本發(fā)明屬于高粱花葉病毒檢測領(lǐng)域，尤其涉及一種高粱花葉病毒間接elisa檢測方法及其試劑盒與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

甘蔗是世界上最重要的糖料作物，也是最具潛力的可再生能源作物。甘蔗生長過程中會(huì)受到病毒的危害，且經(jīng)過長期無性繁殖，多種病毒會(huì)積累在不同甘蔗品種及種質(zhì)材料中，導(dǎo)致其種性退化，產(chǎn)量和品質(zhì)下降，給甘蔗產(chǎn)業(yè)帶來嚴(yán)重?fù)p失。

甘蔗花葉病是甘蔗主要病害之一，其主要病原是馬鈴薯y病毒屬甘蔗花葉病毒亞組的甘蔗高粱花葉病毒(srmv)，該病毒可經(jīng)蚜蟲叮咬和機(jī)械損傷進(jìn)行近距離傳播，其自然寄主為禾本科的高粱和甘蔗等。甘蔗主要通過種莖進(jìn)行無性繁殖，會(huì)造成該病毒的積累和遠(yuǎn)距離傳播。被感染植株的葉面會(huì)出現(xiàn)黃綠相間不規(guī)則的嵌紋、條斑或斑駁，葉色褪綠等癥狀，病狀在幼嫩葉片的基部較明顯，影響光合作用的效率，會(huì)造成甘蔗產(chǎn)量和含糖量下降。因此，建立一種操作簡單、特異靈敏、成本低廉的srmv高效檢測方法，對(duì)田間病毒調(diào)查，防止該病毒傳播，以及建立無毒甘蔗種苗體系等具有重要意義。

目前檢測病毒常用的方法可分為分子檢測技術(shù)和血清學(xué)檢測技術(shù)兩類。分子檢測技術(shù)是一種基于核酸水平的檢測，具有準(zhǔn)確高效、靈敏快速的特點(diǎn)，但操作比較復(fù)雜，成本很高。常見的srmv檢測方法為pcr檢測技術(shù)，首先需要對(duì)甘蔗提取總rna，反轉(zhuǎn)錄為cdna，再進(jìn)行pcr擴(kuò)增，最后進(jìn)行電泳分析，甚至還要進(jìn)行基因組序列測定。pcr技術(shù)操作過程繁瑣、耗時(shí)長，并且該技術(shù)完全依賴于pcr儀器和商業(yè)化的試劑，所以實(shí)驗(yàn)成本較高，不利于田間病毒病的大規(guī)模檢測。此外，pcr技術(shù)假陽性較高，整個(gè)過程需要專業(yè)人員操作，難以普及推廣。

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(elisa)是一種免疫學(xué)檢測方法，具有靈敏度高、操作方便且經(jīng)濟(jì)實(shí)用的特點(diǎn)，其極大地克服了rt-pcr存在的缺點(diǎn)，不需要提取核酸，也不容易交叉污染，適合于田間或出入境口岸大規(guī)模樣品檢測，因而越來越受到人們的青睞和重視。目前elisa技術(shù)在甘蔗病毒檢測方面還不成熟，還難以應(yīng)用于田間病害調(diào)查以及健康甘蔗種苗選育。目前，國內(nèi)還沒有商業(yè)化檢測甘蔗病毒的elisa試劑盒，這既是一研究熱點(diǎn)，也是一研發(fā)目標(biāo)，其技術(shù)的關(guān)鍵在于制備高質(zhì)量的檢測抗體。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種靈敏度高、特異性強(qiáng)、成本低、高通量、檢測快速的高粱花葉病毒間接elisa檢測方法及其試劑盒與應(yīng)用。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：高粱花葉病毒間接elisa檢測試劑盒，主要包括特異性識(shí)別高粱花葉病毒的兔抗多克隆抗體和辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗兔lgg標(biāo)準(zhǔn)液。

多克隆抗體以甘蔗高粱花葉病毒的p3蛋白n端保守區(qū)多肽為抗原制備。

制備按以下操作進(jìn)行：從ncbi網(wǎng)站獲得srmv的p3基因序列，預(yù)測p3蛋白的氨基酸序列，選取n端暴露于天然蛋白外表的多肽為抗原，合成該多肽，將此多肽與弗氏佐劑混合免疫兔子，采集兔子血液，經(jīng)親和層析純化獲得多克隆抗體。

