CST1mRNA和CST4mRNA或其編碼的蛋白質(zhì)在制備膀胱癌標(biāo)志物中的應(yīng)用及其試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了CST1mRNA和CST4mRNA或其編碼的蛋白質(zhì)在制備膀胱癌標(biāo)志物中的應(yīng)用及其試劑盒，將CST1mRNA和CST4mRNA或其所編碼的蛋白質(zhì)聯(lián)合用于診斷和預(yù)示膀胱癌，其特異性和靈敏度高于使用其中一個標(biāo)志物；本發(fā)明還公開了檢測上述標(biāo)志物的試劑盒，其試劑盒使用方便，能夠直接收集尿液進行檢測，不需要采集血清，減少患者的取樣痛苦，并且具有特異性好和靈敏度高的特點，能夠用于膀胱癌診斷，治療過程中的療效評估及其治療后的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)監(jiān)控，為醫(yī)生提前進行干預(yù)提供了指導(dǎo)。
【專利說明】CSTImRNA和CST4mRNA或其編碼的蛋白質(zhì)在制備膀胱癌標(biāo)志物中的應(yīng)用及其試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于診斷領(lǐng)域,具體涉及Cystatin SN和Cystatin S在制備膀胱癌標(biāo)志物中的應(yīng)用，還涉及診斷膀胱癌的試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，也是全身十大常見腫瘤之一。占我國泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤發(fā)病率的第一位，而在西方其發(fā)病率僅次于前列腺癌，居第2位。2012年全國腫瘤登記地區(qū)膀胱癌的發(fā)病率為6.61/10萬，列惡性腫瘤發(fā)病率的第9位。膀胱癌可發(fā)生于任何年齡，甚至于兒童。其發(fā)病率隨年齡增長而增加，高發(fā)年齡50~70歲。隨著我國老齡化進程加速，膀胱癌發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢。國內(nèi)大城市中如北京，上海，天津，膀胱癌的發(fā)病率已位列男性常見惡性腫瘤的第六位，而死亡率位列第七位。
[0003]半胱氨酸蛋白酶抑制劑Cystatin SN和Cystatin S是人類Cystatin家族成員，分別由CSTl基因和CST4基因編碼。Cystatin SN和Cystatin S為典型的分泌蛋白，分布于體液和分泌物中，如眼淚、唾液、血清、血漿等，可以作為乳腺癌標(biāo)志物。而CSTl和CST4在胃腸腫瘤組織中的表達量高于正常組織，并且CSTl和CST4的表達與浸潤深度、遠處轉(zhuǎn)移以及腫瘤分期(?M分析)相關(guān)；生存分析表明，CSTl和CST4高表達患者的5年生存率顯著高于無表達組；Cox回歸 分析表明，CSTl和CST4是一個獨立預(yù)后因子；從而提示CSTl和CST4可能在胃腸腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮類似腫瘤抑制因子的作用。但迄今為止，未見CSTl和CST4與膀胱癌相關(guān)性的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供CSTlmRNA和CST4mRNA在制備診斷和預(yù)示膀胱癌標(biāo)志物中的聯(lián)合應(yīng)用，通過CSTlmRNA和CST4mRNA聯(lián)合檢測，提高診斷和預(yù)示膀胱癌的特異性；本發(fā)明的目的之二在于提供CSTlmRNA和CST4mRNA聯(lián)合檢測試劑盒，該試劑盒具有特異性高，使用方便等優(yōu)點；本發(fā)明的目的之三在于提供Cystatin SN和Cystatin S在制備診斷和預(yù)示膀胱癌標(biāo)志物中的聯(lián)合應(yīng)用。
[0005]為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案:
[0006]1.CST ImRNA和CST4mRNA在制備診斷和預(yù)示膀胱癌標(biāo)志物中的聯(lián)合應(yīng)用，所述CSTlmRNA的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，所述CST4mRNA的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0007]優(yōu)選的，CSTlmRNA和CST4mRNA聯(lián)合應(yīng)用的判斷公式為P =exp (-1.341+0.005a~0.001b) / [1+exp (-1.341+0.005a~0.001b)]，其中 a = CSTl 拷貝數(shù)，b=CST4拷貝數(shù)。
