專利名稱:熒光發(fā)生分子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及用作標(biāo)記試劑的熒光發(fā)生分子,所述標(biāo)記試劑用于檢測(cè)核酸等的生物 體關(guān)聯(lián)物質(zhì)。更詳細(xì)地,本發(fā)明涉及一種分子,其是具有-O-C(Yl)化2)-隊(duì)表示的基團(tuán)的無(wú) 熒光性分子,其特征在于,該基團(tuán)還原為羥基或氧代基時(shí)產(chǎn)生熒光。進(jìn)而本發(fā)明涉及含有上 述熒光發(fā)生分子的標(biāo)記試劑、和使用上述熒光發(fā)生分子的目標(biāo)核酸序列的檢測(cè)方法。
背景技術(shù):
作為用于檢測(cè)具有特定的目標(biāo)核酸序列的核酸分子的方法,廣泛使用雜交法,該 雜交法使用具有與該目標(biāo)核酸序列相互補(bǔ)的堿基序列的探針。在雜交法中,準(zhǔn)備具有與目 標(biāo)核酸序列相互補(bǔ)的堿基序列的探針,僅具有與該探針堿基序列相互補(bǔ)的堿基序列的試樣 以高的選擇性進(jìn)行雜交。雜交的結(jié)果是形成了雜交物,作用用于檢測(cè)該雜交物的方法,可以 列舉用放射性同位素標(biāo)記探針核酸的方法、用熒光物質(zhì)標(biāo)記的方法、利用發(fā)光試劑的方法 等??捎糜跇?biāo)記核酸的熒光物質(zhì)可以列舉熒光素、四甲基若丹明、Cy3、Cy5等,但對(duì)于用這 些熒光物質(zhì)標(biāo)記的熒光核酸探針,本底熒光信號(hào)高,難以進(jìn)行高靈敏度測(cè)定。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是為了解決上述現(xiàn)有技術(shù)的問(wèn)題而作出的發(fā)明。即,本發(fā)明解決的課題在 于提供基因解析用的熒光on/off型熒光化合物(熒光發(fā)生分子體系),其穩(wěn)定性高(即長(zhǎng) 時(shí)間具有活性)、且靈敏度高,能夠放大微量的基因信號(hào)并進(jìn)行觀察。進(jìn)而,本發(fā)明解決的課 題在于提供使用上述熒光on/off型熒光化合物的、用于檢測(cè)生物體關(guān)聯(lián)物質(zhì)的標(biāo)記試劑。本發(fā)明人為了解決上述課題,進(jìn)行了深入研究,結(jié)果成功地合成了一種分子,其是 具有熒光素骨架等熒光物質(zhì)骨架,且分子內(nèi)具有-O-CH2-N3表示的基團(tuán)的無(wú)熒光性分子,其 特征在于,該-O-CH2-N3表示的基團(tuán)如果還原為羥基或氧代基則產(chǎn)生熒光。進(jìn)而發(fā)現(xiàn),通過(guò) 使得用上述無(wú)熒光性分子標(biāo)記了的第一核酸探針、和用具有還原作用的分子標(biāo)記了的第二 核酸探針與目標(biāo)核酸序列進(jìn)行雜交,將第一核酸探針中的無(wú)熒光性分子的-O-CH2-N3表示 的基團(tuán)還原為羥基或氧代基,由此生成熒光,通過(guò)檢測(cè)該生成的熒光,能夠檢測(cè)目標(biāo)核酸序 列。基于上述知識(shí)而完成了本發(fā)明。即,根據(jù)本發(fā)明,提供用下式⑴或⑵表示的化合物。[化1] (式中,X表示氫原子、或者羧酸的保護(hù)基團(tuán),R表示氫原子、鹵原子、或者用于與核 酸結(jié)合的反應(yīng)基團(tuán),Yl、Y2、Y3和Y4分別獨(dú)立地表示氫原子、碳原子數(shù)為1 6的烷基、碳 原子數(shù)為1 6的烷氧基、碳原子數(shù)為6 10的芳基、或者氰基)根據(jù)本發(fā)明的另一側(cè)面,提供了含有上述本發(fā)明化合物的、用于檢測(cè)生物體關(guān)聯(lián) 物質(zhì)的標(biāo)記試劑。優(yōu)選本發(fā)明的標(biāo)記試劑用于核酸的標(biāo)記。
優(yōu)選本發(fā)明的標(biāo)記試劑與還原劑組合使用。根據(jù)本發(fā)明進(jìn)而的另一側(cè)面,提供了目標(biāo)核酸序列的檢測(cè)方法,其含有下述工序 使具有與目標(biāo)核酸序列的一部分區(qū)域相互補(bǔ)的核酸序列的第一核酸探針、和具有與目標(biāo)核 酸序列的另一部分區(qū)域相互補(bǔ)的核酸序列的第二核酸探針與目標(biāo)核酸序列進(jìn)行雜交的工 序,和檢測(cè)通過(guò)將第一核酸探針中的無(wú)熒光性分子的-O-C(Yl) (Y2)-N3表示的基團(tuán)還原為 羥基或者氧代基而生成的熒光的工序;上述第一核酸探針用無(wú)熒光性分子標(biāo)記,所述無(wú)熒 光性分子具有選自熒光素骨架、咕噸骨架、試鹵靈骨架、香豆素骨架、吲哚骨架、或者喹唑啉 酮骨架中的骨架,且分子內(nèi)具有-O-C(Yl) (Y2)-N3表示的基團(tuán)(式中,Yl和Y2表示氫原子、 碳原子數(shù)為1 6的烷基、碳原子數(shù)為1 6的烷氧基、碳原子數(shù)為6 10的芳基、或者氰 基),上述第二核酸探針用具有還原作用的分子進(jìn)行了標(biāo)記。優(yōu)選上述無(wú)熒光性分子使用具有熒光素骨架,且分子內(nèi)具有-O-C (Yl) (Y2) -N3 (式 中,Yl和Y2表示氫原子、碳原子數(shù)為1 6的烷基、碳原子數(shù)為1 6的烷氧基、碳原子數(shù) 為6 10的芳基、或者氰基)表示的基團(tuán)的無(wú)熒光性分子。優(yōu)選上述無(wú)熒光性分子使用上述本發(fā)明的化合物。優(yōu)選目標(biāo)核酸序列為RN A0優(yōu)選檢測(cè)目標(biāo)核酸序列的單核苷酸多態(tài)性。優(yōu)選可檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的目標(biāo)核酸序列。
