本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，特別是一種度骨化醇注射液中含量的計(jì)算方法。
背景技術(shù)：
度骨化醇注射液，商品名：hectorol，通用名：doxercalciferol，分子式：c28h44o2，分子量：412.65，其結(jié)構(gòu)式為：
度骨化醇注射液由美國genzymecorp(sanofi)在2000年首次上市銷售，適應(yīng)癥為“治療繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進(jìn)癥”。目前，國內(nèi)治療慢性腎病導(dǎo)致繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進(jìn)癥的主流產(chǎn)品為阿法骨化醇和骨化三醇，已經(jīng)上市有一段時(shí)間。近年來，很多臨床研究發(fā)現(xiàn)度骨化醇在該適應(yīng)癥上更安全有效。度骨化醇在國外上市十幾年，目前已被患者廣泛接受。
度骨化醇目前國內(nèi)還未上市，屬于3.1類新藥，沒有公開的文獻(xiàn)和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)可供參考。在配制度骨化醇注射液時(shí)，出現(xiàn)度骨化醇前體，在主峰前出峰，原料藥中基本不存在，但是配成藥液或原料藥配成供試品檢測時(shí)，此前體就會(huì)出現(xiàn)，并且隨著放置時(shí)間延長而增大，待峰面積增大到25000左右，不再增長，后續(xù)基本維持在此水平不變。度骨化醇前體和度骨化醇的結(jié)構(gòu)區(qū)別只是連接環(huán)己烷的2個(gè)雙鍵的位置發(fā)生位移，度骨化醇屬于維生素d衍生物，此類化合物一般都是主體和前體共存的狀態(tài)。前體結(jié)構(gòu)如下：
在計(jì)算度骨化醇注射液含量時(shí)，采用外標(biāo)法，分別進(jìn)樣度骨化醇標(biāo)準(zhǔn)品和度骨化醇注射液供試品，通過兩者的進(jìn)樣液濃度和峰面積，標(biāo)準(zhǔn)品的含量來計(jì)算出度骨化醇注射液的含量值，度骨化醇前體和度骨化醇進(jìn)入人體后作用機(jī)制一致，且藥效相當(dāng)，因此應(yīng)將度骨化醇前體定入注射液的含量中。但是基于度骨化醇標(biāo)準(zhǔn)品配成標(biāo)準(zhǔn)品溶液和度骨化醇注射液中均產(chǎn)生前體，且產(chǎn)生前體百分含量并不同步，因此不能用傳統(tǒng)的外標(biāo)法來計(jì)算注射液中的度骨化醇含量。但是度骨化醇注射液含量是必須控制的關(guān)鍵項(xiàng)目，直接決定藥液質(zhì)量的檢測項(xiàng)，必須對其尋找出合適且合理的含量計(jì)算方法。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
提供了一種度骨化醇注射液中含量的計(jì)算方法。通過對度骨化醇原料藥水溶液進(jìn)行破壞，使其盡量轉(zhuǎn)變?yōu)榍绑w，在轉(zhuǎn)變?yōu)榍绑w的過程中，同時(shí)會(huì)有一部分原料轉(zhuǎn)變?yōu)?,6-反式度骨化醇，通過5,6-反式度骨化醇標(biāo)準(zhǔn)品含量和峰面積計(jì)算出5,6-反式度骨化醇的響應(yīng)因子，計(jì)算出破壞試驗(yàn)中度骨化醇轉(zhuǎn)化為5,6-反式度骨化醇的量，因此可以算出度骨化醇轉(zhuǎn)化為前體的量，結(jié)合前體的峰面積，得出前體的響應(yīng)因子。根據(jù)現(xiàn)配現(xiàn)測的度骨化醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液，waters液相該色譜條件下，度骨化醇峰面積一般在55～60萬，這時(shí)前體含量非常低，峰面積在600以下基本可以忽略不計(jì)，計(jì)算出度骨化醇的響應(yīng)因子，從而可以確定前體的響應(yīng)因子，可知度骨化醇前體折算為度骨化醇的校正因子，這樣在后續(xù)測試度骨化醇注射液含量時(shí)可以直接以此系數(shù)代入公式進(jìn)行計(jì)算，最終得到度骨化醇注射液中的度骨化醇的有效濃度和度骨化醇注射液的有效含量。
本發(fā)明的目的可以通過以下措施達(dá)到：
一種度骨化醇注射液中含量的計(jì)算方法，其包括如下步驟：
(a)取度骨化醇標(biāo)準(zhǔn)品和5,6-反式度骨化醇標(biāo)準(zhǔn)品，分別在溶劑中溶解成度骨化醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液和5,6-反式度骨化醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液并稀釋后，采用高效液相色譜法分別測定度骨化醇峰面積和5,6-反式度骨化醇峰面積，并計(jì)算度骨化醇度骨化醇的響應(yīng)因子(f度)和5,6-反式度骨化醇的響應(yīng)因子(f反)；
(b)取度骨化醇標(biāo)準(zhǔn)品，在溶劑中溶解成度骨化醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液后，加入氧氫化鈉，于70～85℃下進(jìn)行破壞反應(yīng)，反應(yīng)后將反應(yīng)液稀釋，采用高效液相色譜法分別測定反應(yīng)液中度骨化醇、度骨化醇前體和5,6-反式度骨化醇峰面積，分別計(jì)算度骨化醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液破壞前的度骨化醇濃度(c度前)、度骨化醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液破壞后余留的度骨化醇濃度(c度后)、度骨化醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液破壞后生成的5,6-反式度骨化醇濃度(c反后)，并計(jì)算度骨化醇前體的響應(yīng)因子(f前)和度骨化醇前體折算為度骨化醇的校正因子(f校)；