多肽具有序列表seq.id.no.1的氨基酸序列。

高粱花葉病毒間接elisa檢測方法，以兔抗的甘蔗高粱花葉病毒p3蛋白n端保守區(qū)制備的多克隆抗體作為一抗，辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗兔lgg標(biāo)準(zhǔn)液作為二抗對(duì)甘蔗中的高粱花葉病毒進(jìn)行elisa檢測。

上述高粱花葉病毒間接elisa檢測方法，按以下步驟進(jìn)行操作：

a.樣品處理：稱取待檢甘蔗樣品，將其制成勻漿，離心或靜置沉淀，取上清液用包被緩沖液稀釋2-8倍備用；

b.樣品包被：取100μl經(jīng)適當(dāng)稀釋的檢測樣品液加入96孔酶標(biāo)板中，以srmv抗原標(biāo)準(zhǔn)液為陽性對(duì)照，以健康甘蔗樣品液為陰性對(duì)照，在37℃條件下包被1-2h；

c.洗滌：去除酶標(biāo)板中的包被液，每孔加入100μlpbst緩沖液漂洗3次，每次5min；

d.封閉：去除酶標(biāo)板中的pbst緩沖液，每孔加入100μl封閉液，37℃孵育1h，去除封閉液后用pbst緩沖液漂洗3次，每次5min；

e.抗體孵育：每孔加入100μl1∶1000稀釋的兔抗srmvp3n蛋白抗血清標(biāo)準(zhǔn)液，37℃孵育1h，漂洗3次；再每孔加入100μl1∶8000稀釋的辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗兔igg標(biāo)準(zhǔn)液，37℃孵育1h，去除二抗，用pbst緩沖液漂洗3次，每次5min；

f.底物顯色及終止反應(yīng)：每孔加入100μl可溶性型tmb底物顯色液，37℃避光顯色10min，溶液顯藍(lán)色，每孔加入50μl2m的h2so4終止反應(yīng)，溶液變?yōu)辄S色；

g.結(jié)果判定：用酶標(biāo)儀測定od450，計(jì)算p/n值(p為待測樣品的od450；n為陰性對(duì)照的od450)；如果p/n＞2.1則待測樣為陽性；反之則為陰性。

高粱花葉病毒間接elisa檢測試劑盒用于甘蔗中高粱花葉病毒的elisa檢測。

高粱花葉病毒間接elisa檢測方法用于甘蔗中高粱花葉病毒的elisa檢測。

針對(duì)現(xiàn)有甘蔗中高粱花葉病毒檢測缺乏有效檢測措施的問題，發(fā)明人設(shè)計(jì)并制備了甘蔗中高粱花葉病毒間接elisa檢測試劑盒，主要包括特異性識(shí)別高粱花葉病毒的兔抗多克隆抗體和辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗兔lgg標(biāo)準(zhǔn)液。其中，多克隆抗體以甘蔗高粱花葉病毒的p3蛋白n端保守區(qū)多肽為抗原制備。據(jù)此，發(fā)明人還建立了相應(yīng)的間接elisa檢測方法，并將之用于甘蔗中高粱花葉病毒檢測。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下突出優(yōu)點(diǎn)：

(1)本發(fā)明既適用于田間對(duì)少量樣品的快速檢測，若與樣品處理系統(tǒng)連用可實(shí)現(xiàn)該病毒的快速、高通量檢測，因此也適用于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的大量樣品的高通量快速檢測。將其用于田間甘蔗發(fā)病率調(diào)查，與pcr檢測結(jié)果比較驗(yàn)證該方法的檢測重復(fù)性和準(zhǔn)確率表明，本發(fā)明與pcr檢測結(jié)果的符合率為87％以上，適用于病毒調(diào)查和健康種苗篩選等。

(2)本發(fā)明所用抗體特異性好，能特異性的識(shí)別高粱花葉病毒，對(duì)甘蔗花葉病毒、甘蔗黃葉病毒和甘蔗桿狀病毒等其他病毒均不能識(shí)別，實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化中以病毒積累量低的嫩葉作為實(shí)驗(yàn)材料，從而提高了該試劑盒的靈敏度。

