技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明屬于生物大分子成像領(lǐng)域，更具體地，涉及一種突破現(xiàn)有全內(nèi)反射熒光顯微技術(shù)中的熒光濃度屏障的新型成像技術(shù)和方法。

背景技術(shù)：
：

單分子熒光技術(shù)可以在復(fù)雜體系內(nèi)實(shí)時(shí)觀測(cè)生物分子的動(dòng)態(tài)過(guò)程，并揭示隱藏在傳統(tǒng)系綜平均測(cè)量中的重要信息，包括生物分子之間的差異性以及反應(yīng)過(guò)程中的瞬時(shí)中間態(tài)等。單分子熒光手段的以上優(yōu)點(diǎn)使得它近年得到了廣泛的關(guān)注和應(yīng)用，其快速發(fā)展使得很多傳統(tǒng)的生物學(xué)問(wèn)題得以用新實(shí)驗(yàn)技術(shù)來(lái)解決(sasmald.k.etal.,nanoscale,2016,8,19928-19944)。

運(yùn)用最為廣泛的單分子技術(shù)之一是基于全內(nèi)反射熒光顯微鏡的單分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)(fret)：?jiǎn)蝹€(gè)熒光供體和受體形成的fret對(duì)被激光激活并檢測(cè)其發(fā)出的熒光強(qiáng)度，供體和受體之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fret)效率的變化可以表征fret配對(duì)標(biāo)記位點(diǎn)之間相對(duì)距離的變化，從而反映分子構(gòu)型的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)變化(royr.etal.,naturemethods,2008,5,507-516)。單分子fret已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于研究生物大分子的自身構(gòu)型變化和分子間相互作用等動(dòng)態(tài)過(guò)程。

然而，基于全內(nèi)反射熒光顯微鏡的單分子fret技術(shù)仍然存在著缺陷和不足(juettem.f.etal.,currentopinioninchemicalbiology,2014,20,103-111)。全內(nèi)反射熒光顯微鏡中最高可使用的熒光標(biāo)記樣品濃度——既熒光濃度屏障——在50nm左右，這遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于許多生化反應(yīng)的結(jié)合常數(shù)，也遠(yuǎn)低于許多生物分子在生理?xiàng)l件下的濃度(μm量級(jí))。因此，很多利用單分子fret開(kāi)展的研究是在遠(yuǎn)低于生理濃度的條件下進(jìn)行的，其結(jié)論是否能真實(shí)反應(yīng)生理?xiàng)l件還有待驗(yàn)證。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是突破全內(nèi)反射熒光顯微技術(shù)中的熒光濃度屏障(50nm)，實(shí)現(xiàn)在接近生理?xiàng)l件的μm以上濃度下進(jìn)行單分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移的測(cè)量。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種基于光激活的單分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移的方法，其特征在于該方法按如下步驟進(jìn)行：

1)將光激活的熒光染料和非光激活熒光染料分別溶解在有機(jī)溶劑中，染料終濃度為1-50mm；

2)生物樣品的摩爾濃度為10-200μm，生物樣品濃度和熒光染料濃度的比例為1：1-10；生物樣品和熒光染料在4-37℃下反應(yīng)0.5-24小時(shí),所述的生物樣品為核酸或者蛋白；

3)將步驟2)反應(yīng)后的溶液加入脫鹽柱中，用緩沖液洗脫得到標(biāo)記的熒光染料的樣品，從而去除多余的沒(méi)有標(biāo)記的生物樣品的染料；

4)用光激活熒光染料標(biāo)記生物樣品為供體，用非光激活熒光染料標(biāo)記生物樣品作為受體；將非光激活染料標(biāo)記的生物樣品固定在玻片上，之后加入濃度為納摩爾到微摩爾量級(jí)的光激活染料標(biāo)記的生物樣品，在全內(nèi)反射熒光顯微鏡下進(jìn)行成像；打開(kāi)激活光源(6)，用波長(zhǎng)為200-450納米的激光激活供體，使玻片表面附近的熒光染料都轉(zhuǎn)變?yōu)榭砂l(fā)射熒光的激活態(tài)；

5)關(guān)閉激活光源，打開(kāi)另一波長(zhǎng)為450-1200納米的激發(fā)光源(7)，與表面的生物樣品結(jié)合的激活態(tài)熒光標(biāo)記分子會(huì)被激發(fā)產(chǎn)生熒光；

6)當(dāng)光激活染料標(biāo)記的供體與非光激活的熒光染料標(biāo)記的受體的距離在1-10nm之間時(shí)，通過(guò)激活和激發(fā)光源的交替照明，不斷的激活在實(shí)驗(yàn)觀測(cè)過(guò)程中結(jié)合到表面的熒光染料，供體的能量就會(huì)轉(zhuǎn)移給受體，受體就會(huì)發(fā)出相應(yīng)的熒光，即熒光共振能量轉(zhuǎn)移。