[0008]優(yōu)選的，所述診斷和預(yù)示為診斷、療效評估或轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)監(jiān)控。
[0009]2,CSTImRNA和CST4mRNA聯(lián)合檢測試劑盒，包括CSTlmRNA和CST4mRNA的定量檢測試劑；所述CSTlmRNA定量檢測試劑包括如SEQ ID N0.7和SEQ ID N0.8所示的檢測引物和核苷酸序列如SEQ ID N0.20所示的TaqMAN探針；所述CST4mRNA定量檢測試劑包括如SEQID N0.9和SEQ ID N0.10所示的檢測引物和核苷酸序列如SEQ ID N0.22所示的TaqMAN探針。
[0010]優(yōu)選的，所述試劑盒還包括SDHA mRNA定量檢測試劑，所述SDHA mRNA定量檢測試劑包括如SEQ ID N0.11和SEQ ID N0.12所示的檢測引物和核苷酸序列如SEQ ID N0.24所示的TaqMAN探針。
[0011]優(yōu)選的，所述試劑盒還包括特異捕獲CSTImRNA、CST4mRNA和SDHA mRNA的磁珠，所述特異捕獲CSTlmRNA的磁珠結(jié)合有如SEQ ID N0.4所示的探針，所述特異捕獲CST4mRNA的磁珠結(jié)合有如SEQ ID N0.5所示的探針，所述特異捕獲SDHA mRNA的磁珠結(jié)合有如SEQ IDN0.6所示的探針。
[0012]更優(yōu)選的，靶序列捕獲液中磁珠的濃度為500 μ g/mL，特異捕獲探針的濃度為
2μ M0
[0013]優(yōu)選的，所述試劑盒還包括10 XBuffer，dNTP, MgCl2, DMSO, DTT, Taq 酶、UDG、逆轉(zhuǎn)錄酶和RNA酶抑制劑。
[0014]3、Cystatin SN和Cystatin S在制備診斷和預(yù)示膀胱癌標(biāo)志物中的聯(lián)合應(yīng)用，編碼Cystatin SN的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，編碼Cystatin S的核苷酸序列如SEQID N0.2 所示。
[0015]優(yōu)選的，Cysta tin SN和Cystatin S聯(lián)合應(yīng)用的判斷公式為P =exp (-43.523+0.272a+0.027b) /[1+exp (-43.523+0.272a+0.027b)]，其中 a = Cystatin SN濃度，b = Cystatin S 濃度。
[0016]優(yōu)選的，所述診斷和預(yù)示為診斷、療效評估或轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)監(jiān)控。
[0017]本發(fā)明的有益效果在于:本發(fā)明公開了診斷和預(yù)示膀胱癌的新標(biāo)志物，即CSTlmRNA和CST4mRNA或其所編碼的蛋白質(zhì)，利用兩個標(biāo)志物聯(lián)合檢測的特異性和靈敏度高于使用其中一個標(biāo)志物；本發(fā)明還公開了診斷和預(yù)示膀胱癌標(biāo)志物的試劑盒，該試劑盒使用方便，能夠直接收集尿液進行檢測，不需要采集血清，減少患者的取樣痛苦，并且具有特異性好和靈敏度高的特點，其診斷結(jié)果與臨床診斷結(jié)果一致，在監(jiān)控過程中還可以及早發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)情況，為醫(yī)生提前進行干預(yù)提供了指導(dǎo)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果更加清楚，本發(fā)明提供如下附圖:
[0019]圖1為磁珠法從尿液中特異性富集mRNA原理圖。
[0020]圖2為特異性探針和非特異性探針富集CSTl基因比較結(jié)果。
[0021]圖3為特異性探針和非特異性探針富集CST4基因比較結(jié)果。
[0022]圖4為特異性探針和非特異性探針富集SDHA基因比較結(jié)果。
[0023]圖5為膀胱癌組織與癌旁組織CSTl相對表達量的比值結(jié)果圖。
[0024]圖6為膀胱癌組織與癌旁組織CST4相對表達量的比值結(jié)果圖。
[0025]圖7為CSTl絕對定量標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0026]圖8為CST4絕對定量標(biāo)準(zhǔn)曲線。[0027]圖9為檢測97例樣本的CSTl基因含量結(jié)果圖。
[0028]圖10為檢測97例樣本的CST4基因含量結(jié)果圖。
[0029]圖11為受試者CSTl基因ROC曲線。
[0030]圖12為受試者CST4基因ROC曲線。
[0031]圖13為受試者CSTl基因和CST4基因聯(lián)合檢測ROC曲線。
