一種利用BiFC指示細胞中Wnt信號活性狀態(tài)的載體組合物及應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種利用BiFC指示細胞中Wnt信號活性狀態(tài)的系統(tǒng)及應用。本發(fā)明提供了一種融合蛋白組，由融合蛋白A和融合蛋白B組成，所述融合蛋白A包括核心效應因子β-catenin片段和位于其C段的熒光蛋白片段A；所述融合蛋白B包括轉錄因子TCF和位于其N段的熒光蛋白片段B。本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明利用依據(jù)雙分子熒光互補技術(BiFC)的策略將Wnt信號通路中核心效應因子β-catenin與轉錄因子TCF形成的復合體可視化，從而直接顯示W(wǎng)nt在細胞中的活性狀態(tài)，本發(fā)明將BiFC系統(tǒng)瞬時轉染細胞或構建成穩(wěn)定表達細胞系，可觀察到細胞核中形成的特異信號，該信號可以特異顯示并反映活細胞中Wnt信號通路活性狀態(tài)及其變化。
【專利說明】—種利用B i FC指示細胞中Wnt信號活性狀態(tài)的載體組合物及應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術領域】，尤其涉及一種利用BiFC指示細胞中Wnt信號活性狀態(tài)的載體組合物及應用。
【背景技術】
[0002]經(jīng)典的Wnt信號通路是一條保守而重要的信號轉導通路，與胚胎發(fā)育、成體組織穩(wěn)態(tài)、癌癥發(fā)生都有著密切聯(lián)系。在多種癌癥中，例如結直腸癌、乳腺癌、肺癌、皮膚癌等等，都已經(jīng)檢測到因為通路成員突變等多種原因造成的fct信號的異常激活。因此，對Wnt信號通路的研究以及以fct信號為靶點的藥物篩選都具有非常重要的意義。
[0003]關于經(jīng)典Wnt信號的工作模式，目前人們認為，當fct信號被激活時，降解復合體的功能被抑制，使得β-catenin得以在細胞質中積累，進而入核與轉錄因子TCF結合一同激活下游靶基因的轉錄。近年來，已經(jīng)有許多基因被鑒定為fct信號通路靶基因，這些基因在細胞增殖、細胞存活、細胞代謝等多個領域都發(fā)揮著重要作用。因此，β-catenin與TCF家族成員(TCF1、LEFU TCF3、TCF4)發(fā)生相互作用形成復合體被認為是Wnt信號過程中的關鍵步驟，成為fct信號轉錄調控的重要開關。該關鍵步驟也被認為是藥物篩選的重要靶點之一 O
[0004]為了顯示W(wǎng)nt 信號在細胞內的活性狀態(tài)，人們發(fā)明了多種方法。T0PFLASH報告系統(tǒng)便是一種廣泛應用的方法，該系統(tǒng)可通過報告基因熒光素酶的表達顯示fct靶基因的轉錄輸出狀態(tài)。
[0005]在雙分子熒光互補技術(BiFC)系統(tǒng)中，熒光蛋白被截成N段、C段兩部分，分別與兩個目標蛋白構建為融合蛋白。單獨的熒光蛋白片段本身不能發(fā)出熒光，并且在細胞空間范圍內隨機接近的幾率很小。只有當兩個目標蛋白之間發(fā)生相互作用時，才可以拉近熒光蛋白片段，有利于它們重組成完整的熒光蛋白進而發(fā)出熒光，如圖1所示。BiFC可用于觀測活細胞內蛋白分子間的相互作用，也可以通過其熒光定位顯示互作發(fā)生的位置。BiFC在多種物種的細胞組織中均能使用，例如在哺乳動物細胞、植物組織、線蟲等多種系統(tǒng)中都具有可行性。BiFC信號可在普通顯微鏡下進行檢測，不需要特殊分析手段。BiFC系統(tǒng)可以在較低的蛋白水平下檢測到熒光，并且只需要兩個熒光蛋白片段之間具有一定的結構上的柔性?？傮w來說，BiFC為顯示活細胞內蛋白之間的相互作用提供了直接、便捷、高精度的技術手段。
[0006]目前，還沒有報道利用BiFC技術顯示β-catenin水平及下游水平的蛋白互作情況。

【發(fā)明內容】

[0007]本發(fā)明的一個目的地是提供一種用于檢測細胞內Wnt信號活性狀態(tài)的融合蛋白組。[0008]本發(fā)明提供的融合蛋白組，由融合蛋白A和融合蛋白B組成:
[0009]所述融合蛋白A包括β -catenin的C端缺失片段和位于其C段的熒光蛋白片段A；
[0010]所述融合蛋白B包括轉錄因子TCF和位于其N段的熒光蛋白片段B ；
[0011 ] 所述β -catenin的C端缺失片段為β -catenin蛋白氨基酸序列N末端起第2-667
個氨基酸殘基。
[0012]上述的融合蛋白組中，
[0013]所述融合蛋白A從N端起依次由所述β -catenin的C端缺失片段、連接肽和熒光蛋白片段A組成；
[0014]所述融合蛋白B從N端起依次由所述轉錄因子TCF、連接肽和熒光蛋白片段B組成；
[0015]所述熒 光蛋白片段A和所述熒光蛋白片段B來源于同一個熒光蛋白或不同熒光蛋白。
[0016]上述的融合蛋白組中，
[0017]所述TCF 為 TCF1、TCF2、TCF3、TCF4 或其轉錄變體。
[0018]所述連接肽的氨基酸序列為序列表中序列2 ；
[0019]所述熒光蛋白為EYFP和/或Venus熒光蛋白；
[0020]所述熒光蛋白片段A為Venus蛋白氨基酸殘基自N末端第155-238位氨基酸或EYFP蛋白氨基酸殘基自N末端第159-238位氨基酸；
[0021 ] 所述熒光蛋白片段B為Venus蛋白氨基酸殘基自N末端第1_173位氨基酸或EYFP蛋白氨基酸殘基自N末端第1-158位氨基酸。