上述技術(shù)方案中，所述的生物樣品為核酸或者蛋白；步驟4)中所述納摩爾到微摩爾量級(jí)的光激活熒光染料標(biāo)記的樣品濃度在1nm～100μm之間。

優(yōu)選地，步驟1)中所述的有機(jī)溶劑采用二甲基亞砜、二甲基甲酰胺、甲醇或乙醇。

優(yōu)選地，所述的光激活染料包括cage500、cage552、cage590或cage635；非光激活染料包括cyanine2、cyanine3、cyanine5、cyanine7、alexa488、alexa647或atto488。

本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)及突出性的技術(shù)效果：本發(fā)明利用光激活的熒光染料代替非光激活的熒光染料對(duì)生物樣品進(jìn)行標(biāo)記，從而突破全內(nèi)反射熒光顯微技術(shù)中的熒光濃度屏障，將標(biāo)記生物樣品的最高濃度限值提高2-3個(gè)數(shù)量級(jí)，突破了熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)中的熒光樣品濃度的障礙(50nm左右)，實(shí)現(xiàn)了在生理?xiàng)l件的μm以上濃度進(jìn)行單分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移的測(cè)量，從而反應(yīng)更為真實(shí)的生理過(guò)程，進(jìn)而揭示更多未知的生物學(xué)過(guò)程。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明提供的一種基于光激活的單分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移方法的原理示意圖。

圖2為本發(fā)明方法實(shí)驗(yàn)過(guò)程中所使用的系統(tǒng)結(jié)構(gòu)示意圖。

圖中：1-顯微鏡成像玻片；2-生物樣品；3-非光激活染料標(biāo)記的生物樣品(受體)；4-未被激活的光激活染料標(biāo)記的生物樣品；5-已被激活的光激活染料標(biāo)記的生物分子(供體)；6-激活光源；7-激發(fā)光源；8-反射鏡；9-二向色鏡；10-凸透鏡。

具體實(shí)施方式：

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說(shuō)明。

圖1為本發(fā)明提供的一種基于光激活的單分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移方法的原理示意圖，該方法包括如下步驟：

1)將光激活的熒光染料和非光激活熒光染料分別溶解在有機(jī)溶劑中，染料終濃度為1-50mm；有機(jī)溶劑一般可采用二甲基亞砜、二甲基甲酰胺、甲醇或乙醇等。光激活染料可采用cage500，cage552，cage590，cage635，cmnb-cagedcarboxyfluorescein，se等；非光激活染料可采用cyanine2，cyanine3，cyanine5，cyanine7，alexa488，alexa647，atto488等；

2)生物樣品的摩爾濃度為10-200μm，生物樣品濃度和熒光染料濃度的比例為1：1-10；生物樣品和熒光染料在4-37℃下反應(yīng)0.5-24小時(shí),所述的生物樣品為核酸或者蛋白；

3)將步驟2)反應(yīng)后的溶液加入脫鹽柱中，用緩沖液洗脫得到標(biāo)記的熒光染料的樣品，從而去除多余的沒(méi)有標(biāo)記的生物樣品的染料；

4)用光激活熒光染料標(biāo)記生物樣品作為供體，用非光激活熒光染料標(biāo)記生物樣品作為受體；將非光激活染料標(biāo)記的生物樣品固定在顯微鏡成像玻片1上，之后加入濃度為納摩爾到微摩爾量級(jí)的光激活染料標(biāo)記的生物樣品2，一般在1nm～100μm之間，在全內(nèi)反射熒光顯微鏡下進(jìn)行成像；打開(kāi)波長(zhǎng)為200-450納米的激活光源6，使玻片表面附近的熒光染料都轉(zhuǎn)變?yōu)榭砂l(fā)射熒光的激活態(tài)；

5)關(guān)閉激活光源，打開(kāi)另一波長(zhǎng)為450-1200納米的激發(fā)光源7，與表面的生物樣品結(jié)合的激活態(tài)熒光染料標(biāo)記的生物樣品會(huì)被激發(fā)產(chǎn)生熒光；

6)當(dāng)光激活染料標(biāo)記的供體與非光激活的熒光染料標(biāo)記的受體的距離在1-10nm之間時(shí)，通過(guò)激活和激發(fā)光源的交替照明，不斷的激活在實(shí)驗(yàn)觀測(cè)過(guò)程中結(jié)合到表面的熒光染料，供體的能量就會(huì)轉(zhuǎn)移給受體，受體就會(huì)發(fā)出相應(yīng)的熒光，即熒光共振能量轉(zhuǎn)移。

