本發(fā)明涉及殼聚糖-鉑模擬氧化酶催化顯色體系的堿性磷酸酶及其抑制劑的測(cè)定方法，屬于分析化學(xué)和納米技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

堿性磷酸酶是廣泛分布于人體肝臟、骨骼、腸、腎和胎盤等組織經(jīng)肝臟向膽外排出的一種酶，它是判斷一些肝膽疾病的重要指標(biāo)，尤其是黃疸的鑒別診斷。堿性磷酸酶作為一種能夠?qū)?duì)應(yīng)底物去磷酸化的酶，通過(guò)水解磷酸單酯將底物分子上的磷酸基團(tuán)除去，生成磷酸根離子和自由羥基，這類底物包括核酸、蛋白和生物分子等。因?yàn)閴A性磷酸酶的去磷酸化作用，使得它在分子生物學(xué)和酶聯(lián)免疫分析中得到了廣泛應(yīng)用，臨床上使用它來(lái)水解克林霉素磷酸酯，生成的克林霉素具有抗生作用。在免疫試劑產(chǎn)品中，堿性磷酸酶被作為最常用的標(biāo)記酶之一，與辣根過(guò)氧化物酶相比，堿性磷酸酶用作標(biāo)記酶具有高穩(wěn)定性，高靈敏度等優(yōu)點(diǎn)。隨著堿性磷酸酶的運(yùn)用越來(lái)越廣泛，對(duì)于堿性磷酸酶的檢測(cè)也變得愈加重要。目前，我國(guó)對(duì)堿性磷酸酶檢測(cè)方法的種類還相對(duì)單一，因此建立一種新型且可行的測(cè)定堿性磷酸酶的方法在當(dāng)下的科學(xué)研究中具有重要的實(shí)際意義。

本發(fā)明以抗壞血酸磷酸酯為堿性磷酸酶底物，以殼聚糖-鉑模擬氧化酶催化氧氣氧化3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽顯色體系為檢測(cè)信號(hào)源，建立了一種比色測(cè)定堿性磷酸酶的方法。本法操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、抗干擾能力強(qiáng)、重現(xiàn)性好，有望用于實(shí)際臨床診斷。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種利用殼聚糖-鉑模擬氧化酶催化氧氣氧化3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽顯色體系，以抗壞血酸磷酸酯為堿性磷酸酶底物，從而測(cè)定堿性磷酸酶及其抑制劑的方法。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

本發(fā)明所述的基于殼聚糖-鉑模擬氧化酶的堿性磷酸酶測(cè)定方法，其特征是在抗壞血酸磷酸酯和堿性磷酸酶反應(yīng)產(chǎn)物中加入3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽溶液和殼聚糖-鉑模擬氧化酶溶液，反應(yīng)后加入硫酸溶液終止反應(yīng)，根據(jù)溶液顏色和紫外吸收光譜特征的變化，用于堿性磷酸酶含量的測(cè)定；所使用的殼聚糖-鉑模擬氧化酶是用殼聚糖作為穩(wěn)定劑，硼氫化鈉還原氯鉑酸得到，具體合成步驟如下：稱取0.1g殼聚糖溶解于50ml濃度為1v/v%的醋酸中，攪拌15分鐘使殼聚糖完全溶解即得到濃度為0.2m/v%的殼聚糖溶液，將2ml濃度為10mmol/l氯鉑酸加入到47ml濃度為0.2m/v%殼聚糖溶液中，攪拌30分鐘，然后逐滴加入1ml濃度為0.2mol/l新配制的硼氫化鈉溶液并在5分鐘之內(nèi)加完，置于暗處攪拌90分鐘，得到殼聚糖-鉑模擬氧化酶。

所述的基于殼聚糖-鉑模擬氧化酶的堿性磷酸酶測(cè)定方法，其特征是將50μl濃度為4mmol/l的抗壞血酸磷酸酯和50μl不同濃度的堿性磷酸酶加入到200μlph為9.10，濃度為10mmol/l的tris-hcl緩沖液中，混合均勻后在37℃下反應(yīng)30分鐘，然后依次加入632.5μlph為5，濃度為50mmol/l的醋酸鹽緩沖液、50μl濃度為3mmol/l的3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽溶液和17.5μl殼聚糖-鉑模擬氧化酶溶液，混合均勻后再在37℃下反應(yīng)5分鐘，加入200μl濃度為2mol/l的硫酸溶液終止反應(yīng)，測(cè)定溶液的吸光度值a450。