[0022]上述的融合蛋白組中，
[0023]所述融合蛋白A從N端起依次由所述β -catenin的C端缺失片段、連接肽和熒光蛋白片段A組成；所述熒光蛋白片段A為Venus蛋白氨基酸殘基自N末端第155-238位氨
基酸；
[0024]所述融合蛋白B從N端起依次由所述轉錄因子TCF3、連接肽和熒光蛋白片段B組成；所述熒光蛋白片段B為EYFP蛋白氨基酸殘基自N末端第1-158位氨基酸；
[0025]所述融合蛋白A的氨基酸序列具體為序列表中的序列8 ；
[0026]所述融合蛋白B的氨基酸序列具體為序列表中的序列14。
[0027]本發(fā)明的另一個目的是提供DNA分子組。
[0028]本發(fā)明提供的DNA分子組，其由編碼融合蛋白A的DNA分子A和編碼融合蛋白B的DNA分子B組成,所述DNA分子A的核苷酸序列為序列表中序列7 ;所述DNA分子B的核苷酸序列為序列表中序列13。
[0029]本發(fā)明第三個目的是提供重組載體組。
[0030]本發(fā)明提供的重組載體組，由表達融合蛋白A的重組載體和表達融合蛋白B的重組載體組成；
[0031]所述表達融合蛋白A的重組載體為將所述編碼融合蛋白A的DNA分子插入表達載體得到的載體；
[0032]所述表達融合蛋白B的重組載體為將所述編碼融合蛋白B的DNA分子插入表達載體得到的載體。
[0033]上述表達載體具體為pcDNA3.1-FLAG, pcDNA3.1-Myc 或 pBI。
[0034]本發(fā)明第四個目的是提供一種轉基因細胞系。
[0035]本發(fā)明提供的轉基因細胞系，為將所述表達融合蛋白A的重組載體和所述表達融合蛋白B的重組載體共同導入宿主細胞中得到的細胞系。
[0036]上述融合蛋白組、上述的DNA分子組、上述的重組載體組或權利要求7所述的轉基因細胞系在利用BiFC檢測影響細胞Wnt信號的物質中的應用也是本發(fā)明保護的范圍；
[0037]或上述融合蛋白組、上述的DNA分子組、上述的重組載體組或上述的轉基因細胞系在利用BiFC檢測細胞中Wnt活性狀態(tài)中的應用也是本發(fā)明保護的范圍。
[0038]本發(fā)明第五個目的是提供一種利用BiFC檢測或鑒定影響細胞內Wnt信號的物質的方法。
[0039]本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟:
[0040]將小分子物質作用上述的轉基因細胞系，檢測處理后的轉基因細胞系，
[0041]若處理轉基因細胞系的BiFC熒光信號比處理前轉基因細胞系強，則所述小分子物質為激活細胞內fct信號的物質； [0042]若處理轉基因細胞系的BiFC熒光信號比處理前轉基因細胞系弱，則所述小分子物質為抑制細胞內fct信號的物質；
[0043]所述小分子物質具體為導致TCF缺失的干擾RNA、GSK3 β、E_cadherin、LiCl、BIO、NC043 或 SRSFl 蛋白。
[0044]上述作用的方式如下:
[0045]若是蛋白或核酸，則作用為將含有蛋白編碼基因或含有核酸的重組載體轉染到所述轉基因細胞中；
[0046]若小分子物質為化合物，則作用為將所述化合物加入轉基因細胞培養(yǎng)基中。
[0047]本發(fā)明第六個目的是提供一種用于檢測細胞內fct信號活性狀態(tài)的方法。
[0048]本發(fā)明提供的方法，將所述表達融合蛋白A的重組載體和所述表達融合蛋白B的重組載體共同導入宿主細胞，得到轉基因細胞，觀察轉基因細胞，若有熒光產(chǎn)生，表明激活細胞中的fct信號，若無熒光產(chǎn)生，表明未激活細胞中的Wnt信號，實現(xiàn)可視化觀察細胞中的fct信號活性狀態(tài)或變化。
[0049]本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明利用雙分子熒光互補技術(BiFC)的策略將Wnt信號通路中核心效應因子β -catenin與轉錄因子TCF形成的復合體可視化,從而直接顯示W(wǎng)nt在細胞中的活性狀態(tài)，本發(fā)明將BiFC系統(tǒng)瞬時轉染細胞，可觀察到細胞核中形成的特異信號，該信號可以特異顯示并反映活細胞中fct信號通路活性狀態(tài)及其變化。因此，該方法相比T0PFLASH系統(tǒng)更為直觀、方便，且可提供細胞定位上的具體信息；直觀顯示活細胞中fct信號轉導的關鍵蛋白β-catenin與轉錄因子TCF的相互作用，包括時間與空間定位，同時也建立了一個可用于篩選影響二者互作關系的小分子或基因的研究體系。另外，本發(fā)明提供的BiFC構建策略包括EYFP以及Venus熒光蛋白片段的采用，與β-catenin(C端)和TCF (N端)的融合位置，以及l(fā)inker序列的使用，幫助特異、有效的BiFC熒光形成，并對于TCF家族不同成員以及其他物種中同源蛋白均可適用。
[0050]總之，在本發(fā)明中，擬用BiFC系統(tǒng)來特異顯示W(wǎng)nt中關鍵步驟β -catenin與TCF之間的相互作用來表征細胞的激活情況。相較于之前常用于顯示fct信號激活靶基因轉錄輸出的TOP-Flash報告系統(tǒng)，BiFC系統(tǒng)可以在TOP-Flash報告系統(tǒng)的上游顯示W(wǎng)nt信號的激活情況，提供了全新的顯示維度。并且由于BiFC系統(tǒng)還可以提供定位信息，從而具備為研究提供更多信息的可能性。依據(jù)BiFC系統(tǒng)所構建的細胞系可以被應用于針對大規(guī)模篩選或鑒定fct信號調控因子或小分子的實驗中。
