本發(fā)明屬于生物技術(shù)檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種豬圓環(huán)病毒2型抗原定量檢測(cè)試劑盒。
背景技術(shù)：
：豬圓環(huán)病毒2型(porcinecircovirustype2，pcv2)屬于圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬，為無囊膜的單股負(fù)鏈環(huán)狀dna病毒，直徑在17-20nm，是已知的最小的動(dòng)物病毒之一。依據(jù)豬圓環(huán)病毒2型結(jié)構(gòu)蛋白cap的編碼基因，可細(xì)分為多種基因型，如pcv2a、pcv2b、pcv2c等，其中起主要致病作用的pcv2b又存在多個(gè)毒株。pcv2感染可引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征、懷孕母豬繁殖障礙、斷奶豬和育肥豬呼吸道疾病、豬皮炎和腎炎綜合征、幼齡仔豬先天性震顫等疾病。pcv2感染于20世紀(jì)90年代相繼在加拿大、美國(guó)、歐洲、東南亞豬群中被發(fā)現(xiàn)。我國(guó)自2000年出現(xiàn)首例豬圓環(huán)病毒感染的報(bào)道以來，pcv2感染豬群狀況嚴(yán)重，表現(xiàn)為流行范圍廣，陽性率高，混合感染，種豬感染率高，嚴(yán)重阻礙養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。目前，豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病的預(yù)防主要依賴免疫pcv2病毒滅活疫苗和表達(dá)pcv2cap蛋白的基因工程疫苗。國(guó)內(nèi)各廠家生產(chǎn)的滅活疫苗所用毒株有a基因型的pcv2-sh株和多個(gè)b基因型的pcv2毒株。由于我國(guó)流行圓環(huán)病毒為pcv2b型，因此采用pcv2b毒株制備的疫苗在疫病防控中效果更佳。滅活疫苗質(zhì)量控制的重點(diǎn)之一是抗原的含量，檢測(cè)方法均是基于抗體技術(shù)的免疫學(xué)方法。生產(chǎn)中采用的是間接免疫熒光法(ifa方法)測(cè)定發(fā)酵病毒滴度。該方法操作周期長(zhǎng)(一周)、設(shè)備要求高(熒光顯微鏡)。目前也有采用夾心elisa技術(shù)開發(fā)的pcv2抗原檢測(cè)試劑盒。文獻(xiàn)報(bào)道的試劑盒均采用單克隆抗體與多克隆抗體或者兩種不同的單克隆抗體配對(duì)方式構(gòu)建。前者存在批次間的穩(wěn)定性較差、結(jié)果一致性較差的問題；在成本上，由于制備試劑盒需要生產(chǎn)多種抗體，生產(chǎn)方法較為復(fù)雜、成本較高。后一種方式構(gòu)建的試劑盒在檢測(cè)靈敏度上無法滿足需求。此外，實(shí)際應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)，市售單克隆抗體往往對(duì)各廠家所用的不同pcv2毒株的廣譜識(shí)別性差，檢測(cè)工作依賴價(jià)格昂貴的進(jìn)口pcv2單抗或多抗檢測(cè)血清。因此，克服現(xiàn)有試劑盒存在的問題，開發(fā)一種能夠用于多個(gè)pcv2毒株檢測(cè)的豬圓環(huán)病毒2型抗原檢測(cè)試劑盒，對(duì)試劑盒的主要材料-單克隆抗體提出了更高的要求。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種豬圓環(huán)病毒2型抗原定量檢測(cè)試劑盒，該試劑盒的檢測(cè)抗體是將包被抗體進(jìn)行酶標(biāo)記后獲得的，制備方法簡(jiǎn)單、成本低、抗原廣譜性好、靈敏度高、特異性高、重復(fù)性好。本發(fā)明的目的采用如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明提供一種分泌抗豬圓環(huán)病毒2型單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株1g9，保藏號(hào)為：cctccno:c2016105。本還發(fā)明提供所述雜交瘤細(xì)胞株分泌的抗豬圓環(huán)病毒2型單克隆抗體。本還發(fā)明提供一種豬圓環(huán)病毒2型抗原定量檢測(cè)試劑盒，該檢測(cè)試劑盒包括:檢測(cè)抗體和包被有所述抗豬圓環(huán)2型單克隆抗體的酶標(biāo)板，所述檢測(cè)抗體為酶標(biāo)記的權(quán)利要求2所述抗豬圓環(huán)2型單克隆抗體。優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述檢測(cè)抗體為辣根過氧化物酶標(biāo)記的權(quán)利要求2所述抗豬圓環(huán)2型單克隆抗體。優(yōu)選的技術(shù)方案中，在于所述酶標(biāo)板是采用0.5-1.5μg/ml抗豬圓環(huán)2型單克隆抗體包被的；所述檢測(cè)抗體的濃度為400-600ng/ml。