優(yōu)選可用流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光,來(lái)挑選發(fā)出熒光的細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明,提供以-O-C(Yl)化2)_隊(duì)表示的基團(tuán)的還原反應(yīng)為啟動(dòng)(trigger) 的熒光發(fā)生分子體系。本發(fā)明的體系可適用于具有羥基的熒光化合物。進(jìn)而根據(jù)本發(fā)明, 提供應(yīng)用該熒光發(fā)生分子體系、用于檢測(cè)生物體關(guān)聯(lián)物質(zhì)的標(biāo)記試劑。本發(fā)明的標(biāo)記試劑 可通過(guò)結(jié)合在目標(biāo)DNA或RNA分子上、并進(jìn)行還原而發(fā)出熒光。本發(fā)明的化合物由于具有 高的信號(hào).本底比,因而可以高靈敏度地進(jìn)行基因檢測(cè),同時(shí)可進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)、生物體內(nèi)的基 因檢測(cè)成像。進(jìn)而本發(fā)明由于不需要使用其它的試劑、酶,因此是簡(jiǎn)單.便宜的,不僅在試 管內(nèi),而且可進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)或生物體內(nèi)的基因檢測(cè)。進(jìn)而,對(duì)于本發(fā)明的標(biāo)記試劑,其穩(wěn)定性 高(長(zhǎng)期具有活性)且靈敏度高,可放大并觀察微量的基因信號(hào)。進(jìn)而,本發(fā)明的標(biāo)記試劑 由于不需要使用試劑、酶,因此簡(jiǎn)單·便宜,不僅在試管內(nèi),而且可進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)或生物體內(nèi)的 基因檢測(cè)。
具體實(shí)施例方式以下,對(duì)于本發(fā)明的實(shí)施方式進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。本發(fā)明開(kāi)發(fā)的熒光發(fā)生分子體系可作為熒光on/off型感應(yīng)體系來(lái)普及,該熒光 on/off型感應(yīng)體系以甲基疊氮基的還原作為啟動(dòng),引起無(wú)熒光性分子的結(jié)構(gòu)變化而發(fā)出熒 光(圖1)。作為本發(fā)明的實(shí)施例,合成了將熒光分子熒光素進(jìn)行化學(xué)修飾,導(dǎo)入甲基疊氮基 而得到的分子(圖2)。將熒光素單烷基化。接著,通過(guò)將羥基進(jìn)行硫代甲基化,進(jìn)而加入疊 氮化鈉等,得到疊氮化物。最后,通過(guò)將烷基進(jìn)行琥珀酰亞胺化,而得到作為目的物的熒光 素的單甲基疊氮衍生物(圖2的化合物4)。另外,遵循同樣的合成順序,得到熒光素的雙甲 基疊氮衍生物(圖2的化合物8)(圖2)。對(duì)該熒光素的單甲基疊氮衍生物(圖2的化合物4)和雙甲基疊氮衍生物(圖2 的化合物8)的熒光特性進(jìn)行解析。單甲基疊氮衍生物(圖2的化合物4)和雙甲基疊氮衍 生物(圖2的化合物8)為無(wú)熒光性的,相對(duì)于此,將它們用還原劑處理后,疊氮基轉(zhuǎn)變?yōu)?羥基,表現(xiàn)出高的熒光性。與處理前相比,熒光強(qiáng)度增加至約300倍(圖2的化合物4),約 2600倍(圖2的化合物8)(圖3)。進(jìn)一步地,開(kāi)發(fā)了基因檢測(cè)用“化學(xué)反應(yīng)探針”,其在核酸鏈中導(dǎo)入了上述合成的 作為熒光發(fā)生分子體系的甲基疊氮衍生物(圖2的化合物4)(圖2的化合物8)。本發(fā)明 開(kāi)發(fā)的2種DNA探針在目標(biāo)DNA或RNA上與目標(biāo)序列特異性結(jié)合,開(kāi)始化學(xué)反應(yīng)(還原反 應(yīng))并發(fā)出高強(qiáng)度的熒光(圖4)。通過(guò)以該熒光信號(hào)的有無(wú)或強(qiáng)度作為指標(biāo),可以區(qū)別或檢測(cè)核酸序列。本反應(yīng)不 需要其它的試劑、酶,僅將探針加入到檢測(cè)樣品中即可進(jìn)行測(cè)定。使用本探針,進(jìn)行了白血病原因基因序列的檢測(cè)試驗(yàn)。目標(biāo)DNA序列和合成的探 針示于圖6A。為了確認(rèn)目標(biāo)序列特異性信號(hào)的產(chǎn)生,測(cè)定在不存在目標(biāo)序列的條件下熒光 信號(hào)的經(jīng)時(shí)變化并進(jìn)行比較。其結(jié)果是,本探針在目標(biāo)序列存在時(shí),可顯著增大熒光信號(hào)。 另一方面,在不存在目標(biāo)序列的情況下,幾乎觀察不到熒光信號(hào)的增加(圖6B:單甲基疊氮 衍生物(圖2的化合物4),圖6C 雙甲基疊氮衍生物(圖2的化合物8))。因此,可知本探 針以目標(biāo)核酸序列特異性的方式產(chǎn)生熒光信號(hào)。另外,也可以識(shí)別單核苷酸變異(SNP)(圖 6D)。
