本發(fā)明涉及醫(yī)療檢測領(lǐng)域，尤其涉及一種定量檢測化合物的測試條及側(cè)向免疫層析的檢測方法。
背景技術(shù)：
：現(xiàn)有的側(cè)向免疫熒光層析的方法來檢測抗原或抗體，基本原理有兩種：一種是雙抗體(或雙抗原)夾心法，將針對被檢抗原(大分子)單抗劃在t線位置，將另一個單抗偶聯(lián)eu微球，放在標記物墊上，c線劃羊抗鼠的抗體。當含有被檢抗原的樣本加到樣品墊上，被檢抗原和標記墊中的標記抗體結(jié)合，層析到t線與這里的抗體形成抗體-抗原-標記抗體的復(fù)合物，停留在t線位置。如果樣本中被檢抗原的含量愈高，在t線除形成的復(fù)合物愈多，經(jīng)過激發(fā)后產(chǎn)生的熒光強度愈高，利用濃度和熒光強度的正相關(guān)可以定量計算除被檢抗原的濃度。另一種是競爭法：具體的方法是將小分子的化合物，利用其表面的化學(xué)基團，通過化學(xué)偶聯(lián)，連接到分子量大的蛋白分子上，如bsa,klh等，形成小分子-載體蛋白的復(fù)合物，保留小分子的抗原性，同時提高抗原的免疫原性。將這樣進行改造后的小分子-載體蛋白復(fù)合物直接包被在nc膜的t線(檢測線)位置，將羊抗鼠igg抗體包被在c線(控制線)的位置，作為對照，將單抗標記好熒光微球涂在標記物墊上。檢測樣品從樣品墊加入，當樣品中的不含有被檢測的小分子，它就將標記物墊上的標記抗體洗出，到t線位置和這里的抗原結(jié)合，從而形成抗原-抗體的復(fù)合物，在激發(fā)光的作用下發(fā)出高強度的熒光，多余的抗體被c線的抗體結(jié)合。反之，如果樣本中含有被檢測的小分子，它直接和標記物墊中的標記抗體結(jié)合，形成了抗原-抗體復(fù)合物，使標記物墊中的標記抗體和t線的抗原結(jié)合減少，如果樣本中的被檢測的小分子的含量越高，t線的抗原結(jié)合到的標記抗體越少，激發(fā)后產(chǎn)生的熒光強度越低。這樣形成一個樣本中被檢測物濃度越高，檢測熒光結(jié)果越低的負相關(guān)結(jié)果，或與熒光檢測結(jié)果的倒數(shù)呈正相關(guān)的結(jié)果。無論以上任何模式是在nc膜是有二條線，分別是用于檢測的t線，用于判斷實驗是否成立的c線。例如中國專利申請?zhí)枮榈赾n201310391061.0號專利揭露的檢測方法，這種方法對于傳統(tǒng)的免疫檢測是合適的，但是在實際的檢測過程中發(fā)現(xiàn)，這樣的檢測方式最大的問題是產(chǎn)品的批內(nèi)差異比較大，基本在15％左右，最好的在10％左右，其檢測的精度性未達到最大。因此，有必要提出新的一種定量檢測化合物的測試條及側(cè)向免疫層析的檢測方法來解決上述問題。技術(shù)實現(xiàn)要素：針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述問題，本發(fā)明的目的在于提供一種提高批內(nèi)差異性控制性能的定量檢測化合物的測試條及側(cè)向免疫層析的檢測方法。為實現(xiàn)上述上述目的，本發(fā)明提供一種定量檢測化合物的測試條，其包括一層nc膜、位于所述nc膜前端上的一層樣品墊、位于所述樣品墊內(nèi)側(cè)的一層標記物墊、位于所述標記物墊后方的檢測區(qū)及與位于所述檢測區(qū)后方第一控制區(qū)，位于所述第一控制區(qū)后方還設(shè)置有第二控制區(qū)，所述標記物墊含有待檢測化合物的單克隆抗體偶聯(lián)上eu微球以及偶聯(lián)上eu微球的第一種抗體，所述檢測區(qū)含有第二種抗體或待檢測化合物的抗原，所述第一控制區(qū)含有第三種抗體，所述第二控制區(qū)含有與所述檢測化合物、第二種抗體、第三種抗體不相互反應(yīng)的第四種抗體，所述第四種抗體只與所述第一種抗體相互反應(yīng)。