(3)本發(fā)明提供的各種試劑的濃度和參數(shù)配比均是經(jīng)上百次實(shí)驗(yàn)精細(xì)調(diào)試優(yōu)化所得。各項(xiàng)指標(biāo)的綜合運(yùn)用實(shí)現(xiàn)了樣品需要量少、檢測靈敏度高，特異性強(qiáng)、成本低、適合大批量樣品檢測的特點(diǎn)，并且具有操作簡單，實(shí)用性強(qiáng)等優(yōu)勢。一個(gè)人只需要8-10小時(shí)就能完成幾百份甘蔗樣品的檢測，并且樣品越多優(yōu)越性越明顯，利于田間和甘蔗種公司的大規(guī)模推廣應(yīng)用，可對(duì)田間甘蔗高粱花葉病毒攜帶情況進(jìn)行調(diào)查研究，也可對(duì)甘蔗種苗帶毒情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，解決了大量樣品檢測耗時(shí)耗力，成本高昂的缺點(diǎn)。

附圖說明

圖1是驗(yàn)證本發(fā)明中一抗特異性的westernblotting圖，圖中：m是蛋白marker，1是帶高粱花葉病毒的甘蔗的總蛋白，2是健康甘蔗的總蛋白。

圖2是本發(fā)明實(shí)施例中所述的樣品處理系統(tǒng)圖。

圖3是本發(fā)明實(shí)施例中srmv的elisa檢測結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例一高粱花葉病毒elisa檢測方法在田間檢測中的運(yùn)用

a.樣品處理：取約0.5g待測甘蔗樣品放入研缽中，加入適量的石英砂，再加入1-5mlpbs緩沖液；研磨至樣品呈勻漿狀，靜置沉淀15min，取上清液用包被緩沖液稀釋2-8倍備用。

b.樣品包被：取100μl經(jīng)適當(dāng)稀釋的檢測樣品液加入96孔酶標(biāo)板中，以srmv抗原標(biāo)準(zhǔn)液為陽性對(duì)照，以健康甘蔗樣品液為陰性對(duì)照，在37℃條件下包被1-2h；

c.洗滌：去除酶標(biāo)板中的包被液，每孔加入100μlpbst緩沖液漂洗3次，每次5min；

d.封閉：去除酶標(biāo)板中的pbst緩沖液，每孔加入100μl封閉液(含有5％脫脂奶粉的pbst溶液)，37℃孵育1h，去除封閉液后用pbst緩沖液漂洗3次，每次5min；

e.抗體孵育：每孔加入100μl1∶1000稀釋的兔抗srmvp3n蛋白抗血清標(biāo)準(zhǔn)液，37℃孵育1h，漂洗3次；再每孔加入100μl1∶8000稀釋的辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗兔igg標(biāo)準(zhǔn)液，37℃孵育1h，去除二抗，用pbst緩沖液漂洗3次，每次5min；

f.底物顯色及終止反應(yīng)：每孔加入100μl可溶性型tmb底物顯色液，37℃避光顯色10min，溶液顯藍(lán)色，每孔加入50μl2m的h2s04終止反應(yīng)，溶液變?yōu)辄S色。

g.結(jié)果判定：用酶標(biāo)儀測定od450，計(jì)算p/n值(p為待測樣品的od450；n為陰性對(duì)照的od450)；如果p/n＞2.1則待測樣為陽性；反之則為陰性。

結(jié)果：在田間檢測只能采用手工磨樣，難以進(jìn)行大批量樣品檢測。因未經(jīng)離心處理，研磨液中色素含量較高，導(dǎo)致od450值偏高，假陽性率較高。與rt-pcr檢測符合率為84％，檢測可信度較高，可以大批量推廣使用。