所述的基于殼聚糖-鉑模擬氧化酶的堿性磷酸酶測(cè)定方法，其特征是在0.5~20u/l范圍內(nèi)，吸光度a450與堿性磷酸酶濃度呈線性關(guān)系，檢測(cè)限為0.34u/l。

本發(fā)明所述的基于殼聚糖-鉑模擬氧化酶的測(cè)定人血清堿性磷酸酶的方法，其特征是包括如下步驟：將50μl濃度為4mmol/l的抗壞血酸磷酸酯和50μl人血清加入到200μlph為9.10，濃度為10mmol/l的tris-hcl緩沖液中，混合均勻后在37℃下反應(yīng)30分鐘，依次加入632.5μlph為5，濃度為50mmol/l的醋酸鹽緩沖液、50μl濃度為3mmol/l的3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽溶液和17.5μl殼聚糖-鉑模擬氧化酶溶液，混合均勻后再在37℃下反應(yīng)5分鐘，加入200μl濃度為2mol/l的硫酸溶液終止反應(yīng)，測(cè)定溶液的吸光度值a450，根據(jù)堿性磷酸酶標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算人血清中的堿性磷酸酶含量；所使用的殼聚糖-鉑模擬氧化酶是用殼聚糖作為穩(wěn)定劑，硼氫化鈉還原氯鉑酸得到，具體合成步驟如下：稱取0.1g殼聚糖溶解于50ml濃度為1v/v%的醋酸中，攪拌15分鐘使殼聚糖完全溶解即得到濃度為0.2m/v%的殼聚糖溶液，將2ml濃度為10mmol/l氯鉑酸加入到47ml濃度為0.2m/v%殼聚糖溶液中，攪拌30分鐘，然后逐滴加入1ml濃度為0.2mol/l新配制的硼氫化鈉溶液并在5分鐘之內(nèi)加完，置于暗處攪拌90分鐘，得到殼聚糖-鉑模擬氧化酶。

所述的基于殼聚糖-鉑模擬氧化酶的測(cè)定人血清堿性磷酸酶的方法，其特征是得人血清樣品測(cè)定的回收率為97.1%~102.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.6~6.8%。

本發(fā)明所述的基于殼聚糖-鉑模擬氧化酶的堿性磷酸酶抑制劑的測(cè)定方法，其特征是在抗壞血酸磷酸酯、堿性磷酸酶和堿性磷酸酶抑制劑的反應(yīng)產(chǎn)物中加入3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽溶液和殼聚糖-鉑模擬氧化酶溶液，反應(yīng)后加入硫酸溶液終止反應(yīng)，根據(jù)溶液顏色和紫外吸收光譜特征的變化，用于堿性磷酸酶抑制劑的抑制率的測(cè)定；所使用的殼聚糖-鉑模擬氧化酶是用殼聚糖作為穩(wěn)定劑，硼氫化鈉還原氯鉑酸得到，具體合成步驟如下：稱取0.1g殼聚糖溶解于50ml濃度為1v/v%的醋酸中，攪拌15分鐘使殼聚糖完全溶解即得到濃度為0.2m/v%的殼聚糖溶液，將2ml濃度為10mmol/l氯鉑酸加入到47ml濃度為0.2m/v%殼聚糖溶液中，攪拌30分鐘，然后逐滴加入1ml濃度為0.2mol/l新配制的硼氫化鈉溶液并在5分鐘之內(nèi)加完，置于暗處攪拌90分鐘，得到殼聚糖-鉑模擬氧化酶溶液。

