牛，最優(yōu)選從6周齡到12周齡的小牛。這樣的施用如下述減少牛支原體感染癥狀。事實(shí)上，本文所述研究表明，如上述免疫的接種組與未接種組相比，牛支原體感染癥狀減少至少50%，更優(yōu)選至少60%，還更優(yōu)選至少70%，還更優(yōu)選至少75%。驗(yàn)尸后，進(jìn)行肺部病理學(xué)評(píng)估，特別是，按照針對(duì)不同物種的評(píng)分慣例，對(duì)因牛支原體引起損傷所導(dǎo)致的肺實(shí)變(lungconsolidation)評(píng)出百分比，發(fā)現(xiàn)與未接種組相比，減少至少33%，更優(yōu)選至少50%，還更優(yōu)選至少70%，還更優(yōu)選至少80%，還更優(yōu)選至少90%，最優(yōu)選至少95%。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明疫苗與合適的佐劑(adjuvant)組合?！白魟痹诒疚闹锌砂?，氫氧化鋁和磷酸鋁，皂苷(saponins)如QuilA、QS_21(CambridgeBiotechInc.,CambridgeMA)、GPI-0100(GalenicaPharmaceuticals,Inc.,Birmingham,AL),油包水乳劑，水包油乳劑，水包油包水乳劑。所述乳劑尤其可以基于輕質(zhì)液體石蠟油(lightliquidparaffinoil)(W^MM^(EuropeanPharmacopea))；—烯(isoprenoid)油如角鯊?fù)?squalane)或角鯊烯(squalene)；烯烴(alkenes)尤其異丁烯(isobutene)或癸烯(decene)寡聚化產(chǎn)生的油；含有線性烷基的酸或醇的酯，更尤其是植物油，乙基油酸酯，丙二醇二-(辛酸酯/癸酸酯)，甘油三-(辛酸酯/癸酸酯)或丙二醇二油酸酯；支鏈脂肪酸或醇的酯，尤其異硬脂酸酯。油與乳化劑聯(lián)用以形成乳液。乳化劑優(yōu)選非離子表面活性劑，尤其山梨聚糖酯，二縮甘露醇酯(如無(wú)水甘露醇油酸酯(anhydromarmitololeate))，乙二醇酯，聚甘油酯，丙二醇酯以及油酸酯，異硬脂酸酯，蓖麻油酸(ricinoleic)酯或羥基硬脂酸酯(它們都可選乙氧基化)，和聚氧亞丙基(polyoxypropylene)-聚氧亞乙基(polyoxyethyIene)嵌段共聚物(copolymerblock)，尤其Pluronic產(chǎn)品，特另Ij是L121。見(jiàn)Hunter等，TheTheoryandPracticalApplicationofAdjuvants(Ed.Stewart-Tul1,D.E.S.).JohnffileyandSons,NY,pp51_94(1995)禾口Todd等，Vaccine15:564_570(1997)。例如，有可能使用SPT乳液和MF59乳液，前者見(jiàn)〃VaccineDesign,TheSubunitandAdjuvantApproach"第147頁(yè)，Μ.Powell禾口Μ·Newman編，PlenumPress,1995,后者見(jiàn)該書第183頁(yè)。佐劑的另一個(gè)例子是從丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物以及馬來(lái)酐(maleicanhydride)和鏈烯基衍生物的共聚物中選出的化合物。有利的佐劑化合物是交聯(lián)的丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物，尤其是與糖的聚鏈烯基醚(polyalkenylether)或聚醇交聯(lián)的聚合物。這些化合物被稱為卡波姆(carbomer)(PhameuropaVol.8，No.2，June1996)。本領(lǐng)域技術(shù)人員也可以參見(jiàn)美國(guó)專利2，909，462，其描述了與聚羥基化合物交聯(lián)的這種丙烯酸聚合物，所述聚羥基化合物帶有至少3個(gè)羥基，優(yōu)選不超過(guò)8個(gè)，所述至少3個(gè)羥基的氫原子被具有至少2個(gè)碳原子的不飽和脂肪族基團(tuán)(radical)替換。優(yōu)選的基團(tuán)是含有2-4個(gè)碳原子的那些，例如乙烯基，烯丙基和其它亞乙基化不飽和基團(tuán)(ethylenicallyunsaturatedgroup)。這種不飽和的基團(tuán)自身可包含其它取代基，如甲基。以卡巴普(Carbopol)；(BFGoodrich,Ohio,USA)的名稱出售的產(chǎn)品尤其合適。它們與烯丙基蔗糖交聯(lián)或與烯丙基季戊四醇交聯(lián)。其中可提及卡巴普974P，934P和971P。最優(yōu)選使用卡巴普971P。在馬來(lái)酐與鏈烯基衍生物的共聚物中，優(yōu)選馬來(lái)酐與乙烯(ethylene)的共聚物EMA(Monsanto)。這些聚合物溶于水形成酸性溶液，可以對(duì)其進(jìn)行中和，優(yōu)選中和至生理pH，從而提供可以摻入免疫原性、免疫性或疫苗性組合物的佐劑溶液。其它合適的佐劑包括，但不限于，RIBI佐劑系統(tǒng)(RibiInc.)、Blockco-polymer(CytRx,AtlantaGA)、SAF-M(Chiron,EmeryvilleCA)、單磷酰脂質(zhì)A(monophosphoryllipidA)、阿夫立定(Avridine)脂-胺佐劑、大腸埃希氏菌不耐熱腸毒素(重組型或其它形式)、霍亂毒素、IMS1314或胞壁酰二肽(muramyldip印tide)，或者天然或重組的細(xì)胞因子或其類似物，或內(nèi)源細(xì)胞因子釋放的刺激物，等等。優(yōu)選，佐劑添加量為約100μg-約Ig/劑。還更優(yōu)選佐劑添加量為約100μg_約500mg/劑。還更優(yōu)選佐劑添加量為約500μg-約250mg/劑。還更優(yōu)選佐劑添加量為約750μg-約IOOmg/劑。還更優(yōu)選佐劑添加量為約Img-約50mg/劑。還更優(yōu)選佐劑添加量為約Img-約IOmg/劑。最優(yōu)選佐劑添加量為約Img/齊U。此外，本發(fā)明的免疫原性組合物和疫苗組合物可包括一或多種可獸用載劑。本文中，“可獸用載劑”包括任何和所有的溶劑，分散介質(zhì)，包衣(coating)，佐劑，穩(wěn)定劑，稀釋劑，保存劑，抗細(xì)菌劑和抗真菌劑，等滲劑，吸收延遲劑，等等。