本發(fā)明涉及人巨細胞病毒領域，且特別是涉及一種婦女生殖道分泌物中抗hcmv分泌型抗體的快速檢測方法。
背景技術：
大量流行病學調查結果表明人巨細胞病毒(humancytomeglovirus，hcmv)在育齡婦女生殖道的隱性感染率超過90％。當婦女懷孕時，潛伏體內的hcmv被激活、繁殖而導致胎兒的宮內感染，結果會導致死胎(流產)、畸胎和新生兒出生缺陷。孕婦宮內感染的hcmv還可傳給新生兒并潛伏在其泌尿生殖系統(tǒng)，病毒對這些出生就已經攜帶hcmv的新生兒腎臟持續(xù)的損害可能是其成年后發(fā)生原發(fā)性腎功衰竭的原因之一。
hcmv的人群隱性感染率極高，血液中代表既往感染的抗hcmv的igg人群陽性率，國內報道為40-70％，歐美國家更高達90％。對于hcmv感染的體外診斷，目前通常采取同時檢測血液中抗hcmv的igg和igm兩種抗體,但由于血液中igm抗體一般在感染發(fā)生四周以后才會在血液里呈現(xiàn)明顯的升高，因此采用此種方法判斷hcmv感染有近1個月的窗口期，容易出現(xiàn)漏診。
近期發(fā)展起來的hcmv-dna分子診斷技術雖然靈敏度高，但存在檢測費用過高、假陽性率和與婦女生殖道感染是否同步等問題。
因此現(xiàn)有技術還有待于改進和發(fā)展。
技術實現(xiàn)要素：
有鑒于此，本發(fā)明提供一種婦女生殖道分泌物中抗hcmv分泌型抗體的快速檢測方法，旨在解決現(xiàn)有技術容易出現(xiàn)漏診及存在檢測費用過高、假陽性率和與婦女生殖道感染不同步的問題。
本發(fā)明解決技術問題所采用的技術方案如下：
一種婦女生殖道分泌物中抗hcmv分泌型抗體的快速檢測方法，包括以下步驟：
步驟1、采集婦女生殖道分泌物樣品；
步驟2、hcmv抗原蛋白的固定：將hcmv抗原蛋白用包被液稀釋后包被在固定相表面，在4℃-10℃環(huán)境下振搖過夜，棄包被液，并將包被有hcmv抗原蛋白的固定相進行封閉、洗滌，40℃-50℃真空干燥，密閉封裝，4℃-10℃下保存?zhèn)溆茫?/p>
步驟3、iga抗體的捕獲：將步驟1采集的待測樣品加入到步驟2制備的包被有hcmv抗原蛋白的固定相中，待測樣品中的iga抗體與hcmv抗原蛋白充分反應后，洗滌；
步驟4、標記二抗反應：將步驟3中捕獲了iga抗體的固定相與標記二抗充分反應，洗滌；
步驟5、讀取結果：根據標記二抗的變化，計算待測樣品中iga抗體的含量。
所述的婦女生殖道分泌物中抗hcmv分泌型抗體的快速檢測方法，其中，所述步驟1中的婦女生殖道分泌物樣品的采集方法具體包括以下步驟:
第一步、使用無菌棉拭子采集受試者陰道穹窿處分泌液，使得棉簽頭充分吸附分泌液；
第二步、采集樣品后的棉簽頭立即浸入預裝有1ml-3ml滅菌生理鹽水的無菌塑料采樣試管，使棉簽頭充分浸泡在生理鹽水中，振搖3-5分鐘；
第三步、棄去棉簽，用膠帶或不干膠紙密封塑料采樣試管內的待檢液，立即送檢或放置在4℃-8℃的環(huán)境下待檢。
所述的婦女生殖道分泌物中抗hcmv分泌型抗體的快速檢測方法，其中，所述步驟2中的包被液為ph9-ph10的碳酸氫鈉緩沖溶液。