優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述試劑盒還包括標(biāo)準(zhǔn)品母液、陰性對(duì)照、樣本稀釋液、終止液、洗滌液、辣根過氧化物酶催化底物a液和底物b液；所述標(biāo)準(zhǔn)品母液是病毒含量為105.5tcid50/ml的pcv2-nj株病毒培養(yǎng)液；所述陰性對(duì)照為pk15細(xì)胞裂解液；所述樣本稀釋液為mem培養(yǎng)液；所述辣根過氧化物酶催化底物a液為體積濃度為3％的h2o2的水溶液；所述辣根過氧化物酶催化底物b液為含有3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺的溶液；所述終止液為2m的硫酸水溶液；所述洗滌液是添加有終濃度為0.05％的tween20的ph7.4、10mm的pbs緩沖液。本發(fā)明還提供所述試劑盒在定量檢測(cè)豬圓環(huán)病毒2型抗原中的應(yīng)用。本發(fā)明試劑盒與現(xiàn)有技術(shù)相比，有益效果如下：(1)本發(fā)明試劑盒適用于多個(gè)基因型的pcv2毒株的檢測(cè)：本發(fā)明采用天然pcv2病毒作為免疫原和篩選抗原，獲得的抗pcv2單克隆抗體1g9’與天然的pcv2病毒反應(yīng)性良好。該抗體識(shí)別pcv2種類包括：pcv2-nj株、pcv2-zj/c株、pcv2-wh株、pcv2-dbn-sx07株及pcv2-sh株。解決了不同廠商pcv2毒種來源不同導(dǎo)致的檢測(cè)用抗體不通用的問題。(2)本發(fā)明試劑盒適用于基因工程疫苗的檢測(cè)：利用大腸桿菌或桿狀病毒表達(dá)的pcv2cap蛋白能夠模擬天然病毒結(jié)構(gòu)，組裝成病毒樣粒子(vlp)。本發(fā)明試劑盒中1g9’單克隆抗體與基因工程方法生產(chǎn)的pcv2vlp抗原仍然保持良好的反應(yīng)性。因此，本發(fā)明試劑盒也適用于pcv2基因工程疫苗的檢測(cè)。(3)本發(fā)明試劑盒特異性好，可以作為鑒別診斷用途：本發(fā)明試劑盒與ppv、pedv、csfv、prrsv、prv、fmdv、jev等豬常見病毒無交叉反應(yīng)。因此可以作為鑒別診斷用途。(4)本發(fā)明試劑盒與ifa方法符合率高：本發(fā)明試劑盒檢測(cè)pcv2病毒毒價(jià)的結(jié)果與傳統(tǒng)的免疫熒光法(ifa方法)測(cè)定毒價(jià)結(jié)果高度相關(guān)，并且操作周期更短，設(shè)備要求低，結(jié)果判定無主觀因素干擾，可替代現(xiàn)有pcv2毒價(jià)測(cè)定方法。(5)本發(fā)明試劑盒的成本低、批間重復(fù)性好：本發(fā)明試劑盒中的捕獲抗體為單克隆抗體1g9’，檢測(cè)抗體為辣根過氧化物酶標(biāo)記的單克隆抗體1g9’，因此本發(fā)明試劑盒生產(chǎn)中不需要制備兩種或兩種以上的單克隆抗體或多克隆抗體，僅需生產(chǎn)一種抗體并對(duì)其進(jìn)行標(biāo)記即可，顯著降低了生產(chǎn)成本、避免試劑污染。與現(xiàn)有專利中多抗與單抗組合形式生產(chǎn)的pcv2抗原檢測(cè)試劑盒相比，本發(fā)明試劑盒在批間重復(fù)性上更好。原因在于：含有多克隆抗體的血清中能夠特異性結(jié)合目標(biāo)蛋白的抗體僅占0.5％-5％(bradburya,plückthuna.reproducibility:standardizeantibodiesusedinresearch[j].nature,2015,518:27-29.)，并且每次免疫產(chǎn)生的抗體組合受到免疫動(dòng)物個(gè)體差異、免疫、抗體純化操作等因素的影響而絕不相同。(6)本發(fā)明試劑盒克服兩株不同的單克隆抗體配對(duì)造成的靈敏度不足：名稱為“豬圓環(huán)病毒2型elisa抗原檢測(cè)試劑盒及其制備方法和其應(yīng)用”、專利號(hào)為cn201210356552.7中嘗試以同一株單克隆抗體作為捕獲抗體與檢測(cè)抗體，出現(xiàn)性能嚴(yán)重降低，無法滿足檢測(cè)的問題。本發(fā)明提供的單克隆抗體1g9’性能較好，配對(duì)效果也較好，檢測(cè)性能達(dá)到了多抗與單抗組合的試劑盒水平。(7)本發(fā)明試劑盒檢測(cè)準(zhǔn)確，操作簡(jiǎn)便快捷：與目前常用的ifa和rt-pcr方法檢測(cè)pcv2抗原方法相比，本發(fā)明建立的pcv2抗原定量檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)法成本低、操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)周期由一周縮短至2小時(shí)、重復(fù)性好，為pcv2疫苗生產(chǎn)中抗原定量提供了實(shí)用、快速、有效的檢測(cè)工具。附圖說明圖1sds-page電泳檢測(cè)純化的his-vhh，其中m：蛋白標(biāo)準(zhǔn)樣；4:純化前的his-vhh；1-3：純化后的his-vhh。