在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，尤其在那些包括凍干免疫原性組合物的方案中，本發(fā)明所用的穩(wěn)定劑包括用于凍干(lyophilization或freezedrying)的穩(wěn)定劑?！跋♂寗笨砂ㄋ}水，葡萄糖(dextrose)，乙醇，甘油等。等滲劑可包括氯化鈉，葡萄糖，甘露醇，山梨醇和乳糖等。穩(wěn)定劑包括乙二氨四乙酸的鋁和堿金屬鹽等?！懊庖咴越M合物或免疫學(xué)組合物”是指包含至少一種抗原的組合物，其在已有抗目標(biāo)組合物或疫苗的細(xì)胞性和/或抗體介導(dǎo)性免疫應(yīng)答的宿主體內(nèi)激發(fā)免疫應(yīng)答。通常，“免疫應(yīng)答”包括但不限于一或多種以下效應(yīng)產(chǎn)生或活化特異性針對(duì)所述目標(biāo)組合物或疫苗中所含一或多種抗原的抗體、B細(xì)胞、輔助性T細(xì)胞、抑制性T細(xì)胞、和/或細(xì)胞毒T細(xì)胞和/或gamma-deltaT細(xì)胞。優(yōu)選，宿主表現(xiàn)出治療性免疫應(yīng)答或保護(hù)性免疫應(yīng)答，結(jié)果增強(qiáng)對(duì)新感染的抵抗力和/或減少疾病的臨床嚴(yán)重程度。如果通常出現(xiàn)在受感染宿主中的臨床癥狀減少或未出現(xiàn)，或者，受感染宿主的恢復(fù)時(shí)間加快和/或感染持續(xù)時(shí)間縮短或者組織或體液或排出液中的菌滴度降低，都可以確認(rèn)有這類保護(hù)作用?！芭Ｖгw感染癥狀”是指因牛支原體引起的感染或疾病的表現(xiàn)，包括受野生型牛支原體感染的牛所通常經(jīng)歷的臨床癥狀和病理表現(xiàn)。感染或疾病的這些癥狀可以有多種形式，包括但不限于，發(fā)燒、抑郁癥、厭食、呼吸吃力、流鼻涕和流眼淚、咳嗽、打噴嚏、喘、打呼嚕、跛和關(guān)節(jié)腫脹、中耳感染、內(nèi)耳炎癥有排出物、流產(chǎn)和其它生殖疾病、慵懶、呼吸道感染、歪頭(headtilt)、共濟(jì)失調(diào)(ataxia)、關(guān)節(jié)炎、乳腺炎、耳炎、角膜結(jié)膜炎、滑膜炎、胸膜炎(pleuritis)、肺損傷、肺實(shí)變和肺內(nèi)形成節(jié)結(jié)、滑液增加、關(guān)節(jié)囊增厚、以及甚至死亡。“多次傳代的菌株”在本文中是指，已在體外細(xì)胞培養(yǎng)中傳代10次以上，優(yōu)選至少20次，更優(yōu)選至少30次，還更優(yōu)選至少40次，更優(yōu)選至少50次，還更優(yōu)選至少55次，更優(yōu)選至少60次，還更優(yōu)選至少70次，更優(yōu)選至少80次，還更優(yōu)選至少90次，更優(yōu)選至少95次，還更優(yōu)選至少100次，更優(yōu)選至少102次，最優(yōu)選至少106次的牛支原體菌株?！胺尾坎±韺W(xué)評(píng)估(LungPathologyAssessment)”是指，驗(yàn)尸后對(duì)肺的觀察，包括但不限于，評(píng)估實(shí)變(consolidation)，損傷，和節(jié)結(jié)形成，以及評(píng)估胸腔(thoraciccavity)包括胸膜炎和積液(fluidaccumulation)?！皽p毒”是指減小病原體的毒力。在本發(fā)明中，“減毒”與“無(wú)毒力的”是同義詞。在本發(fā)明中，減毒菌是毒力已減弱因而不引起牛支原體感染的臨床癥狀但能在目標(biāo)動(dòng)物中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的微生物，也可指受減毒牛支原體感染的動(dòng)物與受非減毒牛支原體感染且未接受所述減毒病毒的“對(duì)照組”動(dòng)物相比，臨床癥狀的發(fā)生率或嚴(yán)重程度減小。在該語(yǔ)境中，術(shù)語(yǔ)“減少/減小”是指如上述與對(duì)照組相比，減少至少10%，優(yōu)選25%，還更優(yōu)選50%，最優(yōu)選100%以上。因此，經(jīng)減毒的無(wú)毒力牛支原體菌株適于摻入包含經(jīng)修飾的活牛支原體菌的免疫原性組合物。為本發(fā)明目的的“有效量”是指免疫原性組合物能誘導(dǎo)出免疫應(yīng)答的量，所述免疫應(yīng)答是減少動(dòng)物體內(nèi)牛支原體感染的發(fā)生率或減輕其嚴(yán)重程度的免疫應(yīng)答。特別地，有效量是指，每劑10E3至10E10、優(yōu)選至10E6至10E10菌落形成單位(CFU)。“改進(jìn)的效力，使得與現(xiàn)有疫苗相比，當(dāng)疫苗接種者暴露于牛支原體或被野生型牛支原體菌株感染時(shí)，與牛支原體感染相關(guān)的臨床癥狀和/或牛支原體感染本身減輕”是指，將本發(fā)明的經(jīng)過(guò)多次傳代的菌株制得的疫苗與本發(fā)明之前的牛支原體疫苗相比，牛支原體感染的臨床癥狀的發(fā)生率或嚴(yán)重程度減小。在該語(yǔ)境中，未接種的動(dòng)物，或者用本發(fā)明之前的牛支原體疫苗接種的動(dòng)物，其牛支原體感染的臨床癥狀比接種本發(fā)明所述牛支原體免疫原性組合物的動(dòng)物更嚴(yán)重或多流行(prevalent)至少30%，可能最多更優(yōu)選至少40%，更優(yōu)選至少50%，還更優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少70%，還更優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少80%，還更優(yōu)選至少85%，更優(yōu)選至少90%，最優(yōu)選至少95%?！伴L(zhǎng)期保護(hù)作用(Long-lastingprotection)，，應(yīng)該是指，“改進(jìn)的效力”在肉牛(beefanimals)中持續(xù)至少3周，更優(yōu)選至少6個(gè)月，更優(yōu)選至少1年，還更優(yōu)選至少2年，在奶牛(dairyanimals)中持續(xù)至少6個(gè)月，更優(yōu)選至少1年，更優(yōu)選至少2年，更優(yōu)選至少3年，還更優(yōu)選至少4年。