[0051]以下的實施例便于更好的理解本發(fā)明，其中用到的相關表達載體、細胞系并不限定于本發(fā)明。由于β-catenin和TCF在不同物種之間較為保守,4個TCF家族成員之間介導與β -catenin相互作用的結構域也較為保守，因此BiFC構建策略可以顯示不同物種來源的，例如人類、小鼠、斑馬魚、爪蟾，TCFs與β-catenin之間的相互作用。
[0052]下述實施例中以β -catenin和TCF3組合為例。
[0053]實施例中的實驗方法，均為常規(guī)分子細胞生物學實驗方法。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0054]圖1為BiFC系統(tǒng)工作基本原理示意圖
[0055]圖2為β -catenin-TCF BiFC系統(tǒng)克隆構建示意圖
[0056]圖3為β -catenin-TCF BiFC系統(tǒng)空間結構示意圖
[0057]圖4為β -catenin-TC F BiFC系統(tǒng)克隆的表達及活性檢測
[0058]圖5為利用TCF突變體檢測β -catenin-TCF BiFC系統(tǒng)的特異性
[0059]圖6為利用TCF突變體對β -catenin-TCF BiFC不同組合進行比較
[0060]圖7為Wnt信號負調控因子過表達抑制β -catenin-TCF BiFC信號[0061 ]圖8為β -catenin-TCF BiFC系統(tǒng)穩(wěn)定表達細胞系構建策略
[0062]圖9為β -catenin-TCF BiFC穩(wěn)定表達細胞系的蛋白表達檢測
[0063]圖10為小分子藥物處理可導致β -catenin-TCF BiFC熒光信號變化
[0064]圖11為病毒感染處理可導致β -catenin-TCF BiFC熒光信號變化
【具體實施方式】
[0065]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0066]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0067]實施例1、融合蛋白組合物及由其構建的BiFC系統(tǒng)
[0068]基于β -catenin與TCF3-CBD的晶體結構，可以知道β -catenin的C端(第667氨基酸，不含C端未知結構)與TCF3的N端在空間上較為接近。熒光蛋白的兩個片段被設計分別融合于TCF3N端以及β -catenin的C端。由于β -catenin的C端結構未知,且不參與TCF之間的相互作用，同時β -catenin Δ C( β -catenin氨基酸自N末端第2-667位氨基酸殘基，β-catenin Λ C片段以下簡稱β-cat)的使用也可以在一定程度上避免細胞內Wnt信號過高而誘導凋亡，起到保護細胞的作用，因此采用β -catenin Λ C和TCF3作為目的蛋白構建BiFC系統(tǒng)。
[0069]β -catenin 的 genbank 號及提交時間為 ΝΡ_001091679，2014.4.27 ；
[0070]轉錄因子TCF3 的 genbank 號及提交時間為 NP_001080938, 2014.5.14。
[0071]按照BiFC系統(tǒng)構建經(jīng)驗，一段具有柔性結構特點的GSGSGS序列作為連接肽用來連接目標蛋白和熒光蛋白片段，其核苷酸序列為序列1，其氨基酸序列為序列表中序列2，通過增加結構的靈活性提高融合蛋白形成的幾率。
[0072]β -cat-TCF BiFC系統(tǒng)的空間結構如圖2所示。
[0073]1.融合蛋白組合物的獲得
[0074]1.1融合蛋白組合的設計
[0075]根據(jù)文獻，選取EYFP和Venus作為熒光蛋白，EYFP的氨基酸序列為序列表中序列3，其編碼基因的核苷酸序列為序列表中序列4，Venus的氨基酸序列為序列表中序列6，其編碼基因的核苷酸序列為序列表中序列5。
[0076]將上述兩種熒光蛋白按照如下劃分:熒光蛋白片段YN(YFP蛋白的N端起第1_158個氨基酸殘基)、YC (YFP C端起第159-240個氨基酸殘基)、VN (Venus蛋白的N端起第1-173個氨基酸殘基)、VC(Venus蛋白的C端起第155-239個氨基酸殘基)被用于克隆構建，得到4種類型的融合蛋白組合物:
[0077]組合一、β -cat-VC+VN-TCF:由融合蛋白β _cat_VC和融合蛋白VN-TCF組成；
[0078]融合蛋白β -cat-VC編碼基因的核苷酸序列為序列表中序列7，其中序列7自5’末端第1-1998位核苷酸為β -catenin Δ C編碼區(qū)，第2005-2022位核苷酸為連接肽編碼區(qū)，第2023-2280位核苷酸為VC編碼區(qū)；融合蛋白β -cat-VC的氨基酸序列為序列表中序列8,其中序列8自N末端第1-666位氨基酸殘基為β -catenin Δ C,第669—674位氨基酸殘基為連接肽，第675-759位 氨基酸殘基為VC ；
[0079]融合蛋白VN-TCF編碼基因的核苷酸序列為序列表中序列11，其中序列11自5’末端第1-519位核苷酸為VN編碼區(qū)，第520-537位核苷酸為連接肽編碼區(qū)，第544-2181位核苷酸為TCF3蛋白編碼區(qū)；融合蛋白VN-TCF的氨基酸序列為序列表中序列12，其中序列12自N末端第1-173位氨基酸殘基為VN，第174-179位氨基酸殘基為連接肽，第182-726位氨基酸殘基為TCF3蛋白；