圖2sds-page方法檢測(cè)親和純化獲得的pcv2-nj株病毒的純度，其中m：蛋白標(biāo)準(zhǔn)樣；1:親和純化后獲得的pcv2-nj株病毒；2：pcv2病毒培養(yǎng)液。圖3免疫熒光方法檢測(cè)抗pcv2單克隆抗體與pcv2-nj的反應(yīng)性，圖左側(cè)標(biāo)注了實(shí)驗(yàn)采用的單克隆抗體，下方標(biāo)注了實(shí)驗(yàn)采用的毒株。圖4雜交瘤細(xì)胞株1g9腹水純化后的sds-page分析圖，m：蛋白標(biāo)準(zhǔn)樣；1-9：純化后的單克隆抗體1g9’；10：含有單克隆抗體1g9’的腹水上清稀釋液(稀釋30倍)。圖5本發(fā)明試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖6本發(fā)明試劑盒的特異性。圖7本發(fā)明試劑盒在檢測(cè)pcv2亞單位疫苗抗原中的應(yīng)用，陽性對(duì)照為pcv2-nj株病毒液；陰性對(duì)照為pk15細(xì)胞裂解液。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。實(shí)例一免疫抗原的制備為了保持免疫抗原(pcv2-nj株)的天然結(jié)構(gòu)，提高純化效率，縮短純化周期，采用鎳柱掛載重組蛋白his-vhh，對(duì)pcv2-nj株病毒進(jìn)行特異性親和純化。his-vhh是帶his標(biāo)簽蛋白的抗pcv2納米抗體。該重組蛋白制備方法如下：將專利號(hào)為zl201210249621.4、名稱為“抗豬圓環(huán)病毒2型的雙峰駝重鏈單域抗體及其制備方法和用途”中抗pcv2納米抗體vhh的核苷酸序列(見該專利序列表中seqidno.4)上下游分別添加ndeⅰ和hindⅲ酶切位點(diǎn)，人工合成該dna片段。將該合成片段插入表達(dá)載體pet32a(+)(載體含有his標(biāo)簽序列)的ndeⅰ和hindⅲ酶切位點(diǎn)之間，然后導(dǎo)入大腸桿菌誘導(dǎo)表達(dá)。表達(dá)蛋白采用鎳柱親和純化，即獲得重組蛋白his-vhh。該重組蛋白可用于pcv2-nj株的純化以及雜交瘤細(xì)胞克隆上清抗體效價(jià)檢測(cè)中的捕獲抗體。重組蛋白his-vhh的純化效果見圖1。從圖1可以看到，分子量約為15kd的重組蛋白his-vhh被成功純化。采用重組蛋白his-vhh純化pcv2-nj株抗原，具體方法如下：(1)取10mghis-vhh蛋白，以上樣緩沖液(ph7.2、20mm的pb緩沖液)溶液稀釋20倍后，以1ml/min流速對(duì)鎳柱上樣；(2)以上樣緩沖液(ph7.2、20mm的pb緩沖液)洗滌鎳柱5個(gè)柱體積；(3)取500mlpcv2-nj株病毒培養(yǎng)液(采用pk15細(xì)胞增殖后，裂解，離心，取上清液后獲得)以1ml/min對(duì)鎳柱上樣，從而與掛在鎳柱上的his-vhh蛋白相結(jié)合；(4)以上樣緩沖液(ph7.2、20mm的pb緩沖液)洗滌鎳柱5個(gè)柱體積；(5)以含500mm咪唑的上樣緩沖液洗脫樣品，與his-vhh蛋白相結(jié)合的pcv2-nj株病毒被一起洗脫下來，收集洗脫液；(6)以截留分子量為5kd的超濾管將洗脫液中的緩沖液置換為pbs緩沖液，得到了純化后的pcv2-nj株抗原。(7)電泳分析純化產(chǎn)物。電泳結(jié)果見圖2。由圖2可知，該方法能夠高效富集病毒并去除絕大多數(shù)的雜質(zhì)蛋白。純化后的pcv2-nj株抗原，由于純度較高，作為免疫抗原使用時(shí)，可以獲得較好的免疫效果。實(shí)例二單克隆抗體的篩選、鑒定、制備與純化1.小鼠免疫將實(shí)例一獲得的pcv2-nj株抗原作為免疫抗原，采用bca蛋白定量試劑盒(購自pierce公司)檢測(cè)蛋白含量，調(diào)整濃度至0.5μg/μl，通過頸背部皮下多點(diǎn)注射方式免疫6周齡雌性balb/c小鼠，首次免疫劑量100μg/只，三周后以50μg/只劑量加強(qiáng)免疫，此后間隔2周再次進(jìn)行加強(qiáng)免疫。最后一次免疫后一周采血，以未免疫小鼠血清作為對(duì)照，采用間接elisa方法檢測(cè)免疫小鼠的血清效價(jià)。間接elisa方法具體如下：小鼠血清采用pbst緩沖液作10倍比梯度稀釋，稀釋度為103～107；向豬圓環(huán)病毒2型elisa抗體檢測(cè)試劑盒(購自武漢科前生物股份有限公司)的檢測(cè)酶標(biāo)板中加入稀釋后的小鼠血清，100μl/孔；37℃孵育1h，洗滌3次后，加入酶標(biāo)二抗工作液(用含有1％bsa的pbst緩沖液稀釋將hrp標(biāo)記的羊抗鼠二抗作1:5000稀釋，hrp標(biāo)記的羊抗鼠二抗購自jacksonimmunoresearch，貨號(hào)為115-065-146)37℃孵育1h；洗滌后加入辣根過氧化物酶催化底物a液和b液等體積混合溶液(同實(shí)施例五)100μl/孔，37℃顯色10min后，加入終止液(2m的h2so4溶液)100μl/孔。采用酶標(biāo)儀檢測(cè)每孔在450nm處的吸光值。選擇pcv2抗體效價(jià)在105以上的小鼠進(jìn)行融合，在進(jìn)行細(xì)胞融合前3天，每只小鼠腹腔注射50μg免疫抗原。