圖2為本發(fā)明方法實(shí)驗(yàn)過(guò)程中所使用的系統(tǒng)結(jié)構(gòu)示意圖，圖1中的技術(shù)方案是通過(guò)圖2中的硬件來(lái)實(shí)施并采集數(shù)據(jù)。激活光源6和激發(fā)光源7通過(guò)反射鏡8和二向色鏡9合并在同一光路上，通過(guò)兩個(gè)共焦點(diǎn)的凸透鏡10擴(kuò)束后進(jìn)入商業(yè)化的熒光顯微鏡(nikonti-e或類似產(chǎn)品)，在全內(nèi)反射角進(jìn)行照明。顯微鏡上的成像玻片固定有標(biāo)記的生物分子。通過(guò)電腦控制，實(shí)現(xiàn)激活光源和激發(fā)光源的可控的交替激發(fā)，實(shí)現(xiàn)圖1中的技術(shù)路線，獲得基于光激活的單分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移信號(hào)。相應(yīng)的單分子熒光信號(hào)被顯微鏡收集，被分光鏡基于熒光的波長(zhǎng)投射到檢測(cè)器的不同區(qū)域，單分子熒光信號(hào)最終被電腦采集并重構(gòu)出基于光激活的單分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移信號(hào)隨時(shí)間的變化。

下述實(shí)施例中所述實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法；所述試劑和材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑獲得。

實(shí)施例1，基于cage552光激活染料的單分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移。

以cage552光激活染料標(biāo)記的核酸分子為模型，實(shí)現(xiàn)樣品濃度在微摩爾量級(jí)下的單分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移的觀測(cè)。

具體實(shí)驗(yàn)如下：

從abberior公司購(gòu)買1mgn-羥基琥珀酰亞胺酯(nhsester)活化的cage552光激活染料，溶于181μl的二甲基亞砜中，使得染料的終濃度為10mm。cage552染料可以被405nm的激光激活，532nm的激光激發(fā)。從lumiprobe公司購(gòu)買1mgn-羥基琥珀酰亞胺酯(nhsester)活化的cyanine5非光激活染料，溶于162μl的二甲基亞砜中，使得染料的終濃度為10mm。生物樣品為核酸(dna)，一條固相合成在中間某特定堿基上引入氨基(nh2)修飾的100μl50μm的dna單鏈分子(供體)與5微升cage552染料在23℃下反應(yīng)5小時(shí)。另一條100μl50μm的dna單鏈分子(受體)與5μl10mmcyanine5染料在23℃反應(yīng)2小時(shí)。反應(yīng)后的溶液加入脫鹽柱中，用緩沖液洗脫得到標(biāo)記熒光染料的樣品。將生物素化的dna單鏈分子和受體以10μm的濃度1:1混合，在55度下反應(yīng)15分鐘，并緩慢降溫到室溫。結(jié)合圖1，生物素化的dna單鏈分子和受體3固定到顯微鏡成像玻片1上，后加入10μm的供體4,交替激發(fā)405nm和532nm的激光，可以看到cyanine5發(fā)出的熒光信號(hào)，即發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移。

實(shí)施例2，基于cagefam光激活染料的單分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移。

以cagefam光激活染料標(biāo)記的核酸分子為模型，實(shí)現(xiàn)樣品濃度在微摩爾量級(jí)下的單分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移的觀測(cè)。

具體實(shí)驗(yàn)如下：

從invitroge公司購(gòu)買1mgn-羥基琥珀酰亞胺酯(nhsester)活化的cagefam(cmnb-cagedcarboxyfluorescein，se)光激活染料，溶于103μl的二甲基亞砜中，使得染料的終濃度為10mm。cagefam染料可以被405nm的激光激活，488nm的激光激發(fā)。從lumiprobe公司購(gòu)買1mgn-羥基琥珀酰亞胺酯(nhsester)活化的cyanine5非光激活染料，溶于162μl的二甲基亞砜中，使得染料的終濃度為10mm。生物樣品為核酸(dna)，一條固相合成在中間某特定堿基上引入氨基(nh2)修飾的100μl50μm的dna單鏈分子(供體)與5μl10mmcagefam染料在23℃下反應(yīng)5小時(shí)。另一條100μl50μm的dna單鏈分子(受體)與5μl10mmcyanine5染料在23℃下反應(yīng)2小時(shí)。反應(yīng)后的溶液加入脫鹽柱中，用緩沖液洗脫得到標(biāo)記熒光染料的樣品。將生物素化的dna單鏈分子和受體以10μm的濃度1:1混合，在55℃下反應(yīng)15分鐘，并緩慢降溫到室溫。結(jié)合圖1，生物素化的dna單鏈分子和受體固定到玻片上，后加入10μm的供體,交替激發(fā)405nm和488nm的激光，可以看到cyanine5發(fā)出的熒光信號(hào)，即發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移。