本發(fā)明中涉及到一種利用新型二維材料黑磷來(lái)探測(cè)化學(xué)及生物物質(zhì)的技術(shù)，屬于熒光技術(shù)與生物光子學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，尤其是對(duì)腫瘤細(xì)胞的探測(cè)。

背景技術(shù)：

2009年c.-h.lu等人提出了利用二維材料氧化石墨烯實(shí)現(xiàn)對(duì)生物分子的探測(cè)。在該技術(shù)中，用dna單鏈搭載一種熒光素分子，將這一結(jié)合物命名為p1，用特定波長(zhǎng)的光激發(fā)p1時(shí)，將向外輻射熒光。當(dāng)向p1的溶液中加入氧化石墨烯溶液時(shí)，p1與氧化石墨烯結(jié)合(p1-go)，此時(shí)再用特定波長(zhǎng)光激發(fā)時(shí)，熒光輻射特別微弱，這說(shuō)明了氧化石墨烯對(duì)熒光有淬滅作用。之后，將p1-go結(jié)合物加入到特定dna單鏈(這一dna單鏈可以與p1中的dna單鏈匹配形成dna雙螺旋結(jié)構(gòu))溶液中，再用特定波長(zhǎng)光激發(fā)，又出現(xiàn)了較好的熒光輻射。這一現(xiàn)象說(shuō)明，dna雙螺旋結(jié)構(gòu)的形成同時(shí)伴隨著熒光素從氧化石墨烯上的逃逸，也說(shuō)明dan單鏈之間的結(jié)合強(qiáng)度要強(qiáng)于dan與氧化石墨烯之間的結(jié)合。同時(shí)研究人員還將p1-go加入到其他的dna單鏈溶液中，發(fā)現(xiàn)熒光的恢復(fù)效果并不好，這說(shuō)明這一結(jié)合物可以實(shí)現(xiàn)對(duì)特定dna分子的探測(cè)，并且當(dāng)目標(biāo)分子與其他分子同時(shí)存在時(shí)，熒光依然可以恢復(fù)，這也說(shuō)明干擾成分的存在并不影響對(duì)目標(biāo)分子的探測(cè)。實(shí)驗(yàn)研究也發(fā)現(xiàn)，氧化石墨烯的濃度越高對(duì)熒光的淬滅效果越好，溶液中目標(biāo)分子的濃度越高熒光強(qiáng)度的恢復(fù)也越好。之后，c.-h.lu等人為了說(shuō)明這一探測(cè)技術(shù)的普遍性，又利用這一技術(shù)探測(cè)蛋白質(zhì)，合成dna-熒光素的結(jié)合物(此處的dna可以有效的識(shí)別凝血酶)，然后重復(fù)與dna分子識(shí)別相同的步驟，最終實(shí)現(xiàn)了對(duì)特定蛋白質(zhì)的識(shí)別。在探測(cè)dna分子的技術(shù)中，主要利用了單鏈dna之間的相互匹配作用；在探測(cè)蛋白質(zhì)分子的技術(shù)中，主要是利用了特定dna對(duì)特定蛋白質(zhì)的識(shí)別作用；在探測(cè)其他分子的時(shí)候也利用同樣的原理，一種物質(zhì)對(duì)一種物質(zhì)的特定識(shí)別或者結(jié)合功能。本技術(shù)的核心在于黑磷對(duì)熒光的淬滅作用。在此技術(shù)的基礎(chǔ)上，我們利用新型材料黑磷與石墨烯的相似性，做了利用黑磷探測(cè)化學(xué)及生物物質(zhì)的實(shí)驗(yàn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明是一種基于新型二維材料黑磷的特定化學(xué)及生物物質(zhì)探測(cè)方法，這種探測(cè)方法包括以下幾點(diǎn)：(1)帶有熒光標(biāo)記的適配體；(2)探測(cè)溶劑的選取，可以為pbs，也可以為細(xì)胞培養(yǎng)基，或者其他能夠使體系的熒光性能保持穩(wěn)定的緩沖液，列舉的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中用的是磷酸鹽緩沖液(pbs)(3)待測(cè)化學(xué)或生物物質(zhì)的處理；(4)待測(cè)化學(xué)或生物物質(zhì)探測(cè)的具體實(shí)施方法；(5)此探測(cè)方法的探測(cè)范圍涉及到化學(xué)污染物，農(nóng)藥，核酸、蛋白質(zhì)、細(xì)胞、生物分子等眾多物質(zhì)。

具體包括以下步驟：

步驟(1)，組建熒光探針，根據(jù)需要配制不同濃度的熒光探針試劑，用熒光分析裝置測(cè)這些溶液均有熒光信號(hào)；再配制黑磷與熒光探針的混合溶液，混合溶液中黑磷的最終濃度以及熒光探針的最終濃度都可以根據(jù)具體的實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行具體的調(diào)節(jié)，此時(shí)在熒光分析裝置上測(cè)熒光時(shí)，熒光信號(hào)變微弱，說(shuō)明黑磷對(duì)熒光有淬滅作用。