2.細(xì)胞融合無菌摘取免疫小鼠脾臟，與sp2/0細(xì)胞(小鼠骨髓瘤細(xì)胞)按照1:5比例混勻后，采用聚乙二醇peg1450進(jìn)行常規(guī)化學(xué)融合。融合細(xì)胞采用hat培養(yǎng)基(購自sigma)進(jìn)行選擇性培養(yǎng)。3.克隆篩選檢測(cè)方法的建立檢測(cè)雜交瘤細(xì)胞株分泌抗體效價(jià)的方法：采用雙抗夾心elisa方法檢測(cè)抗體效價(jià)，以實(shí)施例一中制備的重組蛋白his-vhh作為捕獲抗體，pcv2-nj株病毒(采用pk15細(xì)胞增殖后，裂解，離心，取上清液后獲得)作為夾心抗原，雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清作為檢測(cè)一抗，hrp標(biāo)記的羊抗鼠igg(h+l)(購自jacksonimmunoresearch)作為二抗，陰性對(duì)照中以離心后的pk15細(xì)胞裂解液上清代替pcv2-nj株病毒作為夾心抗原，檢測(cè)450nm下的吸光值。結(jié)果判定：同一份雜交瘤培養(yǎng)上清，采用pcv2-nj株病毒作為夾心抗原的檢測(cè)結(jié)果高于采用pk15細(xì)胞裂解液上清作為夾心抗原(陰性對(duì)照)的檢測(cè)結(jié)果，即可進(jìn)行亞克隆。亞克隆中挑選單克隆重復(fù)上述的檢測(cè)。直至獲得的單克隆化的雜交瘤細(xì)胞株培養(yǎng)上清與pk15細(xì)胞不反應(yīng)，與pcv2-nj株病毒液反應(yīng)強(qiáng)。4.雜交瘤細(xì)胞單克隆化對(duì)步驟3獲得的雜交瘤細(xì)胞采用有限稀釋法，進(jìn)行亞克隆，獲得全陽性單克隆化的雜交瘤細(xì)胞株后，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)及凍存。最終獲得7株穩(wěn)定分泌抗pcv2單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為1g9、1b2、1e7、6h2、4c2、23f5、1f3，分泌的抗pcv2單克隆抗體依次命名為1g9’、1b2’、1e7’、6h2’、4c2’、23f5’和1f3’。5.單克隆抗體的鑒定(1)單克隆抗體的亞類鑒定：將7株雜交瘤細(xì)胞株的培養(yǎng)上清液(含有其分泌的單克隆抗體)按sigma公司的免疫球蛋白標(biāo)準(zhǔn)亞類快速鑒定試劑盒操作說明書進(jìn)行亞型鑒定。亞類鑒定結(jié)果顯示單克隆抗體1g9’、1b2’、1e7’、6h2’為igg2a型；單克隆抗體4c2’為igg3型；單克隆抗體23f5’、1f3’為igg2b型。(2)單克隆抗體反應(yīng)性：經(jīng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，單克隆抗體1g9’不適用于sds-page中檢測(cè)pcv2-nj株，而適用于ifa及elisa。由于sds-page涉及樣品變性處理暴露蛋白線性結(jié)構(gòu)，由此可以推測(cè)單克隆抗體1g9’是識(shí)別病毒蛋白折疊形成的空間構(gòu)象。(3)單克隆抗體在免疫熒光檢測(cè)中的應(yīng)用采用間接免疫熒光法檢測(cè)上述7株雜交瘤細(xì)胞株分泌的單克隆抗體對(duì)pcv2-nj株的識(shí)別情況。具體操作步驟：將pk15細(xì)胞鋪在96孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80％融合度時(shí)，分為兩組：一組細(xì)胞不加入pcv2病毒液作為陰性對(duì)照，另一組細(xì)胞分別加入pcv2的不同毒株病毒液孵育24小時(shí)，然后更換兩組細(xì)胞的培養(yǎng)液為含2％小牛血清的dmem培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)72h。免疫熒光實(shí)驗(yàn)步驟：-20℃預(yù)冷的80％丙酮溶液在4℃固定細(xì)胞30min，pbst洗滌三次拍干，對(duì)每種毒株分別加入單克隆抗體1g9’、1b2’、1e7’、6h2’、4c2’、23f5’和1f3’，37℃孵育1h，同時(shí)設(shè)sp2/0細(xì)胞培養(yǎng)上清液作為陰性對(duì)照。pbst洗滌3次后，加入fitc標(biāo)記羊抗鼠igg抗體(購自武漢博士德生物工程有限公司)，37℃孵育1h，pbst洗滌3次后用熒光顯微鏡觀察。結(jié)果顯示，單克隆抗體1b2’、1g9’、4c2’和23f5’能夠識(shí)別pcv2-nj株(圖3)。因此，選擇單克隆抗體1b2’、1g9’、4c2’、23f5’作為研究對(duì)象，進(jìn)行下面的實(shí)驗(yàn)。6.雜交瘤細(xì)胞株穩(wěn)定性檢測(cè)在雜交瘤細(xì)胞株凍存12個(gè)月后，從液氮中取出凍存的雜交瘤細(xì)胞株復(fù)蘇，采用含10％胎牛血清的dmem培養(yǎng)基培養(yǎng)24h后本實(shí)施例標(biāo)題3中雙抗夾心elisa方法檢測(cè)雜交瘤細(xì)胞株分泌的單克隆抗體效價(jià)，以評(píng)價(jià)雜交瘤細(xì)胞株的穩(wěn)定性。