[0080]上述組合中，VC和VN可以互換，β -cat-VN+VC-TCF與β -cat-VC+VN-TCF結果無
顯著差異。
[0081]組合二、β -cat-YC+VN-TCF:由融合蛋白β _cat_YC和融合蛋白VN-TCF組成；
[0082]融合蛋白β -cat-YC編碼基因的核苷酸序列為序列表中編號9，其中序列9自5’末端第1-1998位核苷酸為β -catenin Δ C編碼區(qū)，第2005-2022位核苷酸為連接肽編碼區(qū)，第2023-2265位核苷酸為YC編碼區(qū)；融合蛋白β -cat-YC的氨基酸序列為序列表編號
10,其中自N末端第1-666位氨基酸殘基為β -catenin Δ C,第669-674位氨基酸殘基為連接肽，第675-754位氨基酸殘基為YC ；
[0083]融合蛋白VN-TCF的核苷酸序列和氨基酸序列分別為序列11和序列12。
[0084]組合三、β -cat-VC+YN-TCF:由融合蛋白β -cat-VC和融合蛋白YN-TCF組成；
[0085]融合蛋白β -cat-VC的氨基酸序列和核苷酸序列請見序列7和序列8。
[0086]融合蛋白YC-TCF編碼基因的核苷酸序列為序列表中序列13，其中序列13自5’末端第1-480位核苷酸為YN編碼區(qū)，第480-492位核苷酸為連接肽編碼區(qū)，第499-2130位核苷酸為TCF3蛋白編碼區(qū)；融合蛋白YN-TCF的氨基酸序列為序列表中序列14，其中序列14自N末端第1-157位氨基酸殘基為YN，第161-164位氨基酸殘基為連接肽。第167-713位氨基酸殘基為TCF3蛋白；[0087]組合四、β -cat-YC+YN-TCF:由融合蛋白β _cat_YN和融合蛋白YC-TCF組成；
[0088]融合蛋白β -cat-YC的氨基酸序列和核苷酸序列請見序列9和序列10。
[0089]融合蛋白YN-TCF的氨基酸序列和核苷酸序列請見序列13和序列14。
[0090]上述組合中，YC和YN可以互換，β -cat-YN+YC-TCF與β -cat-YC+YN-TCF結果無
顯著差異。
[0091]1.2表達融合蛋白的重組載體組的獲得
[0092]上述融合蛋白編碼基因均通過PCR擴增，并利用酶切位點分別構建于pcDNA3.1-FLAG和pcDNA3.1-Myc載體(兩個載體均記載在如下文獻中:c-Cbl_MediatedNeddylation Antagonizes Ubiquitination and Degradation of the TGF-β Type IIReceptor molecular cell Volume49, Issue3, 7February2013, Pages499 - 510,公眾可從清華大學獲得)中，得到表達各融合蛋白的重組載體組合物，可原核表達出目的蛋白。
[0093]重組載體組合物具體如下:
[0094]組合一:重組載體pcDNA3.1-FLAG- β -cat-VC 和重組載體 pcDNA3.1-Myc-VN-TCF ；
[0095]重組載體pcDNA3.1-FLAG- β -cat-VC為將序列表中序列7所示的融合蛋白β -cat-VC編碼基因插入pcDNA3.1-FLAG載體的BamH I和Kpn I酶切位點間得到表達β -cat-VC的載體；
[0096]重組載體pcDNA3.1-Myc-VN-TCF為將序列表中序列11所示的融合蛋白VN-TCF編碼基因插入pcDNA3.1-Myc載體的Kpn I和Xba I酶切位點間得到表達VC-TCF的載體；
[0097]組合二:重組載體 pcDNA3.1-FLAG- β -cat-YC 和重組載體 pcDNA3.1-Myc-VN-TCF
[0098]重組載體pcDNA3.1-FLAG- β -cat-YC為將序列表中序列9所示的融合蛋白β -cat-YC編碼基因插入pcDNA3.1-FLAG載體的BamH I和Kpn I酶切位點間得到表達β -cat-YC的載體；
[0099]組合三:重組載體pcDNA3.1-FLAG- β -cat-VC 和重組載體 pcDNA3.1-Myc-YN-TCF
[0100]重組載體pcDNA3.1-Myc-YN-TCF為將序列表中序列13所示的融合蛋白YN-TCF編碼基因插入pcDNA3.1-Myc載體的Kpn I和Xba I酶切位點間得到的表達YN-TCF的載體；
[0101]組合四:重組載體pcDNA3.1-FLAG- β -cat-YC 和重組載體 pcDNA3.1-Myc-YN-TCF
[0102]重組載體pcDNA3.1-FLAG- β -cat-YC為將序列表中序列9所示的融合蛋白β -cat-YC編碼基因插入pcDNA3.1-FLAG載體的BamH I和Kpn I酶切位點間得到表達β -cat-YC的載體；
[0103]β -cat-YC/VC+YN/VN-TCF的方式顯示以上幾種組合，BiFC系統(tǒng)克隆的載體結構如圖3所示。
[0104]1.3鑒定BiFC融合蛋白的表達
[0105]I)鑒定各融合蛋白的表達及屬性
[0106]在構建完融合蛋白克隆質粒后，需要對克隆表達以及可能的Wnt激活能力進行初步檢測。