更優(yōu)選，對(duì)肉牛的長(zhǎng)期保護(hù)作用應(yīng)持續(xù)直至肉牛上市售肉的平均年齡，對(duì)奶牛的長(zhǎng)期保護(hù)作用應(yīng)持續(xù)直至奶牛不再產(chǎn)奶的年齡。術(shù)語(yǔ)“需要所述給藥”或“需要所述給藥治療”在本文中是指，給藥/治療與增強(qiáng)或改善接受本發(fā)明免疫原性組合物的動(dòng)物的健康或任何其它有利健康的醫(yī)療效果有關(guān)。"DNA指紋分析”在本文中是指，按W02008-030619所述，通過(guò)擴(kuò)增插入序列之間的DNA和測(cè)量擴(kuò)增產(chǎn)生的模式(pattern)來(lái)快速鑒定細(xì)菌菌株。簡(jiǎn)言之，用PCR和一組針對(duì)細(xì)菌插入序列(可轉(zhuǎn)座元件)設(shè)計(jì)的外向性引物，產(chǎn)生細(xì)菌性物種分離物特有的模式。這些模式然后可與諸如流行病學(xué)或發(fā)展史(Phylogeny)等信息進(jìn)行比較。DNA指紋分析的一種優(yōu)選方法利用PCR和一組針對(duì)單個(gè)或多個(gè)細(xì)菌插入序列設(shè)計(jì)的外向性引物。這樣的方法從鄰接IS產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物。PCR擴(kuò)增完成后，將產(chǎn)物分離(瓊脂凝膠)，按照細(xì)菌性物種分離物特有的擴(kuò)增產(chǎn)物的分子量，得到電泳帶模式。優(yōu)選的方法是用外向性引物進(jìn)行多重PCR。多重PCR是PCR的一個(gè)變化形式，它通過(guò)使用多套引物，能在一個(gè)反應(yīng)中同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)目標(biāo)。當(dāng)然，本領(lǐng)域已知的其它基于分子的指紋分析方法也是可以用的?！安迦胄蛄?IS)”是起可轉(zhuǎn)座元件的作用的短DNA序列。IS—般約700_2500bp長(zhǎng)，比其它類型的可轉(zhuǎn)座元件相對(duì)要小。它們編碼與轉(zhuǎn)座活性有關(guān)的蛋白，所述蛋白催化酶促反應(yīng)，使IS移動(dòng)。IS元件是特定物種特有的，或者可以在分類學(xué)組別中共有。這些插入序列常常有多個(gè)拷貝，但它們都位于特異性可轉(zhuǎn)座元件的特有位置。因此，本發(fā)明另一方面涉及如上述通過(guò)多次傳代或連續(xù)減毒而被減毒的牛支原體菌株作為藥物，優(yōu)選作為獸藥的用途。根據(jù)本發(fā)明另一方面，如上述減毒的牛支原體菌株可用于制備藥物組合物，所述組合物如本文所述可用于預(yù)防或治療牛支原體引起的感染。如上所述，這些藥物組合物/疫苗組合物可用于治療和/或預(yù)防對(duì)牛支原體感染易感的動(dòng)物。在本發(fā)明另一方面，是治療或預(yù)防方法，包括減輕牛群中野生型感染的發(fā)生率，或在給予了本發(fā)明免疫原性組合物的動(dòng)物中減少與野生型牛支原體感染有關(guān)的牛支原體感染癥狀的嚴(yán)重程度，是與未接種的動(dòng)物或與接種本發(fā)明之前的疫苗的動(dòng)物相比。進(jìn)一步地，給予本發(fā)明疫苗使牛群中被牛支原體感染的動(dòng)物的數(shù)量減少。這樣的方法一般性涉及，對(duì)需要這種治療的單個(gè)或一群受試者，給予治療有效量的、經(jīng)上述方法減毒的牛支原體菌株。優(yōu)選，與未接種的動(dòng)物或與接種了本發(fā)明之前的牛支原體免疫原性組合物、但隨后被野生型牛支原體感染的動(dòng)物相比，臨床癥狀在發(fā)生率或嚴(yán)重程度方面減少至少10%，更優(yōu)選減少至少20%，更優(yōu)選減少至少30%，還更優(yōu)選減少至少40%，更優(yōu)選減少至少50%，還更優(yōu)選減少至少60%，更優(yōu)選減少至少70%，還更優(yōu)選減少至少80%，更優(yōu)選減少至少90%，最優(yōu)選減少至少95%。圖1從鼻、扁桃體和肺樣品回收培養(yǎng)物的頻率(第0，14，28，35天及以后)圖2鼻、扁桃體和肺樣品的PCR檢測(cè)頻率(第0，14，28，35天及以后)圖3來(lái)自血清樣品的牛支原體特異性抗體的平均組評(píng)分(第0，14，28，35和42天)圖4活疫苗I，II，III組和無(wú)疫苗組(僅有SQ+IN)血清學(xué)的比較圖5活疫苗I組用不同施用途徑的血清學(xué)比較優(yōu)選實(shí)施方案詳述以下實(shí)施例代表了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案。但應(yīng)理解，本文任何內(nèi)容都不應(yīng)被當(dāng)作對(duì)本發(fā)明總體范圍的限制。實(shí)施例1該實(shí)施例評(píng)估了目標(biāo)物種中用兩種不同攻擊模式評(píng)估的實(shí)驗(yàn)性活牛支原體疫苗的效力。材料和方法使用35只禁食初乳(colostrumcbprived，CD)的4-8周齡Holstein小牛。所有動(dòng)物符合入選標(biāo)準(zhǔn)，即它們經(jīng)測(cè)試為牛支原體陰性，攻擊時(shí)健康狀況良好。首先將這些小牛隨機(jī)分為4組。組1-3各有9只小牛，組4有8只小牛。組1和2的小牛接種活疫苗1(活Vac1)，這是傳代106次的牛支原體分離物052823(05-2823-1A-3AP106+)(ATCCPTA-8694)的粗培養(yǎng)物，組3和4的小牛接種單獨(dú)的培養(yǎng)基。組1和2的疫苗分離物從天然爆發(fā)的疾病中分離，然后在牛支原體合適培養(yǎng)基中連續(xù)傳代106次。所述培養(yǎng)物在用事先確定的適當(dāng)量的接種培養(yǎng)物(seedculture)接種后在37°C培養(yǎng)24士2小時(shí)。分離物不經(jīng)稀釋便投入使用。接種前、后的平均濃度為2.1E9CFU/ml。所述疫苗皮下接種劑量為2ml，鼻內(nèi)接種劑量為2ml(每個(gè)鼻孔各Iml)。參與研究的所有小牛用有毒力的牛支原體攻擊，以誘導(dǎo)天然感染和疾病，組1和3接受較高劑量攻擊，組3和4接受較低劑量攻擊。