[0032]圖14為ELISA檢測Cystatin SN在膀胱癌組織及癌旁組織表達情況(1-T和2-T表示膀胱癌組織，1-N和2-N表示癌旁組織)。
[0033]圖15為ELISA檢測Cystatin S在膀胱癌組織及癌旁組織表達情況(1-T和2-T表示膀胱癌組織，1-N和2-N表示癌旁組織)。
[0034]圖16為Cystatin SN蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0035]圖17為Cystatin S蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0036]圖18為Cystatin SN和Cystatin S標(biāo)志物單獨檢測及聯(lián)合檢測的ROC曲線?！揪唧w實施方式】
[0037]下面將結(jié)合附圖，對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進行詳細的描述。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆實驗指南(第三版，J-薩姆布魯克等著)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0038]實施例1、磁珠法從尿液中特異性富集CSTl、CST4和SDHA基因的mRNA
[0039]根據(jù)CST1、CST4和SDHA的mRNA序列設(shè)計捕獲CST1、CST4和SDHA基因mRNA的特異探針(CSTlmRNA的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，CST4mRNA的核苷酸序列如SEQ IDN0.2，SDHA mRNA的核苷酸序列如SEQ ID N0.3)，具體如下:捕獲CSTlmRNA的探針為5’_aaagagcacaactgtttcttctgca (dA) 30-3’ (SEQ ID N0.4)，捕獲 CST4mRNA 的探針為 5’_taccaggtctattagaagca(dA) 30-3’(SEQ ID N0.5)，捕獲內(nèi)參基因SDHA (泛醌還原酶)mRNA的探針為5’ -ggagcgaatggctggcgggacg(dA) 30-3’ (SEQ ID N0.6),上述特異探針能夠與磁珠(GE,貨號為3815-2103-010150)的olig(dT)互補結(jié)合，得結(jié)合特異探針的磁珠。
[0040]富集CST1、CST4和RPNl基因的mRNA，具體步驟如下:將新鮮尿液與樣本運輸保存液按照體積比為2:1的比例混合，得處理后的尿液樣本，該處理后的尿液樣本4°C條件下可保存一周，-20°C條件下可保存I年；然后分別將200 μ L含有磁珠的靶序列捕獲液加入到200yL處理后的尿液中，于75°C條件下處理5分鐘；渦旋混勻后，室溫靜置15分鐘；然后將樣品置于磁性分離器上，5分鐘后，吸棄上清，加入ImL漂洗液，渦旋混勻，上磁性分離器，5分鐘后，吸棄上清；最后室溫(18~25°C)靜置5分鐘，加入洗脫液20yL，槍頭吹打混勻，上磁力架5分鐘，將上清轉(zhuǎn)移至新的EP管中，富集原理如圖1所示。
[0041] 富集過程中，樣品運輸保存液中各組分濃度如下:110mM LiDS(十二烷基硫酸鋰)，IOmM NaH2PO4, IOmM Na2HPO4, 5mM EDTA, 7mM EGTA, pH7.5 ;靶序列捕獲液中各組分濃度如下:135mM HEPES, 1.25M LiCl, IlOmM LiOH, IOmM EDTA, ρΗ7.0，500 μ g/mL 磁珠，2 μ M 捕獲探針；漂洗液中各組分濃度如下:100mM HEPES,350mM NaCl, IOmM NaOH，2mM EDTA,3%乙醇，0.2%羥基甲酯，0.1%羥基丙酯，0.1% SDS, pH7.5 ;洗脫液中各組分濃度如下:20mMTris-HCl，ρΗ7.5，ImM EDTA0
[0042]同時以非特異性探針oligo(dT)按上述相同的方法非特異性富集mRNA。[0043]將上述富集獲得的mRNA通過定量PCR分別檢測CSTImRNA、CST4mRNA和SDHAmRNA的相對含量，檢測所使用的引物如下:
[0044]CSTl 檢測引物:上游引物:5，-agagccaggcaacagacc-3’ (SEQ ID N0.7)
[0045]下游引物:5，-gttcatggaaggcacagg-3’ (SEQ ID N0.8)
[0046]CST4 檢測引物:上游引物:5’ -atgaacagccagaactgca-3’ (SEQ ID N0.9)
[0047]下游引物:5，-caagaaggaaggagggag-3，(SEQ ID N0.10)
[0048]SDHA 檢測引物:上游引物:5，-attactccaagcccatcc-3’ (SEQ ID N0.11)