[0107]將上述獲得的4組重組載體(每組設兩個濃度梯度)中的每個重組載體分別與Super TOP-Flash (Super TOP-FI ash: Addgene, Plasmidl2456)、RL-TK-Reni I la (pRL-TK-Renil la: GenBank:AF025846.2)質粒共轉染HEK293T細胞，再利用威格拉斯雙熒光報告檢測試劑盒計算相對熒光強度。該相對熒光強度可以顯示對細胞內fct信號的激活作用。同時進行SDS-PAGE、免疫印跡檢測共轉染質粒后蛋白的表達情況。其中，陽性對照載體為將β -cat蛋白全長編碼區(qū)序列15插入pcDNA3.1-FLAG載體的BamH I和Xba I酶切位點間得到的載體。
[0108]相對熒光 強度部分結果如圖4B所示:
[0109]VN-TCF 為重組載體 pcDNA3.l-FLAG-VN-TCF 與 Super TOP-Flash,pRL-TK-Renilia質粒共轉染HEK293T細胞，表達約80KD大小的與其目的蛋白；
[0110]YN-TCF 為重組載體 pcDNA3.l-FLAG-YN-TCF 與 Super TOP-Fl ash, pRL-TK-Ren ilia質粒共轉染HEK293T細胞，表達約80KD大小的與其目的蛋白；
[0111]β-cat-YC 為重組載體 pcDNA3.1-FLAG-β-cat-YC 與 Super TOP-Flash、pRL-TK-Renilla質粒共轉染HEK293T細胞，表達82.5KD大小的與其目的蛋白；
[0112]β-cat-VC 為重組載體 pcDNA3.1-FLAG-β-cat-VC 與 Super TOP-Flash、pRL-TK-Renilla質粒共轉染HEK293T細胞，表達約83KD大小的與其目的蛋白；
[0113]β -cat-WT 為對照載體與 Super TOP-Fl ash, pRL-TK-Ren ilia 質粒共轉染 HEK293T細胞，表達約90KD大小的與其目的蛋白。
[0114]可以看出，融合蛋白可以表達且其蛋白大小符合預期。由相對熒光強度顯示的Wnt信號激活情況表明，TCF融合蛋白不具有Wnt信號的激活能力，相比于全長的β-catenin，β -cat Δ C融合蛋白具有較弱的激活能力。
[0115]2)鑒定轉基因細胞系共表達融合蛋白組合物
[0116]將每個重組載體組合中的重組載體分別按照質量比為1:1瞬時轉染ΗΕΚ293Τ細胞(ATCC, #CRL-3216):
[0117]HEK293T/ β -cat-VC+VN-TCF:轉染重組載體 pcDNA3.1-FLAG- β -cat-VC 和重組載體 pcDNA3.1-Myc-VN-TCF ；
[0118]HEK293T/β-cat-YC+VN-TCF:轉染重組載體 pcDNA3.1-FLAG-β -cat-YC 和pcDNA3.1-Myc-VN-TCF ；
[0119]HEK293T/ β -cat-VC+YN-TCF:轉染重組載體 pcDNA3.1-FLAG- β -cat-VC 和重組載體 pcDNA3.1-Myc-YN-TCF ；
[0120]HEK293T/ β -cat-YC+YN-TCF:轉染重組載體 pcDNA3.1-FLAG- β -cat-YC 和重組載體pcDNA3.1-Myc-YN-TCF0
[0121]置于熒光顯微鏡下(425~475nm激發(fā)，485~535nm觀察)進行觀察，以及組合三β -cat-VC+VN-TCF為例，結果如圖4A所示，可以觀察到細胞核中的BiFC熒光信號。
[0122]其中，在37°C培養(yǎng)條件下，轉染載體組合一、二、四的細胞均可以形成BiFC熒光；將轉染載體組合三的HEK293T/ β -cat-YC+YN-TCF在30°C培養(yǎng)4小時，在熒光顯微鏡下也可以檢測到BiFC熒光。
[0123]從上述可以看出，四種載體組合轉染后細胞均可以檢測到定位于細胞核中的BiFC熒光信號，表明四種融合蛋白組合及其對應的四種載體組合物均可以用于BiFC系統(tǒng)的顯示，可用于可視化觀察fct在細胞中的活性狀態(tài)。
[0124]3) β -cat-TCF BiFC熒光特異性的鑒定
[0125]pcDNA3.1-FLAG-β-cat-VC 質粒分別與 pcDNA3.l-Myc-YN-TCF Λ NLS、pcDNA3.l-Myc-YN-TCF Δ N質粒被瞬時轉染入HeLa細胞，在熒光顯微鏡下進行觀察。[0126]重組載體pcDNA3.l-Myc-YN-TCF Δ NLS為將核苷酸序列為序列16的YN-TCF Δ NLS編碼基因插入pcDNA3.1-Myc載體的Kpn I和Xba I位點得到的載體。
[0127]重組載體pcDNA3.1-Myc-YN-TCF Δ N為將核苷酸序列為序列17的YN-TCF Δ N編碼基因插入pcDNA3.1-Myc載體的Kpn I和Xba I位點得到的載體。
[0128]結果如圖5所示，可以看出，缺失C端核定位信號的TCF(TCF3 ANLS)與β -catenin共表達時，可以觀察到BiFC熒光信號但信號定位于細胞質中，顯示TCF的細胞定位決定了 BiFC熒光信號的定位。當缺失N端β-catenin結合區(qū)的TCF (TCF3 Λ N)與β -catenin共表達時，則觀察到明顯減弱的BiFC熒光或幾乎觀察不到熒光信號。這些結果顯示BiFC熒光信號特異來自于β -catenin-TCF復合體，并且β -catenin-TCF-BiFC系統(tǒng)可以特異顯示該蛋白復合體的細胞定位。
[0129]4) β -cat-VC+YN-TCF 為 BiFC 觀察的最優(yōu)組合
[0130]重組載體pcDNA3.1-Myc-VN-TCF Δ N被構建用于幫助鑒定BiFC觀察的最優(yōu)組合，其為將核苷酸序列為序列18的VN-TCFΛN編碼基因插入pcDNA3.1-Myc載體的Kpn I和XbaI位點得到的載體。