測(cè)試物質(zhì)的劑量和給藥方案見(jiàn)表1概述。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>鼻拭子和血樣在第0、14、28、35、和42天時(shí)取得。尸檢時(shí)取肺部樣品，所有小牛都取扁桃體拭子(Tonsilswab)，有臨床異常的動(dòng)物取關(guān)節(jié)拭子(jointswab)0此外，有些表現(xiàn)出區(qū)域累及(areainvolvement)的動(dòng)物還從其它部位取樣。在所有病例中，三支無(wú)菌拭子圍繞所述區(qū)域擦拭數(shù)秒后取出，盡可能無(wú)菌操作。其中兩支拭子置于不同的裝有介質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)容器中，一支置于未裝介質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)容器中。表2概述了每只小牛所取的樣品。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>腿為了進(jìn)行微生物學(xué)測(cè)試，將拭子置于轉(zhuǎn)運(yùn)介質(zhì)中，組織樣品送去分離牛支原體。簡(jiǎn)言之，將拭子旋入5ml支原體選擇性肉湯(broth)中。從肺組織切取一小份樣品(約5mm)，在2ml支原體培養(yǎng)基中勻漿。將ΙΟΟμΙ勻漿物添加到所述支原體選擇性肉湯中。將培養(yǎng)物在37°C/5%C02中保溫。4-14天后，檢查肉湯的生長(zhǎng)情況，在培養(yǎng)板上進(jìn)行再培養(yǎng)(subculture)，以便進(jìn)行分離。所有陽(yáng)性再培養(yǎng)樣品在-70°C貯存。為進(jìn)行PCR，將每只小牛的未放入轉(zhuǎn)運(yùn)介質(zhì)中的拭子，還有組織樣品都送去提取DNA，用特異于牛支原體uvrC基因的引物和探針通過(guò)PCR進(jìn)行測(cè)試。PCR測(cè)試結(jié)果表示為牛支原體DNA檢測(cè)的陽(yáng)性或陰性。為進(jìn)行血清學(xué)測(cè)試，用商品化ELISA(Biovet,Canada)，按照其提供的方案，對(duì)血清樣品進(jìn)行測(cè)試。將ELISA結(jié)果表示為光密度(OD)讀取值。用該測(cè)試試劑盒中所含的陽(yáng)性對(duì)照確定陽(yáng)性水平(平均ODpxO.3)，將樣品的OD與該陽(yáng)性水平比較。再將陽(yáng)性結(jié)果用下表解釋<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>為了進(jìn)行組織學(xué)/IHC測(cè)試，將福爾馬林固定的組織用蘇木精/伊紅染色的玻片進(jìn)行測(cè)試，并用特異于牛支原體的單克隆抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)。為了進(jìn)行臨床測(cè)試，從第0天到第28天每天進(jìn)行總體觀察，然后從第28天到實(shí)施安樂(lè)死和尸檢期間每天進(jìn)行臨床觀察。將偏離正常的臨床觀察結(jié)果和總體觀察結(jié)果記錄在案。在尸檢中，檢查每只小牛的胸腔和氣管，記錄肉眼觀察結(jié)果。從每只小牛完整取出肺部和約6英寸的氣管，以備進(jìn)一步檢查和采樣。每一組肺都在背部表面和腹部表面拍照，每個(gè)畫面邊緣都配上合適的耳標(biāo)。為了檢查肺病理學(xué)，對(duì)每個(gè)肺葉進(jìn)行目測(cè)和觸診，以便確定每個(gè)肺葉有多少(以百分比計(jì))因牛支原體所致的病理學(xué)。然后將每個(gè)肺葉的百分比加權(quán)(weighted)并總和(summed)，以確定病理學(xué)肺的總百分比。關(guān)節(jié)病理學(xué)測(cè)試通過(guò)檢查受累關(guān)節(jié)并記錄目測(cè)結(jié)果來(lái)進(jìn)行。為進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，先將數(shù)據(jù)匯總。臨床癥狀和目測(cè)病理學(xué)(grosspathology)的減輕百分比用下式計(jì)算％減少=[1-(治療/非治療)]*100。此外，在第37天，因人為原因從第2和第3組各除去1個(gè)動(dòng)物，從第4組除去2個(gè)動(dòng)物。結(jié)果從第1天至第26天進(jìn)行攻擊前臨床評(píng)估。在該研究階段觀察到稀便/水便，抑郁癥，耳下垂(eardroop)，和昏睡(lethargy)。給予合適的獸醫(yī)學(xué)護(hù)理。任何組在觀察期內(nèi)的任一天都未觀察到不良的部位反應(yīng)(adversesitereaction)或支原體特異性臨床癥狀。第27-43天進(jìn)行攻擊后臨床評(píng)估。該研究階段觀察到的全部臨床表現(xiàn)是咳嗽、呼吸吃力(laboredrespiration)、抑郁癥、厭食、關(guān)節(jié)腫脹、跛、以及耳下垂。攻擊后階段的臨床評(píng)分的發(fā)生率見(jiàn)表3。組1的9只小牛中，2只出現(xiàn)感染的至少一種臨床癥狀，2只有呼吸道癥狀，1只有關(guān)節(jié)感染跡象。組3的所有小牛都有至少一種臨床癥狀，7只小牛有呼吸道癥狀，3只小牛在它們的關(guān)節(jié)中有感染跡象。組2的9只小牛中，4只有至少一種臨床癥狀，無(wú)一只小牛僅有呼吸道癥狀，4只小牛有關(guān)節(jié)感染跡象。組4有7只小牛有至少一種臨床癥狀，1只有呼吸道癥狀，7只有關(guān)節(jié)感染跡象。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>組1=疫苗/高劑量呼吸道攻擊組2=疫苗/低劑量呼吸道攻擊組3=無(wú)疫苗/高劑量呼吸道攻擊組4=無(wú)疫苗/低劑量呼吸道攻擊尸檢時(shí)收集肺，觀察與牛支原體感染有關(guān)的損傷。動(dòng)物們表現(xiàn)出病理學(xué)特征諸如實(shí)變和節(jié)結(jié)形成的差異。