所述的婦女生殖道分泌物中抗hcmv分泌型抗體的快速檢測方法，其中，所述所述標記二抗為酶標記二抗、膠體金標記二抗或熒光素標記二抗。
所述的婦女生殖道分泌物中抗hcmv分泌型抗體的快速檢測方法，其中，所述步驟2中hcmv抗原蛋白用包被液稀釋后的蛋白濃度為1.0微克/毫升-3.0微克/毫升。
所述的婦女生殖道分泌物中抗hcmv分泌型抗體的快速檢測方法，其中，所述固定相為酶標孔板或者聚乙烯微球。
與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點：
本發(fā)明通過對婦女生殖道分泌液中微量的iga抗體的檢測，可直接反映婦女生殖道hcmv的感染情況，尤其適合育齡婦女的自查，以及使用洗消產品后的效果評價，能夠有效解決現(xiàn)有技術容易出現(xiàn)漏診及存在檢測費用過高、假陽性率和與婦女生殖道感染不同步的問題，且相對于現(xiàn)有技術來說，準確率較高，成本較低。
附圖說明
圖1為本發(fā)明的免疫色譜檢測試紙條示意圖。
具體實施方式
為使本發(fā)明的目的、技術方案及優(yōu)點更加清楚、明確，以下結合實施例對本發(fā)明進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
本發(fā)明提供了一種婦女生殖道分泌物中抗hcmv分泌型抗體(sigaagainsthcmv)的快速檢測方法，包括以下步驟：
步驟1、采集婦女生殖道分泌物樣品。
其中，所述步驟1中的婦女生殖道分泌物樣品的采集方法具體包括以下步驟:
第一步、使用無菌棉拭子采集受試者陰道穹窿處分泌液，使得棉簽頭充分吸附分泌液；
第二步、采集樣品后的棉簽頭立即浸入預裝有1ml-3ml滅菌生理鹽水的無菌塑料采樣試管，使棉簽頭充分浸泡在生理鹽水中，振搖3-5分鐘；
第三步、棄去棉簽，用膠帶或不干膠紙密封塑料采樣試管內的待檢液，立即送檢或放置在4℃-8℃的環(huán)境下待檢。
步驟2、hcmv抗原蛋白的固定：將hcmv抗原蛋白用包被液稀釋后包被在固定相表面，在4℃-10℃環(huán)境下振搖過夜，棄包被液，并將包被有hcmv抗原蛋白的固定相進行封閉、洗滌，40℃-50℃真空干燥，密閉封裝，4℃-10℃下保存?zhèn)溆茫?/p>
步驟3、iga抗體的捕獲：將步驟1采集的待測樣品加入到步驟2制備的包被有hcmv抗原蛋白的固定相中，待測樣品中的iga抗體與hcmv抗原蛋白充分反應后，洗滌；
步驟4、標記二抗反應：將步驟3中捕獲了iga抗體的固定相與標記二抗充分反應，洗滌；
步驟5、讀取結果：根據標記二抗的變化，計算待測樣品中iga抗體的含量。
其中，由于人巨細胞病毒在婦女生殖道的感染屬于局部感染，局部粘膜分泌液中iga抗體的增高只與該處感染有關，而血液中的iga卻不一定會增高，因此，通過檢測婦女生殖道分泌液中的iga抗體，可以非常準確地反應局部感染的情況，可直接反映婦女生殖道hcmv的感染情況，尤其適合育齡婦女的自查，以及使用洗消產品后的效果評價，能夠有效解決現(xiàn)有技術容易出現(xiàn)漏診及存在檢測費用過高、假陽性率和與婦女生殖道感染不同步的問題，且相對于現(xiàn)有技術來說，準確率較高，成本較低。