[0131]在質粒瞬時轉染條件下，分別過表達了 4個組合的質粒及其對應含有TCF Λ N的對照組合，并對比BiFC熒光形成的差異來顯示系統(tǒng)特異性。質粒組合及圖中的指示方法如下:
[0132](I) β -cat-VC+VN-TCF,圖中表示為 β-VC+VN-T，其對照組合為β -VC+VN-TCF3ΔN(VN-TΔN)
[0133](2) β -cat-YC+VN-TCF,圖中表示為 β-YC+VN-T，其對照組合為β -YC+VN-TCF3ΔN(VN-TΔN)
[0134](3) β -cat-VC+YN-TCF,圖中表示為 β-VC+YN-T，其對照組合為β -VC+YN-TCF3ΔN(ΥΝ-Τ ΔN)
[0135](4) β -cat-YC+YN-TCF,圖中表示為 β-YC+YN-T，其對照組合為β -YC+YN-TCF3ΔN(ΥΝ-Τ ΔN)
[0136]結果如圖6Α顯不，組合一、二有少量本底水平的突光形成,表現(xiàn)在其相應的對照組合在瞬時轉染條件下仍能檢測到少量熒光，但明顯減弱，因而具有一定特異性；而組合四的本底水平在正常溫度條件(圖6Α)以及低溫誘導條件下均不能被檢測到(圖6Β)，故具有相對更高的特異性；組合三則兼具以上幾種組合的特點，熒光明亮，且既不需要低溫誘導又具有較高特異性。因此，最優(yōu)的融合蛋白組合為β-cat-VC+YN-TCF組合，用其進行后續(xù)實驗。
[0137]2、融合蛋白組合物β -cat-VC+YN-TCF在篩選影響Wnt信號通路的新基因中的應用
[0138]GSK3 β可以通過磷酸化,導致β-catenin降解,E-cadherin可以與TCF競爭結合β -catenin。
[0139] 重組載體pCS2+-GSK3 0將GSK30編碼基因(序列19)插入pCS2+(記載在如下文獻中:Rupp, R.A.W.，Snider，L，and Weintraubj H.(1994).Xenopus embryos regulate thenuclear localization of XMyoD.Genes and Developments: 1311-1323.，公眾可從清華大學獲得)表達載體的Xho I和Xba I位點間。[0140]重組載體pCS2+-E_cadherin將E-cadherin編碼基因(序列20)插入pCS2+表達載體的BamH I和EcoR I位點間。
[0141]將pCS2+、pCS2+-GSK3 β 和 pCS2+-E_cadherin 分別與 β -cat-VC+YN-TCF 組合共轉，并進行熒光顯微鏡檢測，結果如圖7左圖所示。
[0142]pCS2+ 為將 pCS2+ 轉染 HEK293T/ β -cat-VC+YN-TCF 得到的轉基因細胞；
[0143]GSK3 β 為將 pCS2+-GSK3 β 轉染 ΗΕΚ293Τ/ β -cat-VC+YN-TCF 得到的轉基因細胞；
[0144]E-cadherin 為將 pCS2+-E_cadherin 轉染 HEK293T/ β -cat-VC+YN-TCF 得到的轉基因細胞。
[0145]以將 pCS2+ (pCS2+)、pCS2+_GSK3 β (GSK3 β )和 pCS2+-E_cadherin (E-cadherin)分別轉染HEK293T細胞進行熒光顯微鏡檢測作為對照，以HEK293T/ β -cat-VC+YN-TCF為對照，結果如圖7右圖所示。
[0146]HEK293T/ β -cat-VC+YN-TCF 和 pCS2+-E_cadherin (E-cadherin)轉染 HEK293T 細胞結果無顯著差異?？梢钥闯?，作為對照，GSK3 β和E-cadherin的過表達并不影響轉染的GFP質粒產(chǎn)生的熒光信號；BiFC熒光系統(tǒng)可以反應β -catenin蛋白水平的變化；加入β -cat-VC+YN-TCF組合載體后，GSK3 β和E-cadherin產(chǎn)生的BiFC熒光信號低于不加。
[0147]經(jīng)過GSK3 0編碼基因或E-cadherin編碼基因處理后的轉基因細胞比不加入這些小分子物質 的轉基因細胞 HEK293T/ β -cat-VC+YN-TCF 或 pCS2+-E_cadherin (E-cadherin)轉染HEK293T細胞的BiFC熒光信號弱，表明GSK3 β編碼基因和E-cadherin編碼基因均為影響fct信號通路的基因，具體作用是抑制細胞內Wnt信號。
[0148]上述結果表明，載體組合物可以用來篩選、鑒定影響Wnt信號通路的基因，可以影響β -catenin和TCF定位、蛋白水平、或者影響兩個蛋白相互作用的新基因，都有可能通過本發(fā)明的載體組合物加入后BiFC熒光的變化顯示出來。
[0149]3.融合蛋白組合物β -cat-VC+YN-TCF在篩選影響Wnt信號通路的小分子中的應用
[0150]3.1共表達融合蛋白組合物β -cat-VC+YN-TCF轉基因細胞系的獲得