結(jié)果見表1，雜交瘤細(xì)胞株培養(yǎng)上清的效價(jià)與凍存時(shí)相同，抗體分泌穩(wěn)定。對(duì)傳代50代次后的雜交瘤細(xì)胞株培養(yǎng)上清檢測(cè)抗體效價(jià)，仍然與凍存前相同，因此這些細(xì)胞株分泌的單克隆抗體性能穩(wěn)定。表1顯示了雜交瘤細(xì)胞株1b2、1g9、4c2、23f5培養(yǎng)上清的抗體效價(jià)7.單克隆抗體的制備與純化：分別采用雜交瘤細(xì)胞株1b2、1g9、4c2和23f5制備相應(yīng)的單克隆抗體1b2’、1g9’、4c2’和23f5’。(1)按照常規(guī)方法制備含單克隆抗體的腹水上清：取8～10周齡雌性balb/c小鼠，腹腔注射弗氏不完全佐劑0.5ml/只，7天后將狀態(tài)良好的雜交瘤細(xì)胞株以pbs緩沖液重懸浮，以5×105個(gè)細(xì)胞/只腹腔注射小鼠。約10天后采集腹水，離心去除不溶雜質(zhì)，取腹水上清凍存于-70℃?zhèn)溆谩?2)單克隆抗體純化：按上述方法制備含單克隆抗體1b2’、1g9’、4c2’、23f5’的腹水上清，采用gehitraprproteinafastflow親和純化柱(購自ge生命科學(xué))對(duì)各單克隆抗體進(jìn)行純化。純化后的單克隆抗體經(jīng)過10％sds-page電泳分析純度(純度>95％)，用截留分子量為50kd的超濾管進(jìn)行濃縮，并將緩沖液置換為pbs緩沖液。從圖4中可以看出，單克隆抗體ig9’純度達(dá)到了95％以上。(3)純化后的單克隆抗體效價(jià)測(cè)定：將純化后的單克隆抗體稀釋到1mg/ml，從1:1000開始2倍比稀釋。采用本實(shí)施例標(biāo)題3中雙抗夾心elisa方法測(cè)定抗體效價(jià)，結(jié)果見表2。表2純化后的單克隆抗體的效價(jià)單克隆抗體編號(hào)效價(jià)1b2’1.02×1061g9’1.02×1064c2’2.04×10623f5’1.02×106實(shí)例三酶標(biāo)抗體的制備1.制備辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗pcv2單克隆抗體采用辣根過氧化物酶分別對(duì)抗pcv2單克隆抗體1b2’、1g9’、4c2’、23f5’進(jìn)行標(biāo)記，具體方法如下：(1)將5mghrp(辣根過氧化物酶)溶于1ml去離子水中，加0.2ml、0.1m的naio4溶液，混勻，密閉，室溫避光反應(yīng)20分鐘。(2)將步驟(1)所得溶液裝入透析袋中，采用ph4.4、1mm的醋酸鈉緩沖液在4℃透析過夜。(3)將10mg純化后的單克隆抗體1b2’、1g9’、4c2’或23f5’采用ph9.5、10mm的碳酸鹽緩沖液透析過夜。(4)取步驟(2)透析結(jié)束后透析袋內(nèi)溶液，加入40ulph9.5、0.2m的碳酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)ph到9.0～9.5，然后加入經(jīng)過(3)處理后的單克隆抗體，混勻，室溫避光反應(yīng)2小時(shí)。(5)加入0.1ml新配制的4mg/ml硼氫化鈉溶液，混勻，4℃放置2小時(shí)。(6)用截留分子量為100kd的超濾管對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行超濾，去除游離的hrp，并將辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗pcv2單克隆抗體1b2’、1g9’、4c2’和23f5’的緩沖液置換成ph7.4、10mm的pbs緩沖液，加入防腐劑和等體積的甘油，置于-20℃凍存。(7)用bca蛋白定量試劑盒測(cè)定辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗pcv2單克隆抗體1b2’、1g9’、4c2’和23f5’的濃度，調(diào)整濃度至4mg/ml。2.辣根過氧化物酶標(biāo)記的單克隆抗體效價(jià)辣根過氧化物酶標(biāo)記的單克隆抗體1b2’、1g9’、4c2’和23f5’稀釋至1mg/ml，分別記為1b2’e、1g9’e、4c2’e、23f5’e。利用實(shí)施例二標(biāo)題3中雙抗夾心elisa方法對(duì)各酶標(biāo)抗體效價(jià)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果見表3，上述4種辣根過氧化物酶標(biāo)記抗體的效價(jià)均達(dá)到5.12×105及以上。表3酶標(biāo)抗體效價(jià)測(cè)定酶標(biāo)抗體1g9’e1b2’e4c2’e23f5’e抗體效價(jià)5.12×1051.02×1062.05×1065.12×105實(shí)例四pcv2抗原定量檢測(cè)方法的建立1.