肺受累(lunginvolvement)結(jié)果表示為百分?jǐn)?shù)，所用的評(píng)分系統(tǒng)反映出具有與牛支原體感染相關(guān)的目測(cè)病理學(xué)的肺總體的百分比。在一些例子中，對(duì)肺百分比的確定因粘附或因損傷特性不典型而受到妨礙。表4顯示了有任何肺損傷的個(gè)體所占比例以及肺受累的百分比范圍/平均百分比。在肺部病理學(xué)評(píng)分時(shí)，組3的受累小牛最多(9/9)，組2的受累小牛最少(2/9)。表4肺部病理學(xué)評(píng)分匯總<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>尸檢時(shí)，對(duì)那些先前已有臨床癥狀(腫脹或跛)的動(dòng)物目測(cè)檢查其關(guān)節(jié)的病理。不同動(dòng)物的受累區(qū)不一樣，可能累及腕(carpus)，跗(hock)，后腿膝關(guān)節(jié)(Stifle)，球節(jié)(fetlock)和/或肘(elbow)。動(dòng)物們有明顯可見(jiàn)的腫脹，滑液增加，液體表觀特征異常，且關(guān)節(jié)囊增厚。在大多數(shù)嚴(yán)重受累的小牛中，發(fā)現(xiàn)血纖蛋白(fibrin)，而且關(guān)節(jié)面有侵蝕(erosion)。關(guān)節(jié)液和/或表面拭子的樣品通過(guò)培養(yǎng)測(cè)試牛支原體的存在。關(guān)節(jié)中的目測(cè)病理學(xué)表現(xiàn)在表5中匯總。表5目測(cè)有無(wú)關(guān)節(jié)病變特征(0=正常；1=異常)<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>組ι=疫苗/高劑量呼吸道攻擊；2=疫苗/低劑量呼吸道攻擊；3=無(wú)疫苗/高劑量呼吸道攻擊；4=無(wú)疫苗/低劑量攻擊(NR=未記錄)鼻傳代(nasalpassage)在第0、14、28和35天以及在尸檢時(shí)(第43天)用拭子取樣。此外，在死后檢查(post-mortem)期間，用拭子取扁桃體樣品，并回收代表性肺組織。圖1和2顯示了支原體選擇性培養(yǎng)基的回收率或牛支原體特異性PCR的檢測(cè)頻率。如圖1所示，所有組在尸檢后取扁桃體樣有100%的回收率。組1和組3的尸檢后肺部有100%的回收率。組2的肺回收最少(約60%)，組4的回收率約90%。直至第35天取鼻樣，無(wú)一組回收到牛支原體，唯一一個(gè)在第35天顯示回收的組是組4(25%)。除組2以外，所有組在尸檢后的鼻樣品中都有回收。表6=PCR和血清學(xué)匯總<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>標(biāo)物種的攻擊模型中的效力。該攻擊模型包括高劑量呼吸道給藥和低劑量呼吸道給藥。該研究還采用間接評(píng)估方式，通過(guò)在單劑和兩劑疫苗后的血清轉(zhuǎn)換或體液免疫應(yīng)答，評(píng)估了免疫力的效力、產(chǎn)生(onset)，以及免疫力持續(xù)時(shí)間。接種后免疫力的產(chǎn)生和持續(xù)時(shí)間也如此證實(shí)。進(jìn)行攻擊和用作疫苗的牛支原體分離物源自不同的天然感染動(dòng)物。用于攻擊的分離物之前已顯示在實(shí)驗(yàn)性攻擊期間引起肺和關(guān)節(jié)兩方面的疾病，并且在混合分離物攻擊研究中占優(yōu)勢(shì)。疫苗分離物是最初來(lái)源于確診樣品的多次傳代的分離物(傳106代)。而且，攻擊物和疫苗分離物的基因型用本文所述指紋分析方法測(cè)得并不相同。在高劑量呼吸道攻擊組(1和3)中，疫苗接種組的呼吸道臨床癥狀減少(72%)且肺部病理學(xué)減少(33%)。未接種組在攻擊后的第2-3天大都出現(xiàn)呼吸道臨床癥狀。如表3所示，所述疫苗還減少因牛支原體引起的關(guān)節(jié)疾病的發(fā)生。在低劑量呼吸道攻擊組(2和4)中，疫苗接種組的肺部病理學(xué)減少(96%)。而且，疫苗接種組的關(guān)節(jié)臨床癥狀大大減少(50%)。肺樣品的實(shí)驗(yàn)室測(cè)試(IHC，PCR和培養(yǎng))和關(guān)節(jié)樣品的實(shí)驗(yàn)室測(cè)試(PCR和培養(yǎng))在大多數(shù)情況下與目測(cè)的病理學(xué)一致。不一致之處可能是由于取樣部位或由于所測(cè)樣品之間的細(xì)菌分布造成。在為檢測(cè)疫苗候選物、不檢測(cè)攻擊分離物而設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)性PCR測(cè)定法中，所測(cè)試的任何肺樣品都未測(cè)出疫苗分離物。這種新的多次傳代的減毒活牛支原體疫苗候選物(05-2823P106)經(jīng)鼻內(nèi)和皮下途徑以2周的間隔施用2次，結(jié)果表明，它是安全且有效的，在禁食初乳的小牛中受到不同的攻擊后，牛支原體感染的癥狀，包括與牛支原體感染相關(guān)的臨床癥狀和病理學(xué)(呼吸道和關(guān)節(jié))，都減少。所述牛支原體疫苗和免疫學(xué)組合物還能在單劑施用后不超過(guò)14天就有效刺激免疫力的產(chǎn)生，并且維持至少42天。實(shí)施例2該研究的目的是確定三種活疫苗候選物的安全性和效力。材料和方法該研究所用小牛為6士2周齡，分為6組。如表7所示，組1有10只小牛，它們?cè)谠撗芯康牡?天(DO)和第14天(D14)接種了牛支原體活疫苗I。組1在DO和D14皮下接種2ml和鼻內(nèi)接種2ml。組2有10只小牛，在該研究的DO和D14皮下接種2ml牛支原體活疫苗I。組3有9只小牛，在DO和D14接種牛支原體活疫苗I。組3用2ml進(jìn)行鼻內(nèi)接種。組4是對(duì)照，未接種任何疫苗。組5有2只小牛，接種了牛支原體活疫苗II。組5在DO和D14皮下接種2ml和鼻內(nèi)接種2ml。組6有2只小牛，接種牛支原體活疫苗III。組6的小牛在DO和D14皮下接種2ml和鼻內(nèi)接種2ml。所有組隨后用120ml攻擊物進(jìn)行攻擊。所有動(dòng)物在D28被攻擊。如表8所示，所有小牛在第0、14、27、35和41天收集鼻拭子。尸檢時(shí)，從所有小牛收集扁桃體拭子。有臨床異常的動(dòng)物還收集關(guān)節(jié)拭子。