具體的，所述第一種抗體為兔抗體igg或馬抗體igg，或豚鼠抗體igg中的任意一種，所述第二種抗體為小鼠單抗，所述第三種抗體為羊抗鼠的抗體，所述第四種為選取羊抗兔的抗體，或羊抗馬抗體，或羊抗豚鼠抗體中與第一抗體相對應(yīng)的一種。一種側(cè)向免疫層析的檢測方法，將待檢測化合物加測試片的樣品墊；在激發(fā)光的作用下，對所述第一控制區(qū)產(chǎn)生的抗體復(fù)合物被激發(fā)產(chǎn)生熒光，并通過熒光讀數(shù)儀分別讀出檢測區(qū)、第一控制區(qū)、第二控制區(qū)的熒光數(shù)值；將所述檢測區(qū)、第一控制區(qū)(可選，可不選)、第二控制區(qū)的熒光數(shù)值納入擬合的方程中計算出待檢測化合物的量。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明定量檢測化合物的測試條及檢測方法的有益效果在于：本發(fā)明定量檢測化合物的測試條是增加第二控制區(qū)，即采用三個區(qū)域模式，第二控制區(qū)域采用的抗體不與與待檢測物、第一控制區(qū)域的抗體不反應(yīng)，而與檢測區(qū)的抗體反應(yīng)，且標記物墊上設(shè)置兩種不同的抗體，其中測試區(qū)域的熒光讀數(shù)值參與檢測和計算，第一控制區(qū)的熒光讀數(shù)值作為判斷實驗是否成立，同時可以參與(或不參與)檢測和結(jié)果計算。第二控制區(qū)的熒光讀數(shù)值作為內(nèi)標控制產(chǎn)品之間的差異性參與結(jié)果的計算。通過第二控制區(qū)的讀數(shù)值的計算，使得待檢測產(chǎn)品的批內(nèi)差異性控制在5％左右，相比現(xiàn)有技術(shù)，從而提高檢測精度。附圖說明圖1為定量檢測化合物的測試條的結(jié)構(gòu)示意圖。圖2為本發(fā)明定量檢測化合物方法通過雙抗體夾心法原理檢測的三次多項式作為擬合的方程的曲線圖。圖3為本發(fā)明定量檢測化合物方法通過競爭法原理檢測的三次多項式作為擬合的方程的曲線圖。具體實施方式下面將對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅是本發(fā)明的一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其它實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。本發(fā)明提供一種定量檢測化合物的測試條，其包括一層nc膜、位于所述nc膜前端上的一層樣品墊、位于所述樣品墊內(nèi)側(cè)的一層標記物墊、位于所述標記物墊后方的檢測區(qū)及與位于所述檢測區(qū)后方第一控制區(qū)，位于所述第一控制區(qū)后方還設(shè)置有第二控制區(qū)，所述標記物墊含有待檢測化合物的單克隆抗體偶聯(lián)上eu微球以及偶聯(lián)上eu微球的第一種抗體，所述檢測區(qū)含有第二種抗體或待檢測化合物的抗原，所述第一控制區(qū)含有第三種抗體，所述第二控制區(qū)含有與所述檢測化合物、第二種抗體、第三種抗體不相互反應(yīng)的第四種抗體，所述第四種抗體與所述第一種抗體相互反應(yīng)。所述第一種抗體為兔抗體igg或馬抗體igg，或豚鼠抗體igg中的任意一種，所述第二種抗體為小鼠單抗，所述第三種抗體為羊抗鼠的抗體，所述第四種為選取羊抗兔的抗體，或羊抗馬抗體，或羊抗豚鼠抗體中與第一抗體相對應(yīng)/反應(yīng)的一種。