雙抗體夾心配對(duì)中抗體的選擇將單克隆抗體1b2’、1g9’、4c2’和23f5’作為包被抗體，1b2’e、1g9’e、4c2’e和23f5’e作為檢測(cè)抗體，樣品檢測(cè)孔中以pcv2-nj株為夾心抗原，陰性對(duì)照孔中以pk15細(xì)胞裂解液上清替代pcv2-nj株，進(jìn)行夾心配對(duì)性實(shí)驗(yàn)，計(jì)算p/n值，其中p是樣品檢測(cè)孔的od450值，n是陰性對(duì)照孔的的od450值，選擇p/n值最高的配對(duì)為最佳的抗體組合。結(jié)果見表4，單克隆抗體1g9’作為包被抗體，1g9’e作為檢測(cè)抗體，效果最好。表4夾心配對(duì)抗體的選擇雜交瘤細(xì)胞株1g9保藏信息如下：分類命名：雜交瘤細(xì)胞株1g9，保藏日期為2016年5月23日，保藏單位全稱為中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，簡(jiǎn)稱cctcc，保藏單位地址：武漢大學(xué)，保藏編號(hào)為：cctccno：c2016105。2.單克隆抗體包被濃度及酶標(biāo)抗體工作濃度的確定采用方陣滴定法來測(cè)定單克隆抗體1g9’的包被濃度和1g9’e的工作濃度。具體方法如下：用包被液(0.05m、ph9.6的碳酸鹽緩沖液)將單克隆抗體1g9’梯度稀釋，在4μg/ml到0.5μg/ml中取4個(gè)濃度，每個(gè)濃度在4℃條件下包被16-18h；采用pbst緩沖液(含0.05％(體積百分濃度)tween20的pbs緩沖液(ph7.4、濃度為10mm))洗滌，拍干；用含1％(質(zhì)量百分濃度)bsa的pbst緩沖液在37℃條件下封閉1h，洗滌，拍干；樣品孔中加入100μl的pcv2-nj株病毒液(獲得p值)，在37℃條件下作用1h時(shí)間，陰性孔中以pk15細(xì)胞裂解液替代pcv2病毒(獲得n值)；采用pbst緩沖液洗滌，拍干；用含1％bsa的pbst緩沖液將濃度為4mg/ml的1g9’e稀釋為2000、1000、500、250ng/ml四個(gè)濃度，向每個(gè)濃度單克隆抗體1g9’的孔中分別加入100μl不同濃度的酶標(biāo)抗體1g9’e，在37℃條件下作用1h；每孔加入辣根過氧化物酶催化底物a液和b液等體積混合溶液(同實(shí)施例五)100μl，37℃顯色15min；最后加入100μl2m的硫酸溶液終止反應(yīng)，在450nm波長(zhǎng)下檢測(cè)od值。選定p/n值最大，陽性孔o(hù)d450值大于1.0所對(duì)應(yīng)的捕獲抗體(即包被抗體)包被濃度和酶標(biāo)抗體的濃度為最佳條件。由表5中數(shù)據(jù)可以看出，單克隆抗體1g9’最佳包被濃度為1μg/ml，酶標(biāo)抗體的最佳作用濃度為500ng/ml。表5包被抗體濃度與酶標(biāo)抗體工作濃度確定3.抗原作用時(shí)間的確定用已知的陰陽性對(duì)照進(jìn)行elisa抗原檢測(cè)，按已經(jīng)確定的程序反應(yīng)，抗原與包被抗體在37℃分別反應(yīng)30min、60min、90min、120min，在其它條件和反應(yīng)程序相同的情況下，進(jìn)行elisa抗原檢測(cè)，取p/n最大、陽性值在2.0左右的作用時(shí)間為最佳反應(yīng)時(shí)間。由表6中數(shù)據(jù)，確定抗原與包被抗體在37℃的最佳作用時(shí)間為60min。表6抗原與包被抗體作用時(shí)間確定抗原作用時(shí)間30min60min90min120minpcv2(p)1.1352.0732.2542.536pk15(n)0.0450.0790.1030.126p/n25.226.221.920.14.酶標(biāo)抗體1g9’e作用時(shí)間的確定按已確定好的反應(yīng)條件，用已知的陰陽性對(duì)照進(jìn)行elisa抗原檢測(cè)，酶標(biāo)抗體1g9’e在37℃時(shí)的反應(yīng)時(shí)間分別為30min、45min、60min、90min。選擇p/n最大時(shí)的反應(yīng)時(shí)間為酶標(biāo)抗體的最佳工作時(shí)間。依據(jù)表7中數(shù)據(jù)，確定酶標(biāo)抗體1g9’e的最佳工作時(shí)間為60min。表7酶標(biāo)抗體1g9’e作用時(shí)間確定作用時(shí)間30min45min60min90minpcv2(p)1.1351.6372.0542.136pk15(n)0.0450.0690.0810.126p/n25.223.725.417.05.顯色時(shí)間的確定按已確定好的反應(yīng)條件，用已知的陰陽性對(duì)照進(jìn)行elisa抗原檢測(cè)，顯色時(shí)間分別為10min、15min、20min。選擇p/n最大時(shí)的時(shí)間為顯色時(shí)間。由表8中數(shù)據(jù)，確定顯色液最佳作用時(shí)間為15min。表8顯色時(shí)間的確定顯色時(shí)間10min15min20minpcv2(p)1.3051.9322.154pk15(n)0.0550.0790.121p/n23.724.517.86.