(c)將度骨化醇注射液和稀釋后的度骨化醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液采用高效液相色譜法，分別測定度骨化醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液中度骨化醇和度骨化醇前體的峰面積以及度骨化醇注射液中度骨化醇和度骨化醇前體的峰面積，由此計(jì)算度骨化醇注射液中的度骨化醇的有效濃度(c注效)和度骨化醇注射液的有效含量(％注含)。
5,6-反式度骨化醇的結(jié)構(gòu)如下：
從度骨化醇、度骨化醇前體和5,6-反式度骨化醇的結(jié)構(gòu)可見，1個(gè)度骨化醇分子可以轉(zhuǎn)變?yōu)?個(gè)分子的度骨化醇前體或1個(gè)分子的5,6-反式度骨化醇，據(jù)此可知度骨化醇轉(zhuǎn)變?yōu)槎裙腔己?,6-反式度骨化醇的濃度均為1.0。
本方法中步驟(a)、(b)或(c)中均采用高效液相色譜法，其色譜條件可采用現(xiàn)有的測定度骨化醇的條件。一種更優(yōu)的靈敏度和準(zhǔn)確度更好的液相色譜條件為：儀器：waters；色譜柱：kinetexc18；檢測波長：275nm；流速：1.2ml/min；柱溫：30～35℃；運(yùn)行時(shí)間：55min；流動(dòng)相a：乙腈或甲醇，流動(dòng)相b：水；洗脫梯度：0～10min：a(75％)：b(25％)；10～30min：a(85％)：b(15％)；30～45min：a(0％)：b(100％)；45～55min：a(75％)：b(25％)。
步驟(a)中，一種優(yōu)選的方案為：取度骨化醇標(biāo)準(zhǔn)品和5,6-反式度骨化醇標(biāo)準(zhǔn)品分別于容量瓶中，加入溶液超聲溶解，室溫定容分別得到度骨化醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液和5,6-反式度骨化醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液；再分別稀釋得到1.9～2.1ug/ml的溶液，取樣采用高效液相色譜法分別測定度骨化醇峰面積和5,6-反式度骨化醇峰面積。
步驟(b)中，一種優(yōu)選的方案為：取度骨化醇于容量瓶中，加入溶液超聲溶解得到度骨化醇溶液，按每ml度骨化醇溶液0.01～0.016ml的加入量加入質(zhì)量含量為0.05～0.20％氫氧化鈉水溶液，室溫后定容，于70～85℃下進(jìn)行破壞反應(yīng)2～4h；反應(yīng)后將反應(yīng)液取樣稀釋得到1.9～2.1ug/ml破壞后的度骨化醇溶液，取樣采用高效液相色譜法分別測定反應(yīng)液中度骨化醇、度骨化醇前體和5,6-反式度骨化醇峰面積；所述氫氧化鈉水溶液的質(zhì)量含量優(yōu)選為0.10～0.15％；所述破壞反應(yīng)的溫度優(yōu)選為75～80℃，時(shí)間優(yōu)選為2.5～3h。
本發(fā)明中所采用的度骨化醇標(biāo)準(zhǔn)品或5,6-反式度骨化醇標(biāo)準(zhǔn)品為為法定標(biāo)準(zhǔn)品、商業(yè)標(biāo)準(zhǔn)品、工作標(biāo)準(zhǔn)品或雜質(zhì)較少的原料。
度骨化醇標(biāo)準(zhǔn)品或5,6-反式度骨化醇標(biāo)準(zhǔn)品可以分別在0～5℃下用超聲溶解。
本發(fā)明中溶解度骨化醇標(biāo)準(zhǔn)品、5,6-反式度骨化醇標(biāo)準(zhǔn)品的溶液選自甲醇、乙腈或兩者混合溶劑，或者前述溶劑與水以任何比例混合的混合溶劑；所述度骨化醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液為現(xiàn)測現(xiàn)配的溶液。
以下提供一種更具體的度骨化醇注射液中含量的計(jì)算方法，步驟如下：
(1)度骨化醇注射液含量采用waters液相通過外標(biāo)法計(jì)算，色譜條件：kinetexc18；檢測波長：275nm；流速：1.2ml/min；柱溫：30～35℃；進(jìn)樣量：50μl；運(yùn)行時(shí)間：55min。流動(dòng)相a：乙腈或甲醇，流動(dòng)相b：水；洗脫梯度：0～10min：a(75％)：b(25％)；10～30min：a(85％)：b(15％)；30～45min：a(0％)：b(100％)；45～55min：a(75％)：b(25％)。
(2)度骨化醇響應(yīng)因子計(jì)算：稱取一定量的度骨化醇標(biāo)準(zhǔn)品于棕色容量瓶中，加入80％體積的溶劑，冰水浴0℃超聲10min，放至室溫后再用溶液定容得到約100ug/ml度骨標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液。再取該儲(chǔ)備液2.0ml放于100ml棕色容量瓶中，再用溶液稀釋定容至刻度，即得到約2ug/ml的度骨化醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液，取此溶液50μl注入液相色譜儀中，測定度骨化醇標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積：
f度＝c度/a度；
f度：度骨化醇的響應(yīng)因子；
c度：度骨化醇的濃度；
a度：度骨化醇的峰面積。
(3)5,6-反式度骨化醇響應(yīng)因子計(jì)算：稱取一定量的5,6-反式度骨化醇標(biāo)準(zhǔn)品于棕色容量瓶中，加入80％體積的溶劑，冰水浴0℃超聲10min，放至室溫后再用溶液定容得到約100ug/ml5,6-