所述的基于殼聚糖-鉑模擬氧化酶的堿性磷酸酶抑制劑的測(cè)定方法，其特征是將50μl濃度為4mmol/l的抗壞血酸磷酸酯和50μl濃度為0.4u/ml的堿性磷酸酶溶液加入到200μl含不同濃度苯丙氨酸的ph為9.10，濃度為10mmol/l的tris-hcl緩沖液中，混合均勻后在37℃下反應(yīng)30分鐘，依次加入632.5μlph為5，濃度為50mmol/l的醋酸鹽緩沖液、50μl濃度為3mmol/l的3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽溶液和17.5μl殼聚糖-鉑模擬氧化酶溶液，混合均勻后再在37℃下反應(yīng)5分鐘，加入200μl濃度為2mol/l的硫酸溶液終止反應(yīng)，測(cè)定溶液的吸光度值a450，計(jì)算抑制率，通過(guò)軟件擬合得到苯丙氨酸的ic50為0.77mmol/l。

具體地說(shuō)，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

（一）殼聚糖-鉑模擬氧化酶的制備：稱取0.1g殼聚糖溶解于50ml濃度為1%（v/v）的醋酸中，攪拌15分鐘使殼聚糖完全溶解即得到濃度為0.2%（m/v）的殼聚糖溶液。將2ml濃度為10mmol/l氯鉑酸加入到47ml濃度為0.2%殼聚糖溶液中，攪拌30分鐘，然后逐滴加入1ml濃度為0.2mol/l新配制的硼氫化鈉溶液（5分鐘之內(nèi)加完），置于暗處攪拌90分鐘，得到殼聚糖-鉑模擬氧化酶，所得產(chǎn)物避光冷藏保存。

（二）堿性磷酸酶的測(cè)定：首先，將50μl濃度為4mmol/l的抗壞血酸磷酸酯和50μl不同濃度的堿性磷酸酶加入到200μltris-hcl緩沖液（ph9.10，10mmol/l）中，混合均勻后在37℃下反應(yīng)30分鐘；接著，依次將632.5μl醋酸鹽緩沖液（ph5，50mmol/l）、50μl濃度為3mmol/l的3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽溶液和17.5μl步驟（一）制備的殼聚糖-鉑模擬氧化酶溶液加入到上述反應(yīng)液中，混合均勻后再在37℃下反應(yīng)5分鐘；加入200μl濃度為2mol/l的硫酸溶液終止反應(yīng)，測(cè)定溶液在450nm波長(zhǎng)處的吸光度值（a450），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行堿性磷酸酶含量測(cè)定。

（三）堿性磷酸酶抑制劑的測(cè)定：將50μl濃度為0.4u/ml的堿性磷酸酶溶液和50μl濃度為4mmol/l抗壞血酸磷酸酯溶液加入到200μl含不同濃度苯丙氨酸的tris-hcl緩沖溶液中（ph9.10，10mmol/l），搖勻后在37℃下反應(yīng)30分鐘。然后，依次將632.5μl醋酸鹽緩沖液（ph5，50mmol/l）、50μl濃度為3mmol/l的3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽溶液和17.5μl步驟（一）制備的殼聚糖-鉑模擬氧化酶溶液加入到上述反應(yīng)液中，混合均勻后再在37℃下反應(yīng)5分鐘。加入200μl濃度為2mol/l的硫酸溶液終止反應(yīng)，測(cè)定溶液吸光度值a450。通過(guò)軟件擬合，得到苯丙氨酸的半抑制濃度ic50。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)

（1）本發(fā)明利用堿性磷酸酶水解抗壞血酸磷酸酯生成抗壞血酸，從而抑制殼聚糖-鉑模擬氧化酶催化顯色反應(yīng)體系，結(jié)合溶液顏色和紫外吸收光譜特征的變化，直接用于堿性磷酸酶及其抑制劑含量的測(cè)定。

（2）本發(fā)明制備的殼聚糖-鉑模擬氧化酶由殼聚糖作為穩(wěn)定劑，硼氫化鈉還原氯鉑酸得到，其制備過(guò)程簡(jiǎn)單快速。

（3）本發(fā)明檢測(cè)步驟簡(jiǎn)單，不涉及任何復(fù)雜、貴重的儀器，檢測(cè)成本低。

（4）本發(fā)明檢測(cè)靈敏度高，堿性磷酸酶的檢測(cè)限為0.34u/l。

附圖說(shuō)明

圖1為外觀圖。圖中的a對(duì)照組：殼聚糖-鉑模擬氧化酶+3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽；圖中的b對(duì)照組:殼聚糖-鉑模擬氧化酶+3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽+抗壞血酸磷酸酯；圖中的c對(duì)照組:殼聚糖-鉑模擬氧化酶+3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽+堿性磷酸酶；圖中的d實(shí)驗(yàn)組：殼聚糖-鉑模擬氧化酶+3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽+抗壞血酸磷酸酯+堿性磷酸酶。