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進(jìn)而,本檢測(cè)反應(yīng)可在等溫條件下,重復(fù)(回転)反應(yīng)循環(huán),放大熒光信號(hào)(圖5)。 因此,可進(jìn)行微量樣品的測(cè)定。即使在細(xì)胞內(nèi)或生物體內(nèi),也可以使用本探針進(jìn)行基因表達(dá) 的觀測(cè)。實(shí)際上,當(dāng)降低目標(biāo)序列濃度作為轉(zhuǎn)換條件時(shí),可得到約50左右的轉(zhuǎn)換數(shù),因此可 知,本熒光發(fā)生體系在等溫條件下可進(jìn)行50倍左右的信號(hào)放大(圖7)。本發(fā)明的化合物(熒光發(fā)生分子)是如下式(1)或者(2)所示的化合物。 (式中,X表示氫原子、或者羧酸的保護(hù)基團(tuán),R表示氫原子、鹵原子、或者用于與核 酸結(jié)合的反應(yīng)基團(tuán),Yl、Y2、Y3和Y4分別獨(dú)立地表示氫原子、碳原子數(shù)為1 6的烷基、碳 原子數(shù)為1 6的烷氧基、碳原子數(shù)為6 10的芳基、或者氰基)。對(duì)X所表示的羧酸的保護(hù)基團(tuán)的種類沒(méi)有特別地限定,可以列舉碳原子數(shù)為1 6的烷基、琥珀酰亞胺基、疊氮基、對(duì)硝基苯基、鹵素等具有離去能力的官能團(tuán)。R表示的鹵原子可以列舉氟原子、氯原子、溴原子、或者碘原子。作為R表示的用于與核酸結(jié)合的反應(yīng)基團(tuán),可以列舉被保護(hù)的酰胺基、氨基、羧酸 基、乙炔基、鹵素、疊氮基、硫羥基、醛基等。它們可以具有連接基團(tuán)。作為酰胺基的保護(hù)基 團(tuán),可以列舉叔丁氧基羰基等的氨基甲酸酯系保護(hù)基團(tuán)、苯甲酰基等的?;当Wo(hù)基團(tuán)、三 苯甲基等的烷基系保護(hù)基團(tuán)、二甲基乙縮醛等的亞胺系保護(hù)基團(tuán)等。取代基優(yōu)選為可與核 酸反應(yīng)并結(jié)合的反應(yīng)性基團(tuán),可以列舉例如鹵原子等。作為R表示的用于與核酸結(jié)合的反 應(yīng)基團(tuán)的具體例子,可以列舉-C = C-CH2-NHCO-CH2Br、-N3> -C = CH、_SH、-NH2^-CO2H, -CHO寸。根據(jù)本發(fā)明,通過(guò)使具有與目標(biāo)核酸序列的一部分區(qū)域相互補(bǔ)的核酸序列的第一 核酸探針、和具有與目標(biāo)核酸序列的另一部分區(qū)域相互補(bǔ)的核酸序列的第二核酸探針與 目標(biāo)核酸序列進(jìn)行雜交,而將第一核酸探針中的無(wú)熒光性分子的-O-C(Yl) (Y2)-N3表示的基團(tuán)還原為羥基或者氧代基,由此生成熒光,通過(guò)檢測(cè)由此生成的熒光可以檢測(cè)目標(biāo)核酸 序列,上述第一核酸探針用無(wú)熒光性分子標(biāo)記,所述無(wú)熒光性分子具有選自熒光素骨架、 咕噸骨架、試商靈骨架、香豆素骨架、吲哚骨架、或者喹唑啉酮骨架中的骨架,且分子內(nèi)具 有-O-C(Yl) (Y2)-N3表示的基團(tuán)(式中,Yl和Y2表示氫原子、碳原子數(shù)為1 6的烷基、碳 原子數(shù)為1 6的烷氧基、碳原子數(shù)為6 10的芳基、或者氰基),上述第二核酸探針用具 有還原作用的分子進(jìn)行了標(biāo)記。熒光素骨架、咕噸骨架、試鹵靈骨架、香豆素骨架、吲哚骨架、和喹唑啉酮骨架的具 體結(jié)構(gòu)如下所示。[化 3] R1 =烷基、?;⒎蓟?、甲硅烷基 R1 =烷基、?;?、芳基、甲硅烷基R2 =烷基、?;?、芳基、甲硅烷基、烷氧基R3 = 0、N、S、鹵素R4 =烷基、horogen、0、N、S R1 =烷基、酰基、芳基、甲硅烷基、-CH2N3 R2 =焼基、 ?;?、芳基、甲硅烷基、烷氧基 R3 = 0、N、S、鹵素R4 =燒基、horogen、0、N、S [化4] X = 0、N、烷基R4 =燒基、horogen、0、N、S R = H、CH3、CF3 等R4 =燒基、horogen、0、N、S Xl =鹵素、H Χ2 = H、CH3
喹唑啉酮骨架R4 =烷基、horogen、0、N、S在本發(fā)明中,烷基可以列舉例如碳原子數(shù)為1 6的烷基,其可以是直鏈或支鏈的 任一種,具體來(lái)說(shuō),可以列舉甲基、乙基、丙基、丁基、戊基或者己基。在本發(fā)明中,?;梢粤信e碳原子數(shù)為1 6的?;唧w來(lái)說(shuō),可以列舉乙?;?、
丙?;?。在本發(fā)明中,芳基可以列舉例如碳原子數(shù)為6 10的芳基,具體來(lái)說(shuō),可以列舉苯
基、萘基等。在本發(fā)明中,烷氧基可以列舉碳原子數(shù)為1 6的烷氧基,其可是直鏈或支鏈的任 一種,具體來(lái)說(shuō),可以列舉甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、戊氧基或者己氧基等。在本發(fā)明中,鹵原子可以列舉氟原子、氯原子、溴原子或者碘原子。本發(fā)明中使用的第一核酸探針用無(wú)熒光性分子標(biāo)記,該無(wú)熒光性分子具有上述骨 架,且分子內(nèi)具有-O-C(Yl) (Y2)-N3所示的基團(tuán)(式中,Yl和Y2為氫原子、碳原子數(shù)為1 6的烷基、碳原子數(shù)為1 6的烷氧基、碳原子數(shù)為6 10的芳基或者氰基)。本發(fā)明中使用的第二核酸探針用具有還原作用的分子標(biāo)記。作為可在本發(fā)明中 使用的表現(xiàn)還原作用的分子,可以列舉硫化合物、三價(jià)的磷化合物等。硫化合物可以列舉 DTT(二硫蘇糖醇),三價(jià)的磷化合物可以列舉三苯基膦、烷基膦等。在本發(fā)明中,第一核酸探針具有與目標(biāo)核酸序列的一部分區(qū)域相互補(bǔ)的核酸序 列,第二核酸探針具有與目標(biāo)核酸序列的另一部分區(qū)域相互補(bǔ)的核酸序列。這里,第一核 酸探針和第二核酸探針各自識(shí)別的目標(biāo)核酸序列的區(qū)域只要滿足下述條件,就可以任意地 設(shè)定,所述條件是當(dāng)上述的兩探針與目標(biāo)核酸序列雜交時(shí),第一核酸探針中無(wú)熒光性分子 的-O-C(Yl) (Y2)-N3表示的基團(tuán)可通過(guò)第二核酸探針中具有還原作用的分子的作用而被還 原為羥基或者氧代基。