此外，一些顯示區(qū)域累及的動(dòng)物還收集其它部位的樣品。所有小牛在第0、14、27、35和41天采血。從每只小牛的頸靜脈無(wú)菌采血。尸檢后，給肺損傷評(píng)分。表7處理組<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>臨床評(píng)估在第1-28天進(jìn)行。在該研究階段觀察到稀便/水便，流眼淚，抑郁癥和昏睡，它們無(wú)一歸因于接種的影響。對(duì)注射部位進(jìn)行觀察，除了第6134號(hào)小牛(組6)在第14天發(fā)現(xiàn)第一個(gè)注射部位腫脹以外，未記錄到不良的部位反應(yīng)。攻擊后的臨床癥狀臨床觀察在第28-42天進(jìn)行。在該研究階段觀察到咳嗽，呼吸吃力，抑郁癥，關(guān)節(jié)腫脹，跛和耳下垂。將臨床癥狀分為牛支原體感染的典型三大類(呼吸道，關(guān)節(jié)和其它)。呼吸道癥狀包括咳嗽，快速/吃力的呼吸和流鼻涕。關(guān)節(jié)癥狀包括關(guān)節(jié)腫脹和跛。其它癥狀包括，耳下垂，歪頭，抑郁癥和厭食。表9顯示了個(gè)體的結(jié)果表9<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>(laceration)黑塊=退出研究的動(dòng)物表10-攻擊后階段的臨床評(píng)分發(fā)生率<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>表10進(jìn)一步分為牛支原體感染典型的呼吸道臨床表現(xiàn)和經(jīng)確認(rèn)(培養(yǎng)和/或PCR)的牛支原體感染典型的關(guān)節(jié)臨床表現(xiàn)。此外，表中還記載了因嚴(yán)重關(guān)節(jié)受累而在早期退出研究的動(dòng)物比率。肺部病理學(xué)尸檢時(shí)收集肺，觀察與牛支原體有關(guān)的損傷。動(dòng)物們表現(xiàn)出病理學(xué)特征諸如實(shí)變和節(jié)結(jié)形成的差異。肺受累結(jié)果表示為百分?jǐn)?shù)，所用的評(píng)分系統(tǒng)反映出具有與牛支原體感染相關(guān)的目測(cè)病理學(xué)的肺總體的百分比。在一些例子中，對(duì)肺百分比的確定因粘附或因損傷特性不典型而受到妨礙。下面的表格顯示了有任何肺損傷的個(gè)體所占比例以及肺受累的百分比范圍/平均百分比。表11-肺部病理學(xué)評(píng)分匯總<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>關(guān)節(jié)病理學(xué)尸檢時(shí)，對(duì)那些先前已有臨床癥狀(腫脹和/或跛)的動(dòng)物目測(cè)檢查其關(guān)節(jié)的病理。不同動(dòng)物的受累區(qū)不一樣，可能累及腕，跗，后腿膝關(guān)節(jié)，球節(jié)和/或肘。動(dòng)物們有明顯可見(jiàn)的腫脹，滑液增加，液體表觀特征異常，或關(guān)節(jié)囊增厚。在大多數(shù)嚴(yán)重受累的小牛中，發(fā)現(xiàn)血纖蛋白，而且關(guān)節(jié)面有侵蝕。關(guān)節(jié)液和/或表面拭子的樣品通過(guò)培養(yǎng)和PCR測(cè)試牛支原體的存在。用任一種減毒活疫苗進(jìn)行接種成功減少了受累小牛的總數(shù)。表12-經(jīng)實(shí)驗(yàn)室確認(rèn)的臨床關(guān)節(jié)炎發(fā)生率<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>組1=VacI(SQ+IN)；2=VacI(SQ單獨(dú))；3=VacI(IN單獨(dú))；4=無(wú)疫苗；5=VacII(SQ+IN)；6=VacIII(SQ+IN)注當(dāng)樣品經(jīng)PCR和/或培養(yǎng)為牛支原體陽(yáng)性時(shí)，將該樣品記為經(jīng)實(shí)驗(yàn)室確認(rèn)的樣品。從鼻、扁桃體和肺樣品經(jīng)PCR檢測(cè)牛支原體鼻傳代在第0、14、27、35天和41或尸檢當(dāng)天對(duì)每一動(dòng)物取樣。此外，在驗(yàn)尸期間，用拭子取扁桃體樣品，并回收代表性肺組織。以下各表顯示了用靶向通用的牛支原體標(biāo)記物(uvrC)的實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)到的頻率。此外，扁桃體和肺組織用近期開(kāi)發(fā)的、靶向未見(jiàn)于牛支原體攻擊分離物但見(jiàn)于所有疫苗候選物的標(biāo)志物的終點(diǎn)PCR測(cè)定法進(jìn)行分析。象預(yù)計(jì)的一樣，PCR在各種鼻拭子樣品中檢測(cè)到牛支原體疫苗和/或攻擊微生物。表13-從鼻拭子樣品經(jīng)PCR檢測(cè)到牛支原體的頻率<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>組1=VacI(SQ+IN)；2=VacI(SQ單獨(dú))；3=VacI(IN單獨(dú))；4=無(wú)疫苗；5=VacII(SQ+IN)；6=VacIII(SQ+IN)注用靶向通用的牛支原體標(biāo)記物(uvrC)的實(shí)時(shí)PCR進(jìn)行PCR檢測(cè)。表14-扁桃體樣品和肺組織樣品的PCR檢測(cè)頻率(通用牛支原體和非攻擊的測(cè)定法)組1=VacI(SQ+IN)；2=VacI(SQ單獨(dú))；3=VacI(IN單獨(dú))；4=無(wú)疫苗；5=VacII(SQ+IN)；6=VacIII(SQ+IN)注通用=用靶向通用的牛支原體標(biāo)記物(uvrC)的實(shí)時(shí)PCR進(jìn)行PCR檢測(cè)；非_攻擊=用靶向未見(jiàn)于牛支原體攻擊分離物但見(jiàn)于所有疫苗候選物的標(biāo)志物的終點(diǎn)PCR進(jìn)行PCR檢測(cè)。同樣，象預(yù)計(jì)的那樣，PCR成功檢測(cè)到鼻內(nèi)接種后出現(xiàn)在扁桃體中的減毒活疫苗，而在肺和扁桃體的樣品中都檢測(cè)到高百分比的攻擊微生物。