步驟(2)，進(jìn)行待測(cè)化學(xué)或生物物質(zhì)的探測(cè)實(shí)驗(yàn)，將前面所述的加入黑磷后熒光變?nèi)醯娜芤号c待測(cè)的化學(xué)或生物物質(zhì)混合后熒光逐漸恢復(fù)，說(shuō)明了這種方法可以實(shí)現(xiàn)化學(xué)及生物物質(zhì)的探測(cè)。若熒光逐漸有所恢復(fù)則待測(cè)溶液中存在與熒光探針試相匹配結(jié)合的物質(zhì)，若熒光不恢復(fù)則待測(cè)溶液中不存在與熒光探針試相匹配結(jié)合的物質(zhì)，以此可以定量或定性檢測(cè)化學(xué)或生物物質(zhì)。

進(jìn)一步優(yōu)選：所用的熒光探針中包括一種帶有熒光標(biāo)記的適配體，這種適配體是一條單鏈dna在其末端接上了一個(gè)熒光素分子，形成了熒光探針的結(jié)合物；使用的單鏈dna能夠識(shí)別待測(cè)的特定物質(zhì)，并且單鏈dna能夠與待測(cè)的特定物質(zhì)相匹配結(jié)合。

整個(gè)細(xì)胞探測(cè)過(guò)程中，所用的溶劑均為磷酸鹽緩沖液(pbs)，因?yàn)楹诹自诹姿猁}緩沖液中容易降解為無(wú)毒的磷酸鹽和磷酸酯，所以這一技術(shù)應(yīng)用在細(xì)胞探測(cè)中不會(huì)對(duì)細(xì)胞的生理機(jī)能產(chǎn)生影響。在其他探測(cè)實(shí)驗(yàn)中，探測(cè)溶劑的選取遵循使熒光穩(wěn)定存在，并且不對(duì)探測(cè)過(guò)程中使用的試劑以及實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響這一準(zhǔn)則。

步驟(2)中將化學(xué)或生物物質(zhì)加入到熒光變?nèi)醯娜芤褐?，?duì)化學(xué)或生物物質(zhì)進(jìn)行了清洗的處理；清洗所用的試劑不影響化學(xué)或生物物質(zhì)本身的特性，并且殘留在溶液中的清洗試劑也不會(huì)對(duì)熒光探針有影響，更不會(huì)影響到最終的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

步驟(2)進(jìn)行熒光恢復(fù)階段的實(shí)驗(yàn)時(shí)，將配制好的溶液加到化學(xué)或生物物質(zhì)中后，為了使溶液中各種成分得到充分反應(yīng)或結(jié)合，在測(cè)熒光之前溶液靜置一段時(shí)間，這段時(shí)間用鋁箔紙遮蓋測(cè)試的孔板(96孔板)。因?yàn)槿芤褐杏袩晒馑?，所以用鋁箔紙起到了遮光作用，可以防止外界的光源對(duì)熒光素的熒光產(chǎn)生影響。

本方法的探測(cè)范圍特別廣泛，涉及到化學(xué)污染物，農(nóng)藥，核酸、蛋白質(zhì)、細(xì)胞、生物分子等眾多物質(zhì)。

使用黑磷的優(yōu)越性在于，黑磷的表面積體積比大于石墨烯，于是結(jié)合化學(xué)或生物物質(zhì)的能力更強(qiáng)；其次黑磷比石墨烯易降解，黑磷在磷酸鹽緩沖液中容易降解為無(wú)毒的磷酸鹽和磷酸酯，所以這一技術(shù)應(yīng)用在生物體中不會(huì)對(duì)生物體的生理機(jī)能產(chǎn)生影響，不會(huì)危害生物體。黑磷超越石墨烯的最大優(yōu)點(diǎn)就在于擁有能隙，使其更容易進(jìn)行光探測(cè)。

附圖說(shuō)明

圖1為不同的黑磷濃度對(duì)熒光的淬滅效果圖；

圖2為不同的細(xì)胞數(shù)對(duì)熒光的恢復(fù)效果圖。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明的主要內(nèi)容是利用新型二維材料黑磷實(shí)現(xiàn)對(duì)生物物質(zhì)的探測(cè)。下面以探測(cè)細(xì)胞為例，簡(jiǎn)述一下實(shí)驗(yàn)方案。但本發(fā)明并不限于以下實(shí)施例。

實(shí)施例1

本實(shí)驗(yàn)中mcf7-fam的濃度均為其存在于混合溶液中的最終濃度，黑磷(bp)的濃度如10ul/80ul，表示每80ul溶液中含有10ul的黑磷。