為了滿足上述條件,第一核酸探針和第二核酸探針各自識(shí)別的目標(biāo) 核酸序列的區(qū)域一般優(yōu)選鄰接或靠近。第一核酸探針和第二核酸探針各自識(shí)別的目標(biāo)核酸 序列的區(qū)域優(yōu)選例如隔著1 10個(gè)堿基左右的間隔而靠近。利用以下實(shí)施例更具體地說(shuō)明本發(fā)明,但本發(fā)明不被實(shí)施例所限定。實(shí)施例實(shí)施例1 熒光素的單甲基疊氮衍生物的有機(jī)合成(1)單烷基熒光素(圖2的化合物1)的合成將熒光素(3. OOg, 9. 03mmol)和碘化鈉(271mg,1. 81mmol)在冰浴中溶解于 DMF(50mL)中,并添加溶解在THF (30mL)中的叔丁醇鉀(3. 04g,27. Immol)。溶液變得透明 后,緩慢加入溴乙酸甲酯(944 μ L,9. 94mmol),一邊緩緩恢復(fù)到室溫,一邊攪拌2. 5小時(shí)。反 應(yīng)用EtOAc終止,用H2O和鹽水(brine)進(jìn)行分液。將有機(jī)層用Na2SO4干燥后,用快速柱色 譜法(硅石,梯度洗脫液30 1 CHCl3/MeOH到20 lCHCl3/Me0H+0. 5 %三乙胺)純化殘
10渣。得到的單烷基熒光素(圖2的化合物1)為透明液體(820mg,23% )。[化5] IH 匪R (400MHz,CD3OD) δ 7. 91 (1Η, d, J = 7. 32Hz),7· 62 (2H,dt, J = 16.40, 15. 10Hz),7. 10 (1H, d, J = 7.
QSTAR(Applied Biosystems/MDS SCIEX) (ESI) :m/z 404. 0896[MH+]C23H1607 405. 0974,檢測(cè)值:405. 0987(2)單烷基硫甲基熒光素(圖2的化合物2)的合成將單烷基熒光素(圖2的化合物1) (720mg, 1. 78mmol)在Ar氛圍下溶解于脫水 CH3CN(36ml)中。添加氧化銀(620mg,2. 67mmol)、氯甲基甲基硫醚(223 μ 1,2. 67mmol)和 5滴吡啶,在40°C攪拌15小時(shí)。然后將反應(yīng)液進(jìn)行硅藻土過(guò)濾,并濃縮后,用快速柱色譜法 (己烷/AcOEt從6 1到2 1(ν/ν)+0. 5%三乙胺)純化。得到的單烷基硫甲基熒光素 (圖2的化合物2)為黃色的結(jié)晶(206mg,25% )。[化 6]IH NMR(400MHz, CDC13) δ 8. 01 (1Η, d, J = 7. 08Hz),7· 64 (2H,dt, J = 16. 10, 15. 10Hz),7. 15 (1H, d, J = 7. 56Hz),6. 83 (1H, d, J = 2. 44Hz),6. 83-6. 62 (5H, m),5. 15 (2H, s),4. 66 (2H, s),3. 80 (3H, s),2. 24 (3H, s)13C NMR(100MHz, CDC13) δ 168. 94,168. 43,159. 04,152. 64,151. 86,134. 80, 129. 08,128. 87,126. 41,124. 75,123. 78,112. 66,102. 82,101. 65,82. 57,72. 34,65. 12, 52. 27,14. 59QSTAR(Applied Biosystems/MDS SCIEX) (ESI) :m/z 464. 0930[MH+]C25H2007S 465. 1008,檢測(cè)值465. 1004(3)單烷基疊氮甲基熒光素(圖2的化合物3)的合成在二氯甲烷(7ml)中溶解單烷基硫甲基熒光素(圖2的化合物2)(164mg, 350μπιΟ1)。接著,添加N-氯代琥珀酰亞胺(51.8π^,390μπιΟ1)和三甲基甲基甲硅烷基氯
化物(卜丨J 乂子卟乂子卟〉丨J卟夕口,4 F ) (42. Omg, 390 μ mol),攪拌1小時(shí),用Na2CO3 水溶液終止反應(yīng)。用CHCl3進(jìn)行2次分液,將有機(jī)層濃縮后,進(jìn)行真空干燥。將殘?jiān)芙庥?DMF (7ml)中,添加溶解在3. 5ml H2O中的疊氮化鈉(34. 4mg,530mmol),室溫下攪拌1小時(shí), 用Na2CO3水溶液終止反應(yīng)。用AcOEt進(jìn)行2次分液,將有機(jī)層濃縮后,用快速柱色譜法(己 烷/AcOEt從5 1到3 2 (ν/ν)+0.5%三乙胺)純化。得到的單烷基疊氮甲基熒光素 (圖2的化合物3)為黃色的結(jié)晶(71. 3mg,44% )。 [化 7] IH NMR(400MHz, CDC13) δ 8. 02 (1Η, d, J = 7. 80Hz) ,7. 65 (2H, dt, J = 15. 2, 14. 9Hz),7. 16 (1H, d, J = 7. 32Hz),6. 90 (1H, d, J = 2. 20Hz),6. 76-6. 63 (5H, m),5. 18 (2H, s),4. 66 (2H, s),3. 82 (3H, s)13C NMR(1 OOMHz, CDC13) δ 169. 02,168. 54,157. 87,152. 64,152. 76,152. 08, 134. 95,129. 70,129. 27,126. 46,124. 95,123. 80, 111. 79,103. 26,101. 80,82. 46,79. 43, 65. 27,52. 42QSTAR(Applied Biosystems/MDS SCIEX)(ESI) [MH+]C24H17N307 :460.1145,檢 測(cè)值:460. 1134(4)單烷基疊氮甲基熒光素的合成將單烷基疊氮甲基熒光素(圖2的化合物3) (27. 8mg,60ymol)溶解在甲醇 (605 μ 1)中,并添加 IM NaOHaq. (66. 6 μ 1,66. 