[0049]下游引物:5，-gcacagtcagcctcgttc-3’ (SEQ ID N0.12)
[0050]然后構(gòu)建如下檢測體系:SYBR Green2XMixlO μ L(購于東洋紡(上海)生物科技有限公司)，終濃度分別為250ηΜ的上游引物和下游引物，模板2 μ L，加ddH20將體積補充M 20 μ Lo
[0051 ] 并按如下條件檢測:先預(yù)變性5分鐘，然后在95°C變性10秒、60°C退火15秒、72°C延伸20秒，進行45個循環(huán)；最后熔解:95°C，I分鐘；40°C，I分鐘；65°C，I秒；95°C，I分鐘，冷卻 50°C，30sec。
[0052]同時以oligo(dT)非特異性富集的mRNA為對照,檢測引物、體系和檢測條件按上述方法進行，然后比較CSTl 、CST4和SDHA基因mRNA CP值(Cross Point)，結(jié)果如圖2_4所
/Jn ο
[0053]由圖2-4可知，使用特異探針富集到的CSTImRNA、CST4mRNA和SDHA mRNA的CP值更小，表明其富集的濃度更高，具有背景低，信噪比高的特點，優(yōu)于使用非特異探針富集的mRNA ο
[0054]實施例2、檢測CSTl和CST4在膀胱癌組織中表達情況
[0055]從上海第五人民醫(yī)院泌尿外科收集膀胱癌、癌旁配對組織樣本30例，切至米粒大小，放至RNAlater保存液中_80°C貯存，使用前平衡至室溫。然后按照實施例1的方法分別富集膀胱癌和癌旁配對組織的CSTlmRNA、CST4mRNA和SDHA mRNA，再分別以CSTl檢測引物、CST4檢測引物和內(nèi)參基因SDHA檢測引物檢測30例樣本膀胱癌和癌旁配對組織中CSTl基因和CST4基因相對表達量，檢測體系和檢測條件與實施例1相同。檢測結(jié)果采用法計算相對表達量，然后統(tǒng)計膀胱癌與癌旁配對組織相對表達量的比值(C/N)，統(tǒng)計結(jié)果如圖5和圖6所示。由圖5和圖6可知，CSTl基因和CST4基因在膀胱癌組織中明顯上調(diào)，明顯高于癌旁組織的表達量，上述結(jié)果預(yù)示檢測CSTlmRNA和CST4mRNA含量可以用于診斷膀胱癌。
[0056]實施例3、構(gòu)建膀胱癌檢測試劑盒
[0057]1、構(gòu)建CSTl重組質(zhì)粒
[0058]以膀胱癌細胞株T24為材料提取膀胱癌細胞株T24總mRNA，然后以提取的mRNA為模板合成cDNA，并根據(jù)CSTl基因序列設(shè)計構(gòu)建CSTl重組質(zhì)粒的引物，上游引物為5，_ctggagccccaaggagga_3，(SEQ ID N0.13),下游引物為 5，_accagtccaggggtggga_3，(SEQID N0.14)，以SEQ ID N0.13和SEQ ID N0.14所示核苷酸為引物，合成的cDNA為模板進行PCR擴增，擴增條件為:94°C變性5分鐘；94°C變性30秒、60°C退火30秒、72°C延伸I分鐘，進行45個循環(huán)；72°C延伸5分鐘，4°C冷卻。將擴增產(chǎn)物與PTZ57R載體連接，構(gòu)建CSTl重組質(zhì)粒，并將重組質(zhì)粒送測序機構(gòu)測序，測序表明擴增產(chǎn)物的核苷酸序列如SEQ IDN0.15所示。該序列與理論擴增子序列相同，然后將CSTl重組質(zhì)粒用甘油保種，作為檢測CSTl基因的標(biāo)準(zhǔn)品。
[0059]2、構(gòu)建CST4重組質(zhì)粒
[0060]根據(jù)CST4基因序列設(shè)計構(gòu)建CST4重組質(zhì)粒的引物，上游引物為5，_tctgaggagaccatggcc_3，(SEQ ID N0.16)，下游引物為 5，-tgtaccaggtctattagaagcaag-3’ (SEQ ID N0.17)，然后以SEQ ID N0.16和SEQ ID N0.17的核苷酸為引物，合成的cDNA為模板進行PCR擴增，擴增條件為:94°C變性5分鐘；94°C變性30秒、60°C退火30秒、72°C延伸I分鐘，進行45個循環(huán)；72°C延伸5分鐘，4°C冷卻。將擴增產(chǎn)物與pTZ57R載體連接，構(gòu)建CST4重組質(zhì)粒，并將重組質(zhì)粒送測序機構(gòu)測序,測序表明擴增產(chǎn)物的核苷酸序列如SEQ IDN0.18所示。該序列與理論擴增子序列相同，然后將CST4重組質(zhì)粒用甘油保種，作為CST4基因的標(biāo)準(zhǔn)品。
[0061]分別將CSTl重組質(zhì)粒和CST4重組質(zhì)粒，通過雙酶切(EcoR 1、BamH I )線性化目標(biāo)序列，割膠回收得到純的線性化片段。使用體外轉(zhuǎn)錄試劑盒，以線性化的序列為模板，在T7RNA聚合酶的作用下，制備得到RNA，經(jīng)RNA純化試劑盒純化后，得到RNA標(biāo)準(zhǔn)品貯液，測定濃度。經(jīng)Agilent2100作RNA完整性分析，電泳圖譜顯示除目標(biāo)序列外無其他明顯的雜帶及RNA降解帶，則可以作為RNA標(biāo)準(zhǔn)品貯液，以備下游使用。