標(biāo)準(zhǔn)曲線線范圍將標(biāo)準(zhǔn)品母液(病毒含量為105.5tcid50/ml的pcv2-nj株病毒培養(yǎng)液，制備方法見實(shí)施例五)進(jìn)行倍比稀釋，使其pcv2含量為100、200、400、800、1600、3200、6400、12800、25600、51200、102400tcid50/ml，按照既定elisa進(jìn)行反應(yīng)，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，選擇r2大于0.99的pcv2含量范圍為標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍。標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)應(yīng)的pcv2含量為200-3200tcid50/ml。見表9及圖5。表9標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍實(shí)例五試劑盒的組裝及使用方法1.本發(fā)明豬圓環(huán)病毒2型抗原定量檢測(cè)試劑盒包括：(1)檢測(cè)板：采用0.05m、ph9.6的碳酸鹽緩沖液稀釋抗pcv2單克隆抗體1g9’(實(shí)施例二中標(biāo)題7方法制備)至1μg/ml，以100μl/孔加入酶標(biāo)板，在4℃條件下包被16-18h，采用洗滌液(同本實(shí)施例標(biāo)題1中(9))洗滌，拍干；用含1％(質(zhì)量百分濃度)bsa的洗滌液(同本實(shí)施例標(biāo)題1中(9))在37℃條件下封閉1h，洗滌、干燥、真空封裝，得到檢測(cè)板；(2)辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗pcv2單克隆抗體1g9’(縮寫為1g9’e)：1g9’e(實(shí)施例三中方法制備)的濃度為500ng/ml。(3)標(biāo)準(zhǔn)品母液：病毒含量為105.5tcid50/ml的pcv2-nj株病毒培養(yǎng)液。pcv2-nj株病毒培養(yǎng)液制備方法：用含有10％(v/v)小牛血清的mem培養(yǎng)基培養(yǎng)pk15細(xì)胞，待細(xì)胞融合度達(dá)到90％時(shí)，接種pcv2-nj株，在37℃培養(yǎng)72小時(shí)，將病毒培養(yǎng)物反復(fù)凍融3次，4℃、12000r/min離心20min，去除細(xì)胞碎片，取上清液作為pcv2-nj株病毒培養(yǎng)液。(4)陰性對(duì)照：pk15細(xì)胞裂解液。用含有10％(v/v)小牛血清的mem培養(yǎng)基培養(yǎng)pk15細(xì)胞，待細(xì)胞融合度達(dá)到90％時(shí)，將細(xì)胞培養(yǎng)液置于-20℃和室溫條件下反復(fù)凍融3次，隨后收集凍融液體，12000g/min離心10min，取上清作為pk15細(xì)胞裂解液。(5)樣本稀釋液：mem培養(yǎng)基(購自gibco)。(6)辣根過氧化物酶催化底物a液：體積濃度為3％的h2o2水溶液。(7)辣根過氧化物酶催化底物b液：將1ml濃度為10mg/ml的3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺(tmb)溶液加入到100ml濃度為0.1mol/l、ph為6.0的磷酸緩沖液中配成。濃度為0.1mol/l、ph為6.0的磷酸緩沖液的配制方法：0.1mol/l磷酸二氫鈉水溶液87.7ml和0.1mol/l磷酸氫二鈉水溶液12.3ml混合即成。(8)終止液：2m的硫酸水溶液。(9)洗滌液：ph7.4、10mm的pbs緩沖液中添加有終濃度為0.05％(體積百分濃度)的tween20。ph7.4、10mm的pbs緩沖液配方：nacl8g、kcl0.2g、kh2po40.27g、na2hpo4·12h2o3.54g溶于水，然后定容至1l。2.本發(fā)明豬圓環(huán)病毒2型抗原定量檢測(cè)試劑盒的使用方法：(1)加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本：將標(biāo)準(zhǔn)品母液采用樣本稀釋液稀釋至標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍。將樣品采用樣本稀釋液稀釋適當(dāng)?shù)谋稊?shù)。以100μl/孔向檢測(cè)板中加入標(biāo)準(zhǔn)品母液或樣品的稀釋液，37℃恒溫箱中孵育1h；陰性對(duì)照孔中加入陰性對(duì)照(pk15細(xì)胞裂解液)。用洗滌液洗滌酶標(biāo)板3次。(2)加入1g9’e：以100μl/孔向酶標(biāo)板中加入1g9’e，37℃孵育1h；用洗滌液洗滌酶標(biāo)板3次。(3)顯色：將辣根過氧化物酶催化底物液a液和底物液b液等體積混合，以100μl/孔加入酶標(biāo)板中，37℃避光顯色10-15min；以100μl/孔加入終止液。(4)測(cè)定：酶標(biāo)板輕輕振蕩混勻后立即讀數(shù)，在波長(zhǎng)450nm下測(cè)定每孔吸光值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品中pcv2抗原的濃度。