6 μ mol),攪拌 1 小時(shí)。用 0. IM HCl 終止反 應(yīng),用AcOEt進(jìn)行2次分液,將有機(jī)層濃縮后,用快速柱色譜法(CHCl3/MeOH從30 1到 20 l(v/v)+0.5%三乙胺)進(jìn)行純化。得到的單烷基疊氮甲基熒光素(下述化合物)為 黃色的結(jié)晶(28. 2mg,105% )0[化 8] IH NMR(400MHz, CDC13) δ 8. 01 (1Η, d, J = 7. 32Hz) ,7. 64(2H, dt, J = 14. 9, 15. 2Hz),7. 16 (1H, d, J = 7. 56Hz),6. 88 (1H, d, J = 2. 20Hz),6. 82 (1H, d, J = 2. 20Hz), 6. 73-6. 63 (4H, m),5. 18 (2H, s),4. 51 (2H, s)13C NMR(1 OOMHz, CDC13) δ 173. 69,169. 17,157. 76,152. 79,152. 30,134. 83, 129. 23,128. 61,126. 62,124. 82,123. 91,112. 30,103. 22,101. 74,82. 50,79. 41,67. 57
QSTAR(Applied Biosystems/MDS SCIEX)(ESI) :m/z 445.0910[ΜΗ+]C23H1507N3 446. 0988,檢測(cè)值468. 0808(5)疊氮甲基熒光素NHS酯(圖2的化合物4)將上述(4)得到的單烷基疊氮甲基熒光素(4.60mg,10.3ymol)和N-羥基琥珀酰 亞胺(1.30mg, 11.4ymol)溶解在 DMF (205 μ 1)中,添加 DCC (2. 35mg,11. 4 μ mol),在室溫下 攪拌48小時(shí)。將析出的結(jié)晶用過(guò)濾器過(guò)濾后,將殘?jiān)苯佑糜谂c3’氨基DNA的偶聯(lián)。[化9] 實(shí)施例2 熒光素的雙甲基疊氮衍生物的有機(jī)合成(1)碘熒光素(圖2的化合物5)的合成將熒光素(1. 60g,4. 61mmol)溶解在12N HCl (16. 4ml)和8. 2g的冰中。緩慢添加 亞硝酸鈉水溶液(397mg,5. 76mmol,8. 2ml),攪拌2. 5小時(shí)。緩慢添加碘化鉀水溶液(15. 3g, 92. 2mmol, 13. 2ml),使反應(yīng)液緩慢恢復(fù)至室溫。反應(yīng)5小時(shí)后,用CHCl3終止反應(yīng),用H2O和 鹽水分液。將有機(jī)層用Na2SO4干燥后,將殘?jiān)每焖僦V法(硅石,梯度洗脫10 1己 烷/AcOEt到3 1己烷/AC0Et(v/v)+0.5%三乙胺)進(jìn)行純化。得到的碘熒光素(圖2的 化合物5)為黃色的結(jié)晶(lg,47% )。[化 10] IH NMR (400MHz, CD30D) δ 8. 33-8. 31 (1H,m),8. 08-8. 04 (1H,m),7. 00-6. 96 (1H, m) ,6. 67-6. 50 (4H, m)13C NMR(100MHz, CD30D) δ 169. 5,161. 3,153. 9,145. 1,134. 7,130. 3,130. 0, 127. 1,113. 6,110. 7,103. 5,95. QSTAR(Applied Biosystems/MDS SCIEX)(ESI) :m/z 457. 9651[MH+]C20H11105 458. 9729,檢測(cè)值458. 9721(2)三甲基熒光素(圖2的化合物6)的合成將碘熒光素(圖2的化合物5) (lg,2. 18mmol)在Ar氛圍下溶解于脫水 CH3CN (36ml)。添加氧化銀(1.52g,6. 55mmol)、氯甲基甲基硫醚(550 μ 1,6. 55mmol)和 5 滴 吡啶,在40°C攪拌24小時(shí)。然后將反應(yīng)液進(jìn)行硅藻土過(guò)濾,濃縮后,用快速柱色譜法(己烷 /AcOEt從10 1到3 l(v/v)+0.5%三乙胺)進(jìn)行純化。得到的三甲基熒光素(圖2的 化合物6)為黃色的結(jié)晶(234mg,19% )0[化11] IH NMR (400MHz, CDC13) δ 8. 35 (1Η, s),7. 96 (1H, d, J = 8. 1Hz),6· 92 (1Η, d, J = 8. 3Ηζ),6. 83 (2Η, d, J = 2. 2Ηζ),6. 73-6. 65 (4Η, m),5. 16 (4Η, s),2. 26 (6H, s)13C NMR(1 OOMHz, CDC13) δ 167. 3,158. 6,152. 2,152. 0,143. 6,133. 9,128. 9, 128. 6,125. 6,112. 9,111. 3,103. 0,94. 9,83. 1,72. 5,14. 8QSTAR(Applied Biosystems/MDS SCIEX) (ESI) :m/z 577. 9719 [MH+] C24H19I05S2 :578. 9797,檢測(cè)值:578. 9775(3)疊氮甲基熒光素(圖2的化合物7)的合成將三甲基熒光素(圖2的化合物6) (200mg,350ymol)溶解在二氯甲烷(7ml)中。 接著,添加N-氯代琥珀酰亞胺(102mg,760ymol),在室溫下攪拌2小時(shí)。然后,添加三甲 基氯硅烷(97. 3 μ 1,760 μ mo 1)并攪拌6小時(shí),用Na2CO3水溶液終止反應(yīng)。用CHCl3進(jìn)行2 次分液,將有機(jī)層濃縮后,進(jìn)行真空干燥。在DMF(7ml)中溶解殘?jiān)?,并加入溶解?. 5mlH20 中的疊氮化鈉(67. 5mg, 1. (Mmmol),在室溫下攪拌30小時(shí),用Na2CO3水溶液終止反應(yīng)。用 AcOEt進(jìn)行2次分液,將有機(jī)層濃縮后,用快速柱色譜法(己烷/AcOEt從10 1到3 1 (ν/ ν)+0.5%三乙胺)進(jìn)行純化。