首先，將熒光探針(mcf7-fam)溶于磷酸鹽緩沖液(pbs)中，mcf7-fam的最終濃度為1um、250nm、50nm、40nm，并測(cè)這些不同濃度試劑的熒光，激發(fā)波長(zhǎng)選擇470nm，輻射波長(zhǎng)范圍為500nm～560nm?？梢钥吹皆?20nm附近出現(xiàn)輻射譜的峰值。我們選擇一種合適的濃度，這種濃度的峰值熒光值在5000左右，這一濃度為50nm。后面的實(shí)驗(yàn)均采用mcf7-fam溶液的這一濃度。

其次，檢測(cè)黑磷對(duì)熒光的淬滅作用。

(1)選擇黑磷的三個(gè)濃度梯度：10ul/80ul、20ul/80ul、40ul/80ul。

(2)按照(1)中的黑磷濃度梯度配制bp-mcf7-fam溶液，溶劑均為pbs，mcf7-fam的最終濃度為50nm。將三種不同黑磷濃度的試劑按照每種三孔，每孔80ul加入到96孔板上測(cè)熒光。對(duì)照組選用50nm的mcf7-fam溶液，空白對(duì)照用pbs溶液。

(3)對(duì)熒光曲線分析發(fā)現(xiàn)，黑磷對(duì)熒光有淬滅效果。淬滅效果隨黑磷含量的增加而提升。黑磷為20ul/80ul時(shí)的淬滅效果理想。

再次，研究這一bp-mcf7-fam溶夜對(duì)細(xì)胞有探測(cè)作用。培養(yǎng)不同種類的細(xì)胞，其中包括mcf7細(xì)胞。

(1)取已培養(yǎng)的細(xì)胞于96孔板中，每種細(xì)胞三個(gè)孔，每個(gè)孔中有2萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，過(guò)夜培養(yǎng)，使細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)。

(2)配制前述濃度bp-mcf7-fam溶液以及mcf7-fam溶液。取出加有細(xì)胞的96孔板，吸出細(xì)胞培養(yǎng)基，用pbs清洗細(xì)胞。將bp-mcf7-fam溶液按每孔80ul加入到含有細(xì)胞的孔中。實(shí)驗(yàn)組對(duì)照組為三個(gè)孔分別加入80ul的bp-mcf7-fam溶液，空白對(duì)照組為三個(gè)孔加入80ul的pbs溶液。

(3)用鋁箔紙將96孔板遮蓋，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2h。

(4)取出96孔板測(cè)熒光曲線。發(fā)現(xiàn)被黑磷淬滅的熒光在mcf7細(xì)胞中得到了恢復(fù)，但是在其他細(xì)胞中并沒(méi)有得到恢復(fù)。這說(shuō)明這種特異性的結(jié)合物mcf7-fam可以識(shí)別mcf7細(xì)胞，使被淬滅的熒光素從黑磷上逃逸出來(lái)繼續(xù)發(fā)光。

圖1為不同的黑磷濃度對(duì)熒光的淬滅效果圖，不同bp濃度，50nmfam時(shí)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖，可以發(fā)現(xiàn)隨著黑磷濃度的增大，對(duì)熒光的淬滅效果越來(lái)越好。

最后，研究了細(xì)胞數(shù)目對(duì)熒光恢復(fù)的影響

(1)將已培養(yǎng)的細(xì)胞計(jì)數(shù)，并加入到96孔板。原則為：2萬(wàn)、1萬(wàn)、5千數(shù)目的細(xì)胞各加入三個(gè)孔。培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜，使細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)。

(2)配制bp-mcf7-fam溶液，bp的含量為20ul/80ul，mcf7-fam的最終濃度為50nm。

(3)取出96孔板，吸取細(xì)胞溶液中的培養(yǎng)基，用pbs清洗細(xì)胞。

(4)將bp-mcf7-fam溶液按照每孔80ul加入到實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞中。在空白對(duì)照組的孔中加入80ul的pbs溶液。實(shí)驗(yàn)對(duì)照組為三個(gè)空白孔中加入80ulbp-mcf7-fam溶液即可。

(5)用鋁箔紙遮蓋96孔板，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2h。

取出96孔板測(cè)熒光，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨著細(xì)胞數(shù)目的增加，熒光的恢復(fù)效果越好。

圖2為不同的細(xì)胞數(shù)對(duì)熒光的恢復(fù)效果圖，bp：20ul/80ul，fam的最終濃度為40nm，細(xì)胞的個(gè)數(shù)為2萬(wàn)，1萬(wàn)，5千。可以發(fā)現(xiàn)，隨著細(xì)胞數(shù)目的增多，熒光恢復(fù)的越好。