[0151]選擇在穩(wěn)定表達tTA的HeLa細胞(HeLa_tTA)中構建表達系統(tǒng)。同時，考慮到兩個相互結合的融合蛋白最好表達量相似，以獲得最好的互作效果，PBI表達載體被嘗試使用。pBI載體帶有一個響應四環(huán)素(doxycycline, dox)調控的啟動子,可以雙向驅動基因表達。β -cat-YC/VC和YN/VN-TCF被分別克隆在該啟動子的上下游，在四環(huán)素控制轉錄因子tTA或者rtTA存在下，可實現(xiàn)對兩者的誘導表達。pBI載體也被進行了適當改造。核糖體內部進入位點(internal ribosome entry site, IRES)被引入連接融合突光蛋白和抗性篩選基因Nec/，該序列可以保證在一條轉錄本上存在兩個開放閱讀框。由于靠近下游的開放閱讀框更易丟失，因而該策略一定程度上保證了上游融合蛋白表達細胞系的篩選成功幾率。除了抗性篩選這一指標，BiFC熒光的產(chǎn)生，也可以作為細胞系篩選過程中的第二個必要指標。
[0152]具體如下:
[0153]重組載體pB1-FLAG-β -cat-VC為將序列表中序列7所示的融合蛋白β -cat-VC編碼基因插入pBI載體(clontech，#631006)的NotI和Sal I酶切位點間得到表達β -cat-VC的載體；
[0154]重組載體pB1-Myc-YN-TCF為將序列表中序列13所示的融合蛋白YN-TCF編碼基因插入pBI載體的Nhe I和EcoR V酶切位點間得到表達YN-TCF的載體。
[0155]具體克隆構建策略如圖8所示。
[0156]將重組載體pB 1-FLAG-β-cat-VC 和 pB 1-My c-YN-TCF 共同瞬時轉染HeLa-tTA (clontech, #631156)細胞，兩天后在培養(yǎng)基中加入G418進行篩選，三周成功篩選到 β -cat/TCF BiFC 穩(wěn)轉細胞系 HeLa-BiFC#4_l 和 HeLa-BiFC#4_2。
[0157]將重組載體pB1-venus所示的venus核苷酸序列(序列5)插入pBI的NotI和Sal I酶切位點間得到的載體轉染HeLa-tTA細胞，兩天后在培養(yǎng)基中加入G418進行篩選，三周成功篩選到穩(wěn)轉細胞系HeLa-venus,作為對照細胞系。
[0158]將HeLa-BiFC#4-l、HeLa-BiFC#4_2 和 HeLa-venus 進行免疫印跡實驗，結果如圖9所示，可以看出，檢測到正確大小的外源蛋白的誘導表達，表明，HeLa-BiFC#4-1、HeLa-BiFC#4-2可以穩(wěn)定表達融合蛋白組合物β -cat-VC (約83KD)以及YN-TCF (約80KD)。
[0159]3.2融合蛋白組合物β -cat-VC+YN-TCF在篩選影響Wnt信號通路的小分子中的應用
[0160]以下示例中利用多種已知小分子處理β -cat/TCF BiFC穩(wěn)轉細胞系，測試其對Wnt信號通路活性狀態(tài)變化的響應。
[0161]用Wnt 信號的激活劑 LiCl (20mM)、BIO (I μ Μ)、Wnt 抑制劑 NC043 (7.5 μ Μ)和對照試劑DMSO處理細胞，具體如下:
[0162]將HeLa-BiFC 細胞系 HeLa-BiFC#4_l、HeLa-BiFC#4_2、HeLa-venus 分別在含有終濃度為20mM的LiCl、含有終濃度為I μ M BIO、含有終濃度為20mM LiCl和7.5 μ M NC043的MS培養(yǎng)基和含有同體積DMSO的MS培養(yǎng)基(作為不處理對照)中培養(yǎng)24小時。
[0163]熒光顯微鏡檢測，結果如圖10所示，左邊的3列顯示細胞系分別加入Wnt信號激活劑LiCl、BIO處理，BiFC信號的變化情況以及明場下的細胞狀態(tài)；LiCl、BIO的處理可導致β -cat-TCF-BiFC熒光增強、陽性細胞增多。
[0164]右邊的3列顯示細胞系分別加入Wnt信號激活劑LiCl以及在此基礎上同時加入Wnt抑制劑NC043處理后，BiFC信號的變化情況以及明場下的細胞狀態(tài)。Wnt抑制劑NC043的同時處理可以減弱β -cat-TCF-BiFC熒光信號。
[0165]經(jīng)過小分子LiCl、BIO處理后的轉基因細胞比不加入這些小分子物質的轉基因細胞的BiFC熒光信號增強，表明LiCl、BIO均為影響Wnt信號通路的物質，具體作用是激活細胞內Wnt信號。而將NC043加入經(jīng)過小分子LiCl處理后的轉基因細胞后，其熒光信號減弱，表明NC043為影響Wnt信號通路的基因，具體作用是抑制細胞內Wnt信號。
[0166]進一步表明，融合蛋白組合物β-cat-VC+YN-TCF可用于篩選影響Wnt信號通路小分子藥物如LiCl、BIO和NC043。
[0167]3.3融合蛋白組合物β -cat-VC+YN-TCF在篩選影響Wnt信號通路的病毒中的應用
[0168]目前，研究表明SRSFl (圖中簡稱為SR)蛋白可以促進β-catenin蛋白的翻譯。
[0169]SRSFl 蛋白(NP_001071634，PRI11-MAY-2014)過表達病毒的獲得是通過 SRSFl 蛋白編碼基因通過pLent1-BSD載體導入293FT細胞中(Life Technologies, #R700-07)，包裝得到SRSFl蛋白過表達病毒。
[0170]以空載體pLent1-BSD(0RIGENE，#PS100082)轉入細胞，得到對照病毒(controlvirus)ο[0171]將SR蛋白過表達病毒(SRvirus)和對照病毒(control virus)分別感染β-cat/TCF BiFC穩(wěn)轉細胞系細胞HeLa-BiFC#4-l，用相應抗生素處理一周，純化病毒感染后的細胞，最后觀察BiFC熒光信號。以不加任何病毒處理的HeLa-BiFC#4-l為對照。