得到的疊氮甲基熒光素(圖2的化合物7)為黃色的結(jié)晶 (41. Omg, 21% )。[化12]IH NMR (400MHz, CDC13) δ 8. 36 (1Η, s),7. 99-7. 97 (1H, m),6. 94-6. 90 (3H, m), 6. 77-6. 70 (4H, m),5. 19 (4H, s)13C NMR(1 OOMHz, CDC13) δ 167. 3,158. 1,152. 1,152. 0,143. 7,134. 0,129. 2, 128. 5,125. 5,112. 7,112. 3,103. 4,95. 0,82. 6,79. 4QSTAR(Applied Biosystems/MDS SCIEX) (ESI) :m/z 567. 9992 [MH+] C22H13IN605 :569. 0070,檢測(cè)值569. 0065(4)溴乙酰基乙炔連接物的合成在冰浴中將炔丙基胺(116. 28 μ 1,1. 82mmol)和碳酸鉀(251mg, 1. 82mmol)溶解于 苯(18. 2ml),添加溴乙?;?159 μ 1,1. 82mmol)并攪拌20小時(shí)。用Ether/H20進(jìn)行2次
分液,濃縮有機(jī)層。殘?jiān)?118mg,37. 1% )直接用于下面的反應(yīng)。[化13] QSTAR(Applied Biosystems/MDS SCIEX) (ESI) :m/z 174. 9633[ΜΗ+]C5H6BrN0 175. 9711,檢測(cè)值:175. 9703(5)疊氮甲基溴乙酰連接熒光素(圖2的化合物8)的合成將疊氮甲基熒光素(圖2的化合物7) (50mg,88ymol)溶解在THF (1.6ml)中,并添 加四(三苯基膦)合鈀(10. 2mg,8. 8μπιο1)、碘化銅(3. 35mg,1. 8 μ mol)、三乙胺(61·9μ 1, 440 μ mol),最后加入溴乙?;胰策B接物(77. Omg,440 μ mol)并攪拌3小時(shí)。將析出的化 合物用過(guò)濾器過(guò)濾除去后,使用快速柱色譜法(己烷/AcOEt從5 1到1 l(v/v)+0.5% 三乙胺)純化殘?jiān)?。得到的疊氮甲基溴乙酰連接熒光素(圖2的化合物8)為黃色的結(jié)晶 (20mg,37% )。[化14] IH NMR (400MHz, CDC13) δ 8. 06 (1Η, s), 7. 70 (1Η, d, J = 8. 04),7. 27 (2H,s), 7. 11 (1H, d, J = 8. 1),6· 91 (2Η, d, J = 2. 2),6· 77-6. 69 (4Η,m),5· 19 (4Η, s),4· 36 (2Η, d, J =5. 6),3. 94 (1Η, s),3. 76 (1Η, s)13C NMR(100MHz, CDC13) δ 168. 1,166. 6,158. 0,152. 3,152. 0,138. 2,131. 8, 129. 2,128. 3,123. 9,113. 0,112. 6,112. 5,103. 4,86. 7,82. 5,81. 8,79. 4,30. 9,28. 8QSTAR(Applied Biosystems/MDS SCIEX) (ESI) :m/z 615. 0502 [ΜΗ+] C27H18BrN706 :616. 0580,檢測(cè)值616. 0578實(shí)施例3 熒光強(qiáng)度的測(cè)定對(duì)實(shí)施例1和實(shí)施例2中得到的熒光素的單甲基疊氮衍生物(圖2的化合物4)和 雙甲基疊氮衍生物(圖2的化合物8)的熒光特性進(jìn)行解析。單甲基疊氮衍生物(圖2的 化合物4)和雙甲基疊氮衍生物(圖2的化合物8)為無(wú)熒光性的,相對(duì)于此,將它們用還原 劑進(jìn)行處理后(化合物4 用IOOmM的二硫蘇糖醇在室溫條件下進(jìn)行2小時(shí)的反應(yīng),化合物 8 用三羧甲基膦在室溫條件下進(jìn)行1小時(shí)的反應(yīng)),疊氮基轉(zhuǎn)化為羥基,表現(xiàn)高的熒光性。 與處理前相比,熒光強(qiáng)度增加至約300倍(圖2的化合物4),約2600倍(圖2的化合物8) (圖 3)。
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實(shí)施例4 低聚核苷酸的合成具有圖6A中記載的堿基序列(也記載在序列表的SEQ ID NO. 1 3中)的低聚 核苷酸使用0. 2 μ M等級(jí)的柱子,根據(jù)一般的亞磷酰胺法(* 7 * π 7· S夕-4卜法),利用 DNA自動(dòng)合成機(jī)(H-8-SE ;Gene World)來(lái)合成。堿基的脫保護(hù)和從CPG載體上的脫離通 過(guò)在氨水中、在55°C孵育4小時(shí)來(lái)進(jìn)行。低聚核苷酸的純化利用反相柱(MicroPure II; BiosearchTechnologies)來(lái)進(jìn)行,通過(guò)測(cè)定UV吸光度來(lái)確定濃度。實(shí)施例5 :5’結(jié)合了三苯基膦的DNA的合成三苯基膦基的加成通過(guò)與5’-氨基修飾低聚物(★ 'J 3 )反應(yīng)來(lái)進(jìn)行。在5’-氨 基修飾低聚物的合成中,使用5,-amino-modifier 5 (GlenResearch)。反應(yīng)通過(guò)將含有8mM 三苯基膦NHS酯(在DMF中)、50mM四硼酸鈉緩沖液、200 μ M 5’ -氨基修飾低聚物溶液的 混合液、在室溫下劇烈攪拌3小時(shí)來(lái)進(jìn)行(反應(yīng)液中的DMF濃度為46% )。將反應(yīng)產(chǎn)物以 乙醇沉淀的形式回收后,利用反相HPLC(梯度條件0-50%乙腈/50mM三乙基乙酸銨)進(jìn)行 純化。