如圖1，本發(fā)明定量檢測化合物的測試條包括一pvc板1，在pvc板1上鋪設(shè)有一層nc膜2，nc膜2完全覆蓋pvc板1。在nc膜2前端上鋪設(shè)有一層樣品墊3，在樣品墊3內(nèi)側(cè)放置有一層標記物墊4。在標記物墊4內(nèi)側(cè)，露出nc膜2處設(shè)置有檢測區(qū)5(或者檢測線)、位于檢測區(qū)5后方第一控制區(qū)6與第二控制區(qū)7，在nc膜5后端設(shè)置有吸水紙8。實施例一：通過雙抗體(或雙抗原)夾心法原理檢測：配制500μl的不同濃度的crp的bsa溶液，通過不同濃度的待檢測物質(zhì)進行試驗，具體數(shù)據(jù)見下表。提供抗crp的單克隆抗體偶聯(lián)上eu微球以及偶聯(lián)上eu微球的兔抗體igg，均勻地涂在測試條的標記物墊4上。本實施例中，大分子的分子量一般大于10000，或者10000左右。在nc膜的檢測區(qū)5處，將抗crp的單克隆抗體用包被稀釋液稀釋到0.5-3mg/ml濃度，同時將0.5-2mg/ml濃度的羊抗鼠的抗體涂抹在nc膜的第一控制區(qū)。同時將0.2-1mg/ml的羊抗兔的抗體涂抹在nc膜的第二控制區(qū)。將含不同濃度的crp的bsa溶液樣本加入樣本墊3上，經(jīng)過5-15分鐘的層析，將測試條放入專門的熒光讀數(shù)儀中檢測結(jié)果。根據(jù)實際的情況采用t/c1/c2值，或用t/c2的值用于定量計算。參考結(jié)果如下：如圖2所示，這里選擇t/c2的值用于定量計算，以濃度為橫坐標，以t/c2值為縱坐標，選擇合適的擬合曲線，這里選擇三次的多項式作為擬合的方程，y＝2e-14x3-4e-09x2+0.000x+0.057，其相關(guān)性達到0.9997，可以用作定量計算。如下表，通過同一批次的樣品重復(fù)上述步驟多次檢測，并將擬合的方程測量出每次檢測出待檢測物質(zhì)的濃度，檢測樣本1(含crp的bsa溶液)的結(jié)果(重復(fù)10次)，計算出同一批次內(nèi)差異率值：通過測算，同一批次檢測樣本的濃度值的同一批次內(nèi)差異率為2.32％。如果按照傳統(tǒng)的方法檢測，針對這同一批次的檢測數(shù)據(jù)，(t線熒光讀數(shù)值，c1線熒光讀數(shù)值相同)：但測試后，測算出的濃度不同，通過測試，同一批次檢測樣本的濃度值的同一批次內(nèi)差異率值為12.98％。因此，通過兩種不同方式的檢測結(jié)果比較，發(fā)現(xiàn)采用本發(fā)明的檢測方法，其測出的數(shù)值相比傳統(tǒng)的方法更加金精準。實施例二：通過競爭法原理檢測：具體試驗步驟：本實施例中的小分子被檢測物的分子量為小于10000。將偶聯(lián)bsa的將小分子抗原氯胺酮用包被稀釋液稀釋到0.5-3mg/ml，在nc膜的線檢測區(qū)5劃膜，將0.5-2mg/ml的羊抗鼠的抗體在nc膜的第一控制區(qū)6劃膜，將0.5-1mg/ml的羊抗兔的抗體在nc膜的第二控制區(qū)7劃膜。將抗氯胺酮的單克隆抗體偶聯(lián)上eu微球以及偶聯(lián)上eu微球的兔抗體igg，均勻地涂在標記物墊上。如下表，當含被檢測的不同濃度的氯胺酮的樣本加入樣本墊，經(jīng)過5-15分鐘的層析，將檢測條放入專門的熒光讀數(shù)儀中檢測結(jié)果，采用c2/t值用于定量計算。參考結(jié)果如下：如圖3所示，以濃度為橫坐標，以c2/t值為縱坐標，選擇合適的擬合曲線，這里選擇三次的多項式作為擬合的方程，y＝5e-14x3-7e-09x2+0.000x+0.263，其相關(guān)性達到0.9998，可以用作定量計算。