[0062]實施例4、繪制CSTl和CST4的標(biāo)準(zhǔn)曲線
[0063]將實施例3獲得的mRNA標(biāo)準(zhǔn)品作如表1和表2的梯度稀釋，具體如下:
[0064]表1、CSTIRNA標(biāo)準(zhǔn)品稀釋梯度 [0065]
【權(quán)利要求】
1.CSTlmRNA和CST4mRNA在制備診斷和預(yù)示膀胱癌標(biāo)志物中的聯(lián)合應(yīng)用，所述CSTlmRNA的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，所述CST4mRNA的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于=CSTlmRNA和CST4mRNA聯(lián)合應(yīng)用的判斷公式為 P = exp (-1.341+0.005a~0.001b) /[1+exp (-1.341+0.005a~0.001b)]，其中 a = CSTl拷貝數(shù)，b = CST4拷貝數(shù)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于:所述診斷和預(yù)示為診斷、療效評估或轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)監(jiān)控。
4.CSTlmRNA和CST4mRNA聯(lián)合檢測試劑盒，其特征在于,包括CSTlmRNA和CST4mRNA的定量檢測試劑；所述CSTlmRNA定量檢測試劑包括如SEQ ID N0.7和SEQ ID N0.8所示的檢測引物和核苷酸序列如SEQ ID N0.20所示的TaqMAN探針；所述CST4mRNA定量檢測試劑包括如SEQ ID N0.9和SEQ ID N0.10所示的檢測引物和核苷酸序列如SEQ ID N0.22所示的TaqMAN 探針。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于:所述試劑盒還包括SDHAmRNA定量檢測試劑，所述SDHA mRNA定量檢測試劑包括如SEQ ID N0.11和SEQ ID N0.12所示的檢測引物和核苷酸序列如SEQ ID N0.24所示的TaqMAN探針。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于:所述試劑盒還包括特異捕獲CSTlmRNA、CST4mRNA和SDHA mRNA的磁珠，所述特異捕獲CSTlmRNA的磁珠結(jié)合有如SEQ ID N0.4所示的探針，所述特異捕獲CST4mRNA的磁珠結(jié)合有如SEQ ID N0.5所示的探針，所述特異捕獲SDHA mRNA的磁珠結(jié)合有如 SEQ ID N0.6所示的探針。
7.根據(jù)權(quán)利要求4-6任一項所述的試劑盒，其特征在于:所述試劑盒還包括IOXBuffer, dNTP, MgCl2, DMSO, DTT, Taq 酶、UDG、逆轉(zhuǎn)錄酶和 RNA 酶抑制劑。
8.Cystatin SN和Cystatin S在制備診斷和預(yù)示膀胱癌標(biāo)志物中的聯(lián)合應(yīng)用，其特征在于:編碼Cystatin SN的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示,編碼Cystatin S的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于:CystatinSN和Cystatin S聯(lián)合應(yīng)用的判斷公式為 P = exp (-43.523+0.272a+0.027b) /[1+exp (-43.523+0.272a+0.027b)]，其中 a=Cystatin SN 濃度，b = Cystatin S 濃度。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的應(yīng)用，其特征在于:所述診斷和預(yù)示為診斷、療效評估或轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)監(jiān)控。
【文檔編號】C12Q1/68GK103966348SQ201410233905
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2014年5月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月29日
【發(fā)明者】王弢, 渠香云, 何林富 申請人:上海度微醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司