另外,利用ESI-TOF質(zhì)譜可以確認(rèn)得到目的產(chǎn)物。實(shí)施例6 :3’結(jié)合了疊氮甲基熒光素的DNA的合成疊氮甲基熒光素NHS酯(圖2的化合物4)的加成通過(guò)與3’ -硫代磷酸DNA反應(yīng) 來(lái)進(jìn)行。3’ -硫代磷酸低聚物的合成如下進(jìn)行,即,在3’ -磷酸CPG上偶聯(lián)起始的單體后, 用sulfrizing reagent (Glen research)進(jìn)行硫代磷酸酯化。反應(yīng)通過(guò)將含有3mM溴乙酰 胺-RhllO-疊氮化物(在DMF中)、80mM三乙銨雙碳酸酯緩沖液、300 μ M 3,-硫代磷酸低 聚物溶液的混合液、在室溫下劇烈攪拌5小時(shí)來(lái)進(jìn)行(反應(yīng)液中的DMF濃度為80% )。將 反應(yīng)產(chǎn)物以乙醇沉淀的形式回收,然后利用反相HPLC(梯度條件0-80%乙腈/50mM三乙基 乙酸銨)進(jìn)行純化。另外,通過(guò)ESI-TOF質(zhì)譜確認(rèn)可以得到目標(biāo)產(chǎn)物。疊氮甲基溴乙酰連 接熒光素(圖2的化合物8)的加成也用同樣的方法進(jìn)行。實(shí)施例7 =DNA模板上的反應(yīng)和熒光測(cè)定DNA模板上的反應(yīng)如下進(jìn)行,S卩,在緩沖液中(20mM Tris-HCl, IOOmM MgCl2 6H20, 0. 01mg/ml BSA ;pH 7. 2),分別使50nM的DNA模板、結(jié)合了 5,-三苯基膦的探針、結(jié)合了 3’ _疊氮甲基熒光素的探針在37°C進(jìn)行反應(yīng)。熒光信號(hào)使用熒光分光光度計(jì)(FP-6500 ; JASC0)來(lái)解析。每隔30秒測(cè)定一次熒光,激發(fā)波長(zhǎng)為490nm,熒光波長(zhǎng)為520nm。為了確認(rèn)目標(biāo)序列特異性信號(hào)的產(chǎn)生,測(cè)定在不存在目標(biāo)序列的條件下熒光信號(hào) 的經(jīng)時(shí)變化并進(jìn)行比較。其結(jié)果是,本探針在存在目標(biāo)序列時(shí),可顯著增大熒光信號(hào)。另一 方面,在不存在目標(biāo)序列的情況下,幾乎觀察不到熒光信號(hào)的增加(圖6B 單甲基疊氮衍生 物(圖2的化合物4),圖6C 雙甲基疊氮衍生物(圖2的化合物8))。因此,可知本探針以 目標(biāo)核酸序列特異性的方式產(chǎn)生熒光信號(hào)。另外,也可以識(shí)別單核苷酸變異(SNP)(圖6D)。實(shí)施例8:轉(zhuǎn)換數(shù)的測(cè)定轉(zhuǎn)換數(shù)的測(cè)定如下進(jìn)行,即,分別在50nM的5’結(jié)合了三苯基膦的探針、3’結(jié)合了 疊氮甲基熒光素的探針中,添加5nM(相對(duì)于探針為0. 1等量)、0. 5nM(相對(duì)于探針為0. 01 等量)、0.05nM(相對(duì)于探針為0.001等量)的DNA模板,在緩沖液中(20mM Tris-HCl, IOOmM MgCl2 6Η20,0· 01mg/ml BSA ;pH 7. 2)在37°C使其反應(yīng)。熒光信號(hào)使用熒光分光光度 計(jì)(FP-6500 JASC0)進(jìn)行解析。每隔30秒測(cè)定一次熒光,激發(fā)波長(zhǎng)為490nm、熒光波長(zhǎng)為 520nm,測(cè)定4小時(shí)。由4小時(shí)后各自的熒光信號(hào),求得向羥基轉(zhuǎn)化的物質(zhì)量,將其除以模板的物質(zhì)量,由此求得轉(zhuǎn)換數(shù)。測(cè)定結(jié)果示于圖7。實(shí)際上,當(dāng)降低目標(biāo)序列濃度作為轉(zhuǎn)換條件時(shí),可得到約50左右的轉(zhuǎn)換數(shù),因此 可知,本熒光發(fā)生體系在等溫條件下可進(jìn)行50倍左右的信號(hào)放大(圖7)。實(shí)施例9 :HL60 cell細(xì)胞內(nèi)RNA的檢測(cè)(熒光顯微鏡,F(xiàn)ACS)將在RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)的HL60細(xì)胞用無(wú)Mg、Ca的PBS洗滌2次。對(duì)于洗 滌的細(xì)胞,向各室中加入 300 μ L 的 50U/ml StreptolysinO (SL0 ;Sigma-aldrich),在室溫 下孵育15分鐘。此時(shí),SLO使用在IOOmM的DTT中孵育2小時(shí)而充分活化的物質(zhì)。15分 鐘的孵育后,加入圖8 (SEQ ID NO. 4 7)和圖9 (SEQ ID NO. 8 19)所示的各探針使它們 為ΙΟΟηΜ,再孵育5分鐘。然后,在各孔中添加300uL含有0. 2g/LCaCl2的MEM培養(yǎng)基,進(jìn)行 SLO的不活潑化。進(jìn)而,在4°C孵育lhr。檢出的細(xì)胞在熒光顯微鏡(Zeiss)下,使用激發(fā) 470/40,熒光525/50的濾色片進(jìn)行拍攝。同樣,進(jìn)行使用流式細(xì)胞儀(《〃々7 >二一> 夕一)的檢測(cè)。結(jié)果示于圖8和圖9??梢詸z測(cè)細(xì)胞內(nèi)RNA。產(chǎn)業(yè)實(shí)用性可以提供應(yīng)用本發(fā)明的熒光發(fā)生分子體系、用于檢測(cè)生物體關(guān)聯(lián)物質(zhì)的標(biāo)記試 劑。