下面給出本發(fā)明的婦女生殖道分泌物中抗hcmv分泌型抗體的快速檢測方法的幾個實施例。
實施例1
本發(fā)明提供了一種婦女生殖道分泌物中抗hcmv分泌型抗體的快速檢測方法，包括以下步驟：
步驟1、采集婦女生殖道分泌物樣品；
步驟2、hcmv抗原蛋白的固定：將hcmv抗原蛋白用ph9的碳酸氫鈉緩沖溶液稀釋后包被在酶標孔板表面，其中，hcmv抗原蛋白稀釋后的蛋白濃度為1.0微克/毫升，在4℃環(huán)境下振搖過夜，棄碳酸氫鈉緩沖溶液，并將包被有hcmv抗原蛋白的酶標孔板進行封閉、洗滌，50℃真空干燥，密閉封裝，4℃下保存?zhèn)溆茫?/p>
步驟3、iga抗體的捕獲：將待測樣品加入到步驟2制備的包被有hcmv抗原蛋白的酶標孔板中，待測樣品中的iga抗體與hcmv抗原蛋白充分反應后，洗滌3次；
其中，由于hcmv抗原蛋白吸附在酶標孔板上，婦女生殖道分泌液中可能含有的iga抗體可以跟這些固定了的hcmv抗原蛋白發(fā)生特異性結合形成“抗原-抗體復合物”，從而將iga抗體捕獲。
步驟4、標記二抗反應：將步驟3中捕獲了iga抗體的酶標孔板與酶標記二抗充分反應，洗滌3次；
其中，酶可以選用堿性磷酸酶、葡萄糖氧化酶，β-半乳糖苷酶、溶菌酶和蘋果酸脫氫酶等酶。
步驟5、讀取結果：根據酶促反應的變化，計算待測樣品中iga抗體的含量。
下面對本實施例的婦女生殖道分泌物中抗hcmv分泌型抗體的快速檢測方法進行實驗分析：
(一)樣品采集
(1)使用無菌棉拭子按婦科常規(guī)采集受試者陰道穹窿處分泌液(必須使棉簽頭充分吸附分泌液)；
(2)采集樣品后的棉簽頭立即浸入預裝有1-3ml滅菌生理鹽水的無菌塑料采樣試管，使棉簽頭(即浸透陰道分泌物的部位)充分浸泡在生理鹽水中，振搖3-5分鐘；
(3)棄去棉簽，用膠帶或不干膠紙密封塑料采樣試管內的待檢液，立即送檢或放置在4℃-8℃的環(huán)境下待檢。
(二)酶聯(lián)免疫吸附法
(1)取預先包被好hcmv病毒抗原蛋白(包被量：005-0.5ug/孔)的多孔酶標板，每孔加入待檢液0.025-0.1ml，以等量的滅菌生理鹽水加入同批號的酶標板孔作陰性對照。膠紙封口，室溫下置elasa專用振搖器孵育30-90分鐘，棄孔內液體，拍干；
(2)用0.15m，ph7.4的磷酸緩沖生理鹽水pbs洗酶標板孔3次，拍干；
(3)每孔加入辣根過氧化物酶標記的二抗溶液0.025-0.1ml，膠紙封口，室溫下置elasa專用振搖器孵育30-90分鐘，棄孔內液體，拍干；
(4)每孔加入顯色溶液0.025-0.1ml，37℃溫箱孵育15-30分鐘，酶標儀讀取492nm波長下的od值。
(三)結果判斷
若樣品孔od值≧3倍陰性對照值,表明疑似感染hcmv，記為“±”；若樣品孔od值≧6倍陰性對照值,表明既往或正在感染hcmv，記為“+”或“++”；若樣品孔od值≧9倍陰性對照值,表明感染hcmv活動期，記為“+++”。
實施例2
本發(fā)明提供了一種婦女生殖道分泌物中抗hcmv分泌型抗體的快速檢測方法，包括以下步驟：
步驟1、采集婦女生殖道分泌物樣品；