實(shí)施例六本發(fā)明試劑盒的靈敏度、特異性、廣譜性及重復(fù)性考察實(shí)施例五制備的試劑盒(本發(fā)明試劑盒)的靈敏度、特異性、廣譜性及重復(fù)性。1.試劑盒靈敏度將標(biāo)準(zhǔn)品母液采用樣本稀釋液倍比稀釋為100、200、400、800、1600、3200、6400、12800tcid50/ml，陰性對(duì)照孔中加入陰性對(duì)照(pk15細(xì)胞裂解液)，采用實(shí)施例五中方法進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)樣品孔(標(biāo)準(zhǔn)品母液稀釋液)和陰性對(duì)照孔在450nm波長(zhǎng)處的吸光值。將p/n>2.1時(shí)的最低pcv2含量定為試劑盒靈敏度。結(jié)果顯示試劑盒的靈敏度為200tcid50/ml，見表10。表10試劑盒靈敏度2.試劑盒特異性采用實(shí)施例五中試劑盒及檢測(cè)方法，對(duì)豬瘟病毒(csfv)、豬藍(lán)耳病毒(prrsv)、豬細(xì)小病毒(ppv)、豬偽狂犬病毒(prv)、豬口蹄疫病毒(fmdv)、豬腹瀉病毒(pedv)、豬乙腦病毒(jev)的細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)p/n值是否大于2.1，來判斷試劑盒與樣本是否有交叉。從圖6可見，除pcv2外的其他豬病病毒與本發(fā)明試劑盒無交叉反應(yīng)，說明本發(fā)明試劑盒具有很好的特異性。3.本發(fā)明試劑盒對(duì)pcv2不同基因亞型的廣譜性檢測(cè)考察實(shí)施例五中試劑盒(標(biāo)記為試劑盒甲)和商品化試劑盒pcv2agcapture(購自synbiotics，標(biāo)記為試劑盒乙)對(duì)6種不同pcv2毒株的廣譜性。除pcv2-nj株外，其余病毒通過對(duì)市售疫苗破乳后得到。表11為本發(fā)明試劑盒對(duì)6種不同毒株檢測(cè)獲得的od450值，結(jié)果顯示：本發(fā)明試劑盒能對(duì)6種pcv2毒株進(jìn)行檢測(cè)，具有較好的廣譜性。表11本發(fā)明試劑盒對(duì)6種毒株的檢測(cè)結(jié)果4.試劑盒批間重復(fù)性按照腹水制備→抗體純化→單克隆抗體的辣根過氧化物酶標(biāo)記→試劑盒制造的順序獨(dú)立生產(chǎn)三批次試劑盒，并進(jìn)行批間差異測(cè)定。采用三批次試劑盒同時(shí)檢測(cè)不同病毒含量的pcv2病毒液(6400tcid50/ml、3200tcid50/ml、1600tcid50/ml、800tcid50/ml、400tcid50/ml、0tcid50/ml)，比較三批次試劑盒的差異。從表12可見，本發(fā)明試劑盒的批間差異不超過4.04％，說明本發(fā)明試劑盒重復(fù)性非常好。表12試劑盒批間重復(fù)性(od450值)5.本發(fā)明試劑盒與ifa方法(免疫熒光法)的相關(guān)性為了驗(yàn)證本發(fā)明試劑盒與ifa方法檢測(cè)結(jié)果的一致性，選取了10份pcv2病毒液同時(shí)采用ifa方法和本發(fā)明試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，并計(jì)算兩種方法檢測(cè)結(jié)果的變異系數(shù)cv。結(jié)果見表13，可以看到兩種方法對(duì)同一份樣本檢測(cè)結(jié)果差異不超過8.13％，說明本發(fā)明試劑盒的檢測(cè)值與ifa的檢測(cè)值無明顯差異。表13本發(fā)明試劑盒與ifa方法檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)性6.本發(fā)明試劑盒在檢測(cè)pcv2亞單位疫苗抗原中的應(yīng)用采用本發(fā)明試劑盒及其使用方法，分別對(duì)大腸桿菌以及桿狀病毒表達(dá)的pcv2cap組裝而成的病毒樣粒子(制備方法見：1、趙曉云,喬緒穩(wěn),陳瑾,李鵬成,于曉明,朱國(guó)強(qiáng),鄭其升,侯繼波.利用e.coli表達(dá)豬圓環(huán)病毒2型cap蛋白生產(chǎn)病毒樣顆粒疫苗[j].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),2015,(05):976-986；2、表達(dá)2型豬圓環(huán)病毒核衣殼蛋白cap基因的重組病毒樣粒子，專利號(hào)cn200810024644.9)進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)照樣本為大腸桿菌空菌破碎液和桿狀病毒破碎液。檢測(cè)結(jié)果見圖7。從圖7可見本發(fā)明試劑盒與大腸桿菌以及桿狀病毒表達(dá)的pcv2cap組裝而成的病毒樣粒子反應(yīng)性能好，而與相應(yīng)宿主細(xì)胞不反應(yīng)，因此可以用于檢測(cè)pcv2亞單位疫苗抗原。當(dāng)前第1頁12