[圖1]圖1表示本發(fā)明的熒光off/on型感應(yīng)體系,其以甲基疊氮基的還原為啟 動(dòng),引起無(wú)熒光性分子的結(jié)構(gòu)變化而發(fā)出熒光。[圖2]圖2表示熒光素衍生物的有機(jī)合成流程圖。[圖3]圖3表示本發(fā)明的熒光素衍生物的熒光測(cè)定結(jié)果。[圖4]圖4表示本發(fā)明的基因檢測(cè)的概要。[圖5]圖5是表示熒光信號(hào)的化學(xué)放大。[圖6]圖6是表示DNA模板上的反應(yīng)和熒光測(cè)定的結(jié)果。[圖7]圖7是表示本發(fā)明的熒光分子的信號(hào)放大。[圖8]圖8是表示HL60細(xì)胞內(nèi)28SrRNA的檢測(cè)。使用(A-D)完全匹配的探針(A 和B)和雜亂序列的探針(C和D)時(shí)的熒光圖像和明視野圖像的合并。A和C表示熒光圖 像,B和D表示與明視野圖像的合并。(E)流式細(xì)胞儀的直方圖。橫軸表示熒光強(qiáng)度,縱軸 表示細(xì)胞數(shù)。[圖9]圖9表示HL60細(xì)胞內(nèi)β-肌動(dòng)蛋白mRNA的檢測(cè)。使用(A-D)完全匹配 的探針(A和B)和雜亂序列的探針(C和D)時(shí)的熒光圖像和明視野圖像的合并。A和C表 示熒光圖像,B和D表示與明視野圖像的合并。(E)流式細(xì)胞儀的柱狀圖。橫軸表示熒光強(qiáng) 度,縱軸表示細(xì)胞數(shù)。
權(quán)利要求
下式(1)或者(2)表示的化合物,[化1](式中,X表示氫原子、或者羧酸的保護(hù)基團(tuán),R表示氫原子、鹵原子、或者用于與核酸結(jié)合的反應(yīng)基團(tuán),Y1、Y2、Y3和Y4分別獨(dú)立地表示氫原子、碳原子數(shù)為1~6的烷基、碳原子數(shù)為1~6的烷氧基、碳原子數(shù)為6~10的芳基、或者氰基)。FPA00001137470600011.tif
2.標(biāo)記試劑,其含有權(quán)利要求1所述的化合物,并用于檢測(cè)生物體關(guān)聯(lián)物質(zhì)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑,其用于核酸的標(biāo)記。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的試劑,其與還原劑組合使用。
5.目標(biāo)核酸序列的檢測(cè)方法,其含有下述工序使具有與目標(biāo)核酸序列的一部分區(qū)域 相互補(bǔ)的核酸序列的第一核酸探針、和具有與目標(biāo)核酸序列的另一部分區(qū)域相互補(bǔ)的核酸 序列的第二核酸探針與目標(biāo)核酸序列進(jìn)行雜交的工序,和檢測(cè)通過(guò)將第一核酸探針中無(wú)熒 光性分子的-O-C(Yl) (Y2)-N3表示的基團(tuán)還原為羥基或者氧代基而生成的熒光的工序,上 述第一核酸探針用無(wú)熒光性分子標(biāo)記,所述無(wú)熒光性分子具有選自熒光素骨架、咕噸骨架、 試鹵靈骨架、香豆素骨架、吲哚骨架、或者喹唑啉酮骨架中的骨架,且分子內(nèi)具有-O-C(Yl) (Y2)-N3表示的基團(tuán)(式中,Yl和Y2表示氫原子、碳原子數(shù)為1 6的烷基、碳原子數(shù)為 1 6的烷氧基、碳原子數(shù)為6 10的芳基、或者氰基),上述第二核酸探針用具有還原作 用的分子進(jìn)行了標(biāo)記。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法,其中,上述無(wú)熒光性分子使用具有熒光素骨架,且分子 內(nèi)具有-O-C(Yl) (Y2)-N3(式中,Yl和Y2表示氫原子、碳原子數(shù)為1 6的烷基、碳原子數(shù) 為1 6的烷氧基、碳原子數(shù)為6 10的芳基、或者氰基)表示的基團(tuán)的無(wú)熒光性分子。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的方法,其中,上述無(wú)熒光性分子使用權(quán)利要求1所述的化 合物。
8.根據(jù)權(quán)利要求5 7中任一項(xiàng)所述的方法,其中,目標(biāo)核酸序列為RNA。
9.根據(jù)權(quán)利要求5 7中任一項(xiàng)所述的方法,其中,檢測(cè)目標(biāo)核酸序列的單核苷酸多態(tài)性。
10.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法,其特征在于,檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的目標(biāo)核酸序列。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法,其特征在于,用流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光,挑選發(fā)出熒光 的細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明的目的在于提供基因解析用的熒光on/off型熒光化合物(熒光發(fā)生分子體系),其穩(wěn)定性高(即長(zhǎng)時(shí)間具有活性)、且靈敏度高,能夠放大微量的基因信號(hào)并進(jìn)行觀察。根據(jù)本發(fā)明,可以提供無(wú)熒光性分子,其具有熒光素骨架等的熒光物質(zhì)骨架,且分子內(nèi)具有-O-C(Y1)(Y2)-N3表示的基團(tuán)(式中,Y1和Y2表示氫原子、碳原子數(shù)為1~6的烷基、碳原子數(shù)為1~6的烷氧基、碳原子數(shù)為6~10的芳基、或者氰基)。
文檔編號(hào)C12N15/09GK101896491SQ200880115960
公開(kāi)日2010年11月24日 申請(qǐng)日期2008年8月1日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月14日
發(fā)明者伊藤嘉浩, 古川和寬, 阿部洋 申請(qǐng)人:獨(dú)立行政法人理化學(xué)研究所