圖2為吸光度值a450圖。圖中的a對(duì)照組：殼聚糖-鉑模擬氧化酶+3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽；圖中的b對(duì)照組:殼聚糖-鉑模擬氧化酶+3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽+抗壞血酸磷酸酯；圖中的c對(duì)照組:殼聚糖-鉑模擬氧化酶+3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽+堿性磷酸酶；圖中的d實(shí)驗(yàn)組：殼聚糖-鉑模擬氧化酶+3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽+抗壞血酸磷酸酯+堿性磷酸酶。

圖3為堿性磷酸酶濃度與殼聚糖-鉑模擬氧化酶催化顯色體系吸光度值a450的線性關(guān)系圖。

圖4為堿性磷酸酶測(cè)定干擾實(shí)驗(yàn)。數(shù)字0~9依次分別代表空白組、堿性磷酸酶、焦磷酸水解酶、蛋白酶k、過(guò)氧化氫酶、辣根過(guò)氧化酶、溶菌酶、脲酶、乙酰膽堿酯酶、葡萄糖氧化酶。

圖5為苯丙氨酸抑制率曲線圖。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1：

稱取0.1g殼聚糖溶解于50ml濃度為1%（v/v）的醋酸中，攪拌15分鐘使殼聚糖完全溶解即得到濃度為0.2%（m/v）的殼聚糖溶液。將2ml濃度為10mmol/l氯鉑酸加入到47ml濃度為0.2%（m/v）殼聚糖溶液中，攪拌30分鐘，然后逐滴加入1ml濃度為0.2mol/l新配制的硼氫化鈉溶液（5分鐘之內(nèi)加完），置于暗處攪拌90分鐘，得到深褐色的殼聚糖-鉑模擬氧化酶溶液。產(chǎn)物避光冷藏保存。以上過(guò)程中使用的所有玻璃器皿均經(jīng)過(guò)王水浸泡，并用雙蒸水徹底清洗，晾干。

實(shí)施例2：

將50μl濃度為4mmol/l的抗壞血酸磷酸酯和50μl濃度為0.4u/ml的堿性磷酸酶加入到200μltris-hcl緩沖液（ph9.10，10mmol/l）中，混合均勻后在37℃下反應(yīng)30分鐘。然后依次將632.5μl醋酸鹽緩沖液（ph5，50mmol/l）、50μl濃度為3mmol/l的3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽溶液和17.5μl實(shí)施例1制得的殼聚糖-鉑模擬氧化酶溶液加入到上述反應(yīng)液中，混合均勻后再在37℃下反應(yīng)5分鐘。加入200μl濃度為2mol/l的硫酸溶液終止反應(yīng)，目視觀察顏色的變化或測(cè)定溶液的紫外-可見吸收光譜。目視觀察顏色變化時(shí)，對(duì)照組溶液顏色均為深黃色，實(shí)驗(yàn)組溶液顏色為無(wú)色（見圖1）。測(cè)定紫外-可見吸收光譜時(shí)，對(duì)照組的吸光度值a450變化不大，而實(shí)驗(yàn)組的吸光度值a450明顯減?。ㄒ妶D2）。

實(shí)施例3：

將50μl濃度為4mmol/l的抗壞血酸磷酸酯和50μl不同濃度的堿性磷酸酶加入到200μltris-hcl緩沖液（ph9.10，10mmol/l）中，混合均勻后在37℃下反應(yīng)30分鐘。然后依次將632.5μl醋酸鹽緩沖液（ph5，50mmol/l）、50μl濃度為3mmol/l的3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽溶液和17.5μl實(shí)施例1制得的殼聚糖-鉑模擬氧化酶溶液加入到上述反應(yīng)液中，混合均勻后再在37℃下反應(yīng)5分鐘。加入200μl濃度為2mol/l的硫酸溶液終止反應(yīng)，測(cè)定溶液的吸光度值a450。由圖3可知，隨著堿性磷酸酶濃度的增大，吸光度值a450逐漸減小。在0.5~20u/l范圍內(nèi)，a450與堿性磷酸酶濃度呈線性關(guān)系，檢測(cè)限為0.34u/l。