步驟2、hcmv抗原蛋白的固定：將hcmv抗原蛋白用ph9.5的碳酸氫鈉緩沖溶液稀釋后包被在酶標孔板表面，其中，hcmv抗原蛋白稀釋后的蛋白濃度為2.0微克/毫升，在10℃環(huán)境下振搖過夜，棄碳酸氫鈉緩沖溶液，并將包被有hcmv抗原蛋白的酶標孔板進行封閉、洗滌，40℃真空干燥，密閉封裝，10℃下保存?zhèn)溆茫?/p>
步驟3、iga抗體的捕獲：將待測樣品加入到步驟2制備的包被有hcmv抗原蛋白的酶標孔板中，待測樣品中的iga抗體與hcmv抗原蛋白充分反應后，洗滌4次；
步驟4、標記二抗反應：將步驟3中捕獲了iga抗體的酶標孔板與膠體金充分反應，洗滌4次；
步驟5、讀取結果：根據膠體金的顏色變化，計算待測樣品中iga抗體的含量。
下面對本實施例的婦女生殖道分泌物中抗hcmv分泌型抗體的快速檢測方法進行實驗分析：
(一)樣品采集
(1)使用無菌棉拭子按婦科常規(guī)采集受試者陰道穹窿處分泌液(必須使棉簽頭充分吸附分泌液)；
(2)采集樣品后的棉簽頭立即浸入預裝有1-3ml滅菌生理鹽水的無菌塑料采樣試管，使棉簽頭(即浸透陰道分泌物的部位)充分浸泡在生理鹽水中，振搖3-5分鐘；
(3)棄去棉簽，用膠帶或不干膠紙密封塑料采樣試管內的待檢液，立即送檢或放置在4℃-8℃的環(huán)境下待檢。
(二)免疫色譜法
如圖1所示,圖1為本發(fā)明的免疫色譜檢測試紙條示意圖。其中，圖1中的10為加樣口，20為膠體金標記鼠抗人iga抗體的窗口，30為固相hcmv抗原蛋白窗口，40為固相羊抗鼠igg抗體窗口。
取待檢液0.025-0.1ml，滴入免疫色譜檢測試紙條的加樣口10，室溫下5-30分鐘觀察結果。
(三)結果判斷
若30、40窗口均顯示紅棕色條帶，表明既往或正在感染hcmv，記為“+”；
若30窗口不顯色，40窗口顯示紅棕色條帶，表明陰性，記為“-”；
若40窗口不顯色，表明結果無效。
實施例3
本發(fā)明提供了一種婦女生殖道分泌物中抗hcmv分泌型抗體的快速檢測方法，包括以下步驟：
步驟1、采集婦女生殖道分泌物樣品；
步驟2、hcmv抗原蛋白的固定：將hcmv抗原蛋白用ph10的碳酸氫鈉緩沖溶液稀釋后包被在聚乙烯微球表面，其中，hcmv抗原蛋白稀釋后的蛋白濃度為3.0微克/毫升，在7℃環(huán)境下振搖過夜，棄包被液，并將包被有hcmv抗原蛋白的固定相進行封閉、洗滌，45℃真空干燥，密閉封裝，7℃下保存?zhèn)溆茫?/p>
步驟3、iga抗體的捕獲：將婦女生殖道分泌液加入到步驟1制備的包被有hcmv抗原蛋白的聚乙烯微球中，待測樣品中的iga抗體與hcmv抗原蛋白充分反應后，洗滌5次；
步驟4、標記二抗反應：將步驟2中捕獲了iga抗體的聚乙烯微球與熒光素充分反應，洗滌5次；
步驟5、讀取結果：根據熒光素的熒光強度，計算待測樣品中iga抗體的含量。
最后說明的是，以上實施例僅用來說明本發(fā)明的技術方案而非限制，盡管參照較佳實施例對本發(fā)明進行了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對本發(fā)明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術方案的宗旨和范圍，其均應涵蓋在本發(fā)明的權利要求范圍當中。