實(shí)施例二高粱花葉病毒elisa檢測方法在大量樣品檢測中的運(yùn)用

a.樣品處理：稱取約0.2g待檢甘蔗樣品裝到2ml的ep管中，加入2顆小鋼珠并加入0.5-1.5ml裂解液。經(jīng)樣品處理系統(tǒng)(美國mpbiomedicals公司fastprep-24)處理1-3min即可將樣品打呈勻漿狀，8000-12000r/min離心5min，取上清液用包被緩沖液稀釋2-8倍備用。

b.樣品包被：取100μl經(jīng)適當(dāng)稀釋的檢測樣品液加入96孔酶標(biāo)板中，以srmv抗原標(biāo)準(zhǔn)液為陽性對(duì)照，以健康甘蔗樣品液為陰性對(duì)照，在37℃條件下包被1-2h；

c.洗滌：去除酶標(biāo)板中的包被液，每孔加入100μlpbst緩沖液漂洗3次，每次5min；

d.封閉：去除酶標(biāo)板中的pbst緩沖液，每孔加入100μl封閉液(含有5％脫脂奶粉的pbst溶液)，37℃孵育1h，去除封閉液后用pbst緩沖液漂洗3次，每次5min；

e.抗體孵育：每孔加入100μl1∶1000稀釋的兔抗srmvp3n蛋白抗血清標(biāo)準(zhǔn)液，37℃孵育1h，漂洗3次；再每孔加入100μl1∶8000稀釋的辣根氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔igg標(biāo)準(zhǔn)液，37℃孵育1h，去除二抗，用pbst緩沖液漂洗3次，每次5min；

f.底物顯色及終止反應(yīng)：每孔加入100μl可溶性型tmb底物顯色液，37℃避光顯色10min，溶液顯藍(lán)色，每孔加入50μl2m的h2so4終止反應(yīng)，溶液變?yōu)辄S色。

g.結(jié)果判定：用酶標(biāo)儀測定od450，計(jì)算p/n值(p為待測樣品的od450；n為陰性對(duì)照的od450)；如果p/n＞2.1則待測樣為陽性；反之則為陰性。

結(jié)果：在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)可采用樣品處理系統(tǒng)磨樣，適于大批量樣品檢測。研磨液經(jīng)離心色素含量較低，對(duì)檢測結(jié)果干擾小。與rt-pcr檢測符合率為87％，檢測可信度很高，可以大批量推廣使用。

表1實(shí)施例二檢測結(jié)果與rt-pcr檢測結(jié)果的符合情況

實(shí)施例三高粱花葉病毒elisa檢測試劑盒的組裝應(yīng)用

為方便使用，參照前述發(fā)明內(nèi)容及實(shí)施例組裝檢測試劑盒(100次)如下：

<1>試劑盒組分

以上試劑均-20℃保存

以上試劑均4℃保存

2mlep管100個(gè)

直徑為0.2-0.7cm的小鋼珠50顆

以上材料均室溫保存。

其中，srmv-p3n多克隆抗體制備如下：從ncbi網(wǎng)站獲得srmv的p3基因序列，預(yù)測p3蛋白的氨基酸序列，選取n端暴露于天然蛋白外表的多肽為抗原，合成該多肽mfkpegmkkiieeec(seq.id.no.1)，將此多肽與弗氏佐劑混合免疫兔子，采集兔子血液，經(jīng)親和層析純化獲得多克隆抗體。

<2>試劑盒使用注意事項(xiàng)

①處理樣品時(shí)樣品量不宜過多，否者樣品處理不充分，病毒難以釋放到緩沖液中。

②離心時(shí)速度為8000-12000r/min，時(shí)間為3-8min，最大程度的去除上清液中的色素，防止色素干擾。

③抗體在使用前15min內(nèi)稀釋；

④最佳反應(yīng)溫度為37℃；抗體需-20℃保存。

應(yīng)用本例制備的病毒檢測試劑盒，參照實(shí)施例二并采用相應(yīng)發(fā)病癥狀的甘蔗樣品，其檢測結(jié)果與實(shí)施例二相同，且檢測快速、結(jié)果可靠，表明該病毒檢測試劑盒可以大批量推廣使用。

sequencelisting

<110>廣西大學(xué)

<120>高粱花葉病毒間接elisa檢測方法及其試劑盒與應(yīng)用

<130>高粱花葉病毒間接elisa檢測方法及其試劑盒與應(yīng)用

<160>1

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>15

<212>prt

<213>人工序列

<400>1

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151015