實(shí)施例4：

將50μl濃度為4mmol/l的抗壞血酸磷酸酯和50μl濃度為0.2u/ml的堿性磷酸酶加入到200μltris-hcl緩沖液（ph9.10，10mmol/l）中，混合均勻后在37℃下反應(yīng)30分鐘。然后依次將632.5μl醋酸鹽緩沖液（ph5，50mmol/l）、50μl濃度為3mmol/l的3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽溶液和17.5μl實(shí)施例1制得的殼聚糖-鉑模擬氧化酶溶液加入到上述反應(yīng)液中，混合均勻后再在37℃下反應(yīng)5分鐘。加入200μl濃度為2mol/l的硫酸溶液終止反應(yīng)，測(cè)定溶液的吸光度值a450。重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)步驟10次，得相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（rsd）為7.0%，表明本方法重現(xiàn)性良好。

實(shí)施例5：

取正常人血清，與不同濃度的堿性磷酸酶按照1:4的體積比充分混合，得到樣品溶液。將50μl濃度為4mmol/l的抗壞血酸磷酸酯和50μl上述樣品溶液加入到200μltris-hcl緩沖液（ph9.10，10mmol/l）中，混合均勻后在37℃下反應(yīng)30分鐘。然后依次將632.5μl醋酸鹽緩沖液（ph5，50mmol/l）、50μl濃度為3mmol/l的3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽溶液和17.5μl實(shí)施例1制得的殼聚糖-鉑模擬氧化酶溶液加入到上述反應(yīng)液中，混合均勻后再在37℃下反應(yīng)5分鐘。加入200μl濃度為2mol/l的硫酸溶液終止反應(yīng)，測(cè)定溶液的吸光度值a450。結(jié)合實(shí)施例3計(jì)算正常人血清中堿性磷酸酶的含量，測(cè)定回收率為97.1%~102.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.6~6.8%。

實(shí)施例6：

堿性磷酸酶測(cè)定干擾實(shí)驗(yàn)：將50μl濃度為4mmol/l的抗壞血酸磷酸酯和50μl濃度為4u/ml其他酶溶液加入到200μltris-hcl緩沖液（ph9.10，10mmol/l）中，混合均勻后在37℃下反應(yīng)30分鐘。然后依次將632.5μl醋酸鹽緩沖液（ph5，50mmol/l）、50μl濃度為3mmol/l的3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽溶液和17.5μl實(shí)施例1制得的殼聚糖-鉑模擬氧化酶溶液加入到上述反應(yīng)液中，混合均勻后再在37℃下反應(yīng)5分鐘。加入200μl濃度為2mol/l的硫酸溶液終止反應(yīng)，測(cè)定溶液的吸光度值a450。由圖4可知，即使其他酶的濃度比堿性磷酸酶高10倍，仍不能產(chǎn)生明顯的干擾，表明本方法對(duì)堿性磷酸酶具有良好的選擇性。

實(shí)施例7：

將50μl濃度為4mmol/l的抗壞血酸磷酸酯和50μl濃度為0.4u/ml的堿性磷酸酶溶液加入到200μl含不同濃度苯丙氨酸的tris-hcl緩沖液（ph9.10，10mmol/l）中，混合均勻后在37℃下反應(yīng)30分鐘。然后依次將632.5μl醋酸鹽緩沖液（ph5，50mmol/l）、50μl濃度為3mmol/l的3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽溶液和17.5μl實(shí)施例1制得的殼聚糖-鉑模擬氧化酶溶液加入到上述反應(yīng)液中，混合均勻后再在37℃下反應(yīng)5分鐘。加入200μl濃度為2mol/l的硫酸溶液終止反應(yīng)，測(cè)定溶液的吸光度值a450，計(jì)算抑制率。結(jié)果如圖5所示，通過(guò)軟件擬合得到苯丙氨酸的ic50為0.77mmol/l。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改，等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。