牛支原體血清學(xué)所有樣品都在Biovet牛支原體ELISA中檢測(cè)，以便監(jiān)控對(duì)牛支原體的血清學(xué)應(yīng)答。根據(jù)陽(yáng)性O(shè)D倍增分組，對(duì)血清轉(zhuǎn)換進(jìn)行評(píng)分。下面的表格顯示各族在第0、14、27、35天和以后(以后代表第37-41研究日，因?yàn)橛行﹦?dòng)物早期退出)檢測(cè)到的平均血清學(xué)評(píng)分。接種后觀察到的血清轉(zhuǎn)換更進(jìn)一步證實(shí)了我們的結(jié)論這些新疫苗確實(shí)在免疫接種的動(dòng)物如小牛中很快激起了適當(dāng)?shù)拿庖邞?yīng)答并維持了較長(zhǎng)時(shí)間(見(jiàn)圖4)。M^l本研究的目標(biāo)是，評(píng)估三種新的實(shí)驗(yàn)性活牛支原體疫苗，包括疫苗(05-2823P106)(PTA-8694)，用各種2mL給藥途徑(SQ、IN、SQ+IN)，間隔14天，在目標(biāo)物種的雙重攻擊模型中的效力。攻擊模型所用的經(jīng)呼吸道的給藥還附加胃腸道外給藥。此外，另兩種活疫苗候選物(05-249P102(PTA-8696)和05-1902-1P106(PTA-8695))僅用SQ+IN途徑評(píng)估效力。作為攻擊物和疫苗候選物的牛支原體分離物來(lái)自不同的受天然感染的農(nóng)場(chǎng)。用總體積120mL的攻擊分離物進(jìn)行的程序之前已顯示在實(shí)驗(yàn)性攻擊期間引起肺和關(guān)節(jié)兩方面的疾病，并且在混合分離物攻擊研究中占優(yōu)勢(shì)。活疫苗候選物是最初來(lái)源于確診樣品的多次傳代的分離物。疫苗候選物通過(guò)在合適的支原體培養(yǎng)基中連續(xù)的有限稀釋進(jìn)行多次傳代。應(yīng)注意，多次傳代的疫苗候選物052823P106已被證實(shí)在某些支原體選擇性瓊脂配制物上生長(zhǎng)受限，但傳代較少的親本分離物未發(fā)現(xiàn)這種特性。而且，攻擊物和疫苗分離物的基因型(用本文所述指紋分析方法)測(cè)得并不相同。本研究調(diào)查了多個(gè)參數(shù)，以便評(píng)估疫苗的益處。這些參數(shù)中，動(dòng)物退出率和關(guān)節(jié)臨床癥狀主要用于指示關(guān)節(jié)保護(hù)作用。肺部病理學(xué)(目測(cè)肺損傷百分比)主要用于指示肺部保護(hù)作用。其它數(shù)據(jù)如來(lái)自組織的生物的檢測(cè)結(jié)果，關(guān)節(jié)分布，和血清學(xué)則提供了起到證實(shí)作用的額外信息，接種后針對(duì)牛支原體的血清轉(zhuǎn)換也有此作用。所有組，不管采用何種給藥途徑或給藥途徑的組合，都在接受疫苗候選物牛支原體活疫苗I(05-2823P106)后顯示出使疾病減輕的肺部和關(guān)節(jié)保護(hù)益處，表現(xiàn)為，肺損傷、關(guān)節(jié)臨床癥狀和動(dòng)物退出率都減少。SQ和IN組合給藥(組1)與僅采用單一給藥途徑的組相比，肺損傷減少得最多(86%)。此外，另兩種疫苗候選物，活疫苗II(05-249P102)和活疫苗III(05-1902-1P106)經(jīng)SQ和IN途徑組合給藥后，肺損傷、關(guān)節(jié)臨床癥狀和退出率都減少，也證實(shí)了所述益處。所有疫苗候選物的ELISA結(jié)果證實(shí)了針對(duì)接種的強(qiáng)體液應(yīng)答，表明單一接種后的免疫力可以早在14天就產(chǎn)生，并維持至少41天(見(jiàn)圖5)。所有疫苗候選物都被證實(shí)是安全的。任一個(gè)接種組都沒(méi)有動(dòng)物在免疫接種期間出現(xiàn)臨床癥狀，僅有一例接種活疫苗III(05-1902-1P106)的動(dòng)物在注射部位出現(xiàn)反應(yīng)，但該反應(yīng)不明顯。此外，PCR結(jié)果表明，僅在經(jīng)IN途徑接種疫苗候選物的組檢測(cè)到來(lái)自扁桃體組織的非-攻擊牛支原體，并且僅在經(jīng)IN和SQ兩種途徑接種活疫苗I(05-2823P106)的一個(gè)動(dòng)物中檢測(cè)到來(lái)自肺組織的非-攻擊物。這些信息支持我們的結(jié)論總體上，根據(jù)本發(fā)明制備的新的減毒活牛支原體疫苗經(jīng)各種途徑施用都是安全且有效的，能快速產(chǎn)生保護(hù)作用并將該作用維持較長(zhǎng)時(shí)間，用于接種小牛的免疫學(xué)組合物阻止并減少了有毒力野生型牛支原體引起的各種疾病表現(xiàn)。實(shí)施例3本實(shí)施例描述了用于區(qū)分牛支原體菌株的DNA指紋分析方法，其采用TO2008-030619所述的方法和引物來(lái)分離、擴(kuò)增并檢測(cè)DNA。材料和方法在這些研究中使用支原體分離物。分離物得自公司內(nèi)部，或者田野分離物(fieldisolate)得自受感染的動(dòng)物。分離物用支原體-選擇性瓊脂和肉湯(broth)組合培養(yǎng)1-7天。為分離DNA，將肉湯培養(yǎng)物旋轉(zhuǎn)并沉淀成團(tuán)。從沉淀團(tuán)提取DNA(用QiagenDNeasyTissueKit提取，并重懸在分子級(jí)水(moleculargradewater)中)?；蚪MDNA用Picogreen(Invitrogen)定量。引物根據(jù)出現(xiàn)在細(xì)菌基因組(牛支原體)中、且公開(kāi)在TO2008-030619中的已知的插入序列(可轉(zhuǎn)座元件)來(lái)設(shè)計(jì)。從該元件末端(除末端重復(fù)區(qū)以外)手工選擇外向性引物，Tm為55-58°C。PCR反應(yīng)用multiplexPCRmastermix(QiagenMultiplexPCRKit)進(jìn)行。反應(yīng)中包括IxMastermix，每種引物各300nM，Ing模板DNA。熱循環(huán)條件是95°C15分鐘，再按照94°C30秒，56.1°C90秒，72C2分鐘運(yùn)行35個(gè)循環(huán)，最后在72°C延伸4分鐘，并在4°C維持。所擴(kuò)增的產(chǎn)物在添加了溴化乙錠的4%瓊脂糖凝膠(InvitrogenE-gel)上室溫電泳50分鐘，在UV光下成像。