如下表，通過同一批次的樣品重復(fù)上述步驟多次檢測，并將擬合的方程測量出氯胺酮的濃度，檢測樣本2(含氯胺酮溶液)的結(jié)果(重復(fù)10次)，計算出同一批次內(nèi)差異率值：同一批次檢測樣本的濃度值的同一批次內(nèi)差異率值為5.43％如果按照傳統(tǒng)的方法檢測，針對這同一批次的檢測數(shù)據(jù)，(t線熒光讀數(shù)值，c1線熒光讀數(shù)值相同)：t線熒光讀數(shù)值t線熒光讀數(shù)值的倒數(shù)*100000測算的濃度(ng/ml)532318.78742.1992523519.10764.4019501219.95824.2233556717.96684.3717612316.33570.0852484620.63872.3995512319.52793.7836582417.17628.7886505119.80813.3729491220.36852.8475同一批次檢測樣本的濃度值的同一批次內(nèi)差異率值為13.13％。因此，通過兩種不同方式的檢測結(jié)果比較，發(fā)現(xiàn)采用本發(fā)明的檢測方法，其測出的數(shù)值相比傳統(tǒng)的方法更加精準。本發(fā)明的測試條上設(shè)置了檢測區(qū)、第一控制區(qū)、第二控制區(qū)，與現(xiàn)有技術(shù)的主要的區(qū)別特征在于：本發(fā)明的第二控制區(qū)上的物質(zhì)不參與和待檢測物、檢測區(qū)、第一控制區(qū)的物質(zhì)相互反應(yīng)。例如：檢測區(qū)是用的小鼠的單抗，第一控制區(qū)用的是羊抗鼠的抗體，第二控制區(qū)的物質(zhì)選擇羊抗兔的抗體、羊抗馬抗體或羊抗豚鼠抗體等，但第二控制區(qū)上不能選擇與和待檢測物、檢測區(qū)的抗體、第一控制區(qū)的抗體相互作用反應(yīng)的物質(zhì)；如不能選擇羊抗鼠的抗體，或兔抗鼠的抗體，或兔抗羊的抗體。而第二控制區(qū)的抗體與偶聯(lián)eu微球的第一抗體相互反應(yīng)。第二控制區(qū)的物質(zhì)主要目的在于：第二控制區(qū)熒光讀數(shù)值與檢測區(qū)熒光讀數(shù)值相比較，將比較值納入計算方程式中。其原因為：理論上，同一片nc膜對檢測待檢測物含量多少的影響是相同的；但實際上，因為nc膜生產(chǎn)工藝的原因或測試環(huán)境的原因，在測試過程中，nc膜會對同一物質(zhì)不同批次的檢測帶來影響，為了克服nc膜對測試數(shù)據(jù)的影響，因此，將第二控制區(qū)熒光讀數(shù)值與檢測區(qū)熒光讀數(shù)值相比較，將比較值納入計算方程式中從而能減小nc膜對檢測的影響。所以，本發(fā)明定量檢測化合物的測試條是增加第二控制區(qū)，即采用三個區(qū)域模式，第二控制區(qū)域采用的抗體不與與待檢測物、第一控制區(qū)域的抗體不反應(yīng)，而與檢測區(qū)的抗體反應(yīng)，且標記物墊上設(shè)置兩種不同的抗體，其中測試區(qū)域的熒光讀數(shù)值參與檢測和計算，第一控制區(qū)的熒光讀數(shù)值作為判斷實驗是否成立，同時可以參與(或不參與)檢測和結(jié)果計算。第二控制區(qū)的熒光讀數(shù)值作為內(nèi)標控制產(chǎn)品之間的差異性參與結(jié)果的計算。通過第二控制區(qū)的讀數(shù)值的計算，使得待檢測產(chǎn)品的批內(nèi)差異性控制在5％左右，相比現(xiàn)有技術(shù)，從而提高檢測精度。以上僅為本發(fā)明的實施例，并非因此限制本發(fā)明的專利范圍，凡是利用本發(fā)明說明書內(nèi)容知直接或間接運用在其它相關(guān)的
技術(shù)領(lǐng)域：
，均包括在本發(fā)明的專利保護范圍內(nèi)。當前第1頁12