[0172]結果如圖11所示，左圖為熒光圖，可以看出，SR蛋白過表達后可以明顯促進穩(wěn)轉細胞系中BiFC熒光的形成；
[0173]右圖為BiFC陽性細胞統(tǒng)計圖，可以看出，SR蛋白過表達后可以明顯促進穩(wěn)轉細胞系中BiFC熒光的形成，表現(xiàn)在BiFC陽性細胞比率增高；
[0174]不加任何病毒處理的β -cat/TCF BiFC穩(wěn)轉細胞系細胞HeLa-BiFC#4_l結果和對照病毒(control virus)分別感染β-cat/TCF BiFC穩(wěn)轉細胞系細胞HeLa-BiFC#4_l的結
果無顯著差異。
[0175]上述結果表明，經(jīng)過SRSFl蛋白過表達病毒處理的β-cat/TCF BiFC穩(wěn)轉細胞系細胞HeLa-BiFC#4-l的BiFC熒光信號比不經(jīng)病毒處理的β -cat/TCF BiFC穩(wěn)轉細胞系細胞HeLa-BiFC#4-l強，表明，SR蛋白及過表達該蛋白的病毒為影響Wnt信號通路的基因，具體作用是促進細胞內Wnt信號。上述結果表明，融合蛋白組合物β-cat-VC+YN-TCF可用于篩選影響Wnt信號通路 的病毒或蛋白。
【權利要求】
1.一種用于檢測細胞內Wnt信號活性狀態(tài)的融合蛋白組，由融合蛋白A和融合蛋白B組成: 所述融合蛋白A包括β-catenin的C端缺失片段和位于其C段的熒光蛋白片段A ; 所述融合蛋白B包括轉錄因子TCF和位于其N段的熒光蛋白片段B ； 所述β -catenin的C端缺失片段為β -catenin蛋白氨基酸序列N末端起第2-667個氨基酸殘基。
2.根據(jù)權利要求1所述的融合蛋白組，其特征在于: 所述融合蛋白A從N端起依次由所述β -catenin的C端缺失片段、連接肽和突光蛋白片段A組成； 所述融合蛋白B從N端起依次由所述轉錄因子TCF、連接肽和熒光蛋白片段B組成； 所述熒光蛋白片段A和所述熒光蛋白片段B來源于同一個熒光蛋白或不同熒光蛋白。
3.根據(jù)權利要求2所述的融合蛋白組，其特征在于:
所述TCF為TCF1、TCF2、TCF3、TCF4或其轉錄變體。 所述連接肽的氨基酸序列為序列表中序列2 ； 所述熒光蛋白為EYFP和/或Venus熒光蛋白； 所述熒光蛋白片段A為Venus蛋白氨基酸殘基自N末端第155-238位氨基酸或EYFP蛋白氨基酸殘基自N末端第159-238位氨基酸； 所述熒光蛋白片段B為Venus蛋白氨基酸殘基自N末端第1-173位氨基酸或EYFP蛋白氨基酸殘基自N末端第1-158位氨基酸。
4.根據(jù)權利要求3所述的融合蛋白組，其特征在于: 所述融合蛋白A從N端起依次由所述β -catenin的C端缺失片段、連接肽和突光蛋白片段A組成；所述熒光蛋白片段A為Venus蛋白氨基酸殘基自N末端第155-238位氨基酸；所述融合蛋白B從N端起依次由所述轉錄因子TCF3、連接肽和熒光蛋白片段B組成；所述熒光蛋白片段B為EYFP蛋白氨基酸殘基自N末端第1-158位氨基酸； 所述融合蛋白A的氨基酸序列具體為序列表中的序列8 ； 所述融合蛋白B的氨基酸序列具體為序列表中的序列14。
5.DNA分子組，其由編碼融合蛋白A的DNA分子A和編碼融合蛋白B的DNA分子B組成，所述DNA分子A的核苷酸序列為序列表中序列7 ;所述DNA分子B的核苷酸序列為序列表中序列13。
6.重組載體組，由表達融合蛋白A的重組載體和表達融合蛋白B的重組載體組成； 所述表達融合蛋白A的重組載體為將所述編碼融合蛋白A的DNA分子插入表達載體得到的載體。 所述表達融合蛋白B的重組載體為將所述編碼融合蛋白B的DNA分子插入表達載體得到的載體。
7.—種轉基因細胞系，為將所述表達融合蛋白A的重組載體和所述表達融合蛋白B的重組載體共同導入宿主細胞中得到的細胞系。
8.權利要求1-4中所述融合蛋白組、權利要求5所述的DNA分子組、權利要求6所述的重組載體組或權利要求7所述的轉基因細胞系在利用BiFC檢測影響細胞Wnt信號的物質中的應用；或權利要求1-4中所述融合蛋白組、權利要求5所述的DNA分子組、權利要求6所述的重組載體組或權利要求7所述的轉基因細胞系在利用BiFC檢測細胞中Wnt活性狀態(tài)中的應用。
9.一種利用BiFC檢測或鑒定影響細胞內Wnt信號的物質的方法，包括如下步驟: 將小分子物質作用權利要求7所述的轉基因細胞系，檢測處理后的轉基因細胞系， 若處理轉基因細胞系的BiFC熒光信號比處理前轉基因細胞系強，則所述小分子物質為激活細胞內fct信號的物質； 若處理轉基因細胞系的BiFC熒光信號比處理前轉基因細胞系弱，則所述小分子物質為抑制細胞內fct信號的物質； 所述小分子物質具體為導致TCF缺失的干擾RNA、GSK3 β , E-cadherin、LiCl、BIO、NC043 或 SRSFl 蛋白。
10.一種用于檢測細胞內Wnt信號活性狀態(tài)的方法，將所述表達融合蛋白A的重組載體和所述表達融合蛋白B的重組載體共同導入宿主細胞，得到轉基因細胞，觀察轉基因細胞，若有熒光產(chǎn)生，表明激活細胞中的fct信號，若無熒光產(chǎn)生，表明未激活細胞中的Wnt信號，實現(xiàn)可視化觀察細胞中的Wnt信號活性狀態(tài)或變化。
【文檔編號】C12N15/62GK104004098SQ201410234150
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2014年5月29日 優(yōu)先權日:2014年5月29日
【發(fā)明者】吳畏, 丁雅潔, 湯瑋欣 申請人:清華大學