結(jié)果和討論這些結(jié)果顯示，本申請(qǐng)所用的每一種分離物都有獨(dú)特的指紋。但正如實(shí)施例2所示，每種分離物也都是有效的減毒活培養(yǎng)疫苗，對(duì)于指紋不同于任一種疫苗候選物的攻擊分離物能提供交叉保護(hù)。培養(yǎng)三種田野分離物05-2823P106(PTA-8694)、05-249P102(PTA-8696)、05-1902-1_Ρ106(PTA-8695)，按上述方案分離DNA。每種分離物取2_5ngDNA，按上述方案，用4組IS引物(W02008-030619中的SEQIDNos1-8)進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物在含溴化乙錠的InvitrogenE-gel4%瓊脂糖凝膠上(按廠家建議)電泳50分鐘，在UV光下觀察。所有分離物都產(chǎn)生特有的模式。這些模式用不同的試樣在相同的PCR反應(yīng)條件下可再現(xiàn)。權(quán)利要求經(jīng)減毒的無(wú)毒性牛支原體菌株。2.權(quán)利要求1的經(jīng)減毒的無(wú)毒性牛支原體菌株，所述菌已傳代10次以上。3.權(quán)利要求1或2的經(jīng)減毒的無(wú)毒性牛支原體菌株，所述菌已傳代50次以上。4.權(quán)利要求1-3之一的經(jīng)減毒的無(wú)毒性牛支原體菌株，其中所述經(jīng)減毒的無(wú)毒性牛支原體菌株選自以ATCC保藏號(hào)PTA-8694、PTA8695、或PTA8696保藏的減毒牛支原體菌株，其任何減毒后代牛支原體菌株，以及與ATCC保藏號(hào)為PTA-8694、PTA8695、或PTA8696的任一種牛支原體菌株具有相同特性的任何經(jīng)減毒的無(wú)毒性牛支原體菌株。5.使牛支原體減毒的方法，包括(a)將牛支原體傳代10次以上；(b)獲得經(jīng)培養(yǎng)的牛支原體；(c)對(duì)步驟(b)獲得的經(jīng)培養(yǎng)的牛支原體測(cè)試其致病性和免疫原性；(d)對(duì)非致病性、但有免疫原性的牛支原體進(jìn)行繁殖，以獲得減毒的牛支原體。6.權(quán)利要求5的方法，其中將所述菌傳代50次以上。7.權(quán)利要求5或6的方法，在體外進(jìn)行牛支原體傳代。8.權(quán)利要求5-7之一的方法，其中的致病性測(cè)試包括(a)用經(jīng)傳代的牛支原體感染牛；(b)對(duì)被感染的牛監(jiān)測(cè)牛支原體感染的臨床進(jìn)展癥狀。9.權(quán)利要求5-8之一的方法，其中的免疫原性測(cè)試包括(a)用經(jīng)過(guò)傳代的牛支原體對(duì)牛進(jìn)行感染；(b)在被感染的牛中監(jiān)測(cè)抗牛支原體的體液抗體應(yīng)答的進(jìn)展。10.免疫原性組合物，包含權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的任何經(jīng)減毒的無(wú)毒性牛支原體菌株的活菌。11.權(quán)利要求10的免疫原性組合物，還包含可藥用載體。12.權(quán)利要求10或11的免疫原性組合物，其特征在于，所述免疫原性組合物每劑包含至少10E3CFU的經(jīng)減毒無(wú)毒性牛支原體活菌。13.權(quán)利要求12的免疫原性組合物，其特征在于，所述免疫原性組合物每劑包含10E3-10E10CFU的經(jīng)減毒無(wú)毒性牛支原體活菌。14.權(quán)利要求12的免疫原性組合物，其特征在于，所述免疫原性組合物每劑包含10E6-10E10CFU的經(jīng)減毒無(wú)毒性牛支原體活菌。15.權(quán)利要求10-14之一的免疫原性組合物，其中一劑免疫原性組合物被配制為1或2ml。16.權(quán)利要求10-15之一的免疫原性組合物，其中所述免疫原性組合物在單劑施用后的14天之內(nèi)有效刺激免疫力的產(chǎn)生。17.權(quán)利要求10-16之一的免疫原性組合物，其中所述免疫原性組合物在單劑施用后有效刺激持續(xù)至少42天的免疫力。18.權(quán)利要求10-17之一的免疫原性組合物，其中所述免疫原性組合物當(dāng)給動(dòng)物施用時(shí)激發(fā)免疫應(yīng)答。19.權(quán)利要求10-18之一的免疫原性組合物，其中所述免疫原性組合物是疫苗。20.制備權(quán)利要求10-19之一的免疫原性組合物的方法，包括將權(quán)利要求1-4之一所述的減毒無(wú)毒性牛支原體菌株與可藥用載體混合。21.治療或預(yù)防牛支原體感染的方法，包括，給動(dòng)物施用有效量的根據(jù)權(quán)利要求10-19之一的免疫原性組合物。22.減少牛支原體感染癥狀的方法，包括，給動(dòng)物施用有效量的根據(jù)權(quán)利要求10-19之一的免疫原性組合物。23.減少牛支原體感染的臨床癥狀的嚴(yán)重程度或發(fā)生率的方法，包括，給動(dòng)物施用有效量的根據(jù)權(quán)利要求10-19之一的免疫原性組合物。24.權(quán)利要求21-23之一的方法，其中對(duì)所述動(dòng)物僅施用單劑。25.權(quán)利要求21-24之一的方法，其中所述免疫原性組合物對(duì)年齡為1日齡以上的動(dòng)物施用。26.權(quán)利要求25的方法，其中所述免疫原性組合物對(duì)1日齡-16周齡的動(dòng)物施用。27.權(quán)利要求21-26之一的方法，其中對(duì)所述動(dòng)物施用兩劑。28.權(quán)利要求27的方法，其中所述第二劑在第一次施用的至少10天后施用。29.權(quán)利要求28的方法，其中所述第二劑在第一次施用后的14-28天期間施用。30.權(quán)利要求21-29之一的方法，其中所述動(dòng)物是牛。全文摘要本發(fā)明涉及牛支原體的新的減毒株。本發(fā)明還提供包含任一種所述牛支原體減毒株的活菌的免疫原性組合物，其制備方法，及其在治療和預(yù)防牛支原體感染方面的用途。文檔編號(hào)A61K39/02GK101827605SQ200880112290公開(kāi)日2010年9月8日申請(qǐng)日期2008年10月29日優(yōu)先權(quán)日2007年10月29日發(fā)明者杰弗里·尼特爾,邁克爾·貝克申請(qǐng)人:貝林格爾.英格海姆維特梅迪卡有限公司