專利名稱：血細(xì)胞sars冠狀病毒熒光分子信標(biāo)pcr檢測(cè)技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
生物醫(yī)藥體外分子診斷技術(shù)二、技術(shù)背景傳染性非典性肺炎是最近半年來(lái)在我國(guó)部分省市及世界多個(gè)國(guó)家和地區(qū)蔓延的一種新的傳染病。世界衛(wèi)生組織(WHO)將其命名為嚴(yán)重急性呼吸道綜合征(SARS)，SARS的病原是一種新的冠狀病毒(Corona virus，CoV)。因而稱為SARS-CoV?；蚍肿釉\斷和免疫學(xué)檢查是SARS快速診斷的兩個(gè)主要檢測(cè)方法。由于SARS-CoV抗體一般在發(fā)病后十天左右才能在血清中檢出，而且檢出率不是很高。因此，基因分子診斷是SARS快速診斷的主要方法。目前，SARS-CoV的檢測(cè)多以呼吸道分泌物、血清、尿液和糞便等排泄物作為樣本。這些樣本由于病毒滴度不均一，病毒基因組RNA易降解等問(wèn)題，檢出率有限，而且不穩(wěn)定。最新研究表明SARS-CoV可感染人體多種組織細(xì)胞，引起多器官損害。血液細(xì)胞一方面可以被病毒直接感染。另一方面，血液中的許多免疫細(xì)胞能吞噬病毒顆粒。因而SARS-CoV病毒會(huì)在血細(xì)胞中增殖和潛伏，病毒滴度較高。以血細(xì)胞為樣本分離并檢測(cè)病毒基因可提高SARS的檢出率和穩(wěn)定性。事實(shí)上，其他RNA病毒如丙型肝炎病毒(HCV)、巨細(xì)胞病毒等(CMV)，在血細(xì)胞的檢出率較血清中要高。而我們現(xiàn)有的部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)，以血細(xì)胞為標(biāo)本進(jìn)行SARS-CoV的基因檢測(cè)，檢出率也較其他樣本更高而且穩(wěn)定。

發(fā)明內(nèi)容
采用熒光分子信標(biāo)PCR方法檢測(cè)外周血細(xì)胞中的SARS-CoV核酸。在SARS-CoV的聚合酶基因設(shè)計(jì)一引物，在上下游引物中間再設(shè)計(jì)一條分子信標(biāo)探針。探針的5′端標(biāo)記熒光基團(tuán)，3′端標(biāo)記淬滅基團(tuán)。待檢者血清的抽提及運(yùn)輸按照國(guó)家疾病預(yù)防控制中心公布的操作指南進(jìn)行。外周血單核細(xì)胞(PBMC)的分離和病毒基因組RNA的抽提在生物安全柜中進(jìn)行。先用淋巴細(xì)胞分離液從外周血(加抗凝劑)中分離出單核細(xì)胞。然后用SiO2-異硫氰胍法(本室建立)抽提并富集RNA。以從PBMC中抽提的總RNA為模板，采用逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)分子信標(biāo)法擴(kuò)增并檢測(cè)SARS-CoV聚合酶基因。采用動(dòng)態(tài)實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)法或反應(yīng)終點(diǎn)熒光檢測(cè)法對(duì)擴(kuò)增的SARS-CoV核酸進(jìn)行定性、定量檢測(cè)。
四、實(shí)施方案本技術(shù)主要用于對(duì)SARS-CoV可疑患者進(jìn)行快速診斷并適應(yīng)于SARS患者治療的療效觀察。抽提待檢者外周血液3～5ml加等量淋巴細(xì)胞分離液分離出PBMC，用SiO2-異硫氰胍法抽提總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA后，PCR擴(kuò)增靶基因片段。PCR擴(kuò)增及熒光檢測(cè)可在定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增和動(dòng)態(tài)實(shí)時(shí)檢測(cè)；也可以用普通PCR儀先擴(kuò)增目的基因片段，然后用熒光檢測(cè)儀對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行終點(diǎn)檢測(cè)。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)與其他熒光分子信標(biāo)PCR技術(shù)相同。
權(quán)利要求
1.擴(kuò)增血細(xì)胞樣本中的靶基因片段來(lái)檢測(cè)SARS-CoV感染。
2.采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、分子信標(biāo)和核酸雜交等分子診斷方法檢測(cè)血細(xì)胞中的SARS-CoV。
3.前面所述的血細(xì)胞樣本包括血液中的所有細(xì)胞。
全文摘要
熒光分子信標(biāo)PCR檢測(cè)方法是最常用的SARS－CoV分子診斷方法。此方法一般以呼吸道分泌物、血清、尿液及糞便等排泄物樣本來(lái)檢測(cè)SARS－CoV靶基因。這些樣本病毒滴度差異較大、病毒基因組RNA不穩(wěn)定，檢出率較低、穩(wěn)定性差。本技術(shù)以外周血細(xì)胞為樣本，分離外周血單核細(xì)胞(PBMC)，抽提總RNA。以外周血細(xì)胞RNA為模板，用熒光分子信標(biāo)RT－PCR擴(kuò)增目的基因片段來(lái)檢測(cè)SARS－CoV，提高了SARS－CoV的檢出率和穩(wěn)定性。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1453368SQ0314553
公開(kāi)日2003年11月5日 申請(qǐng)日期2003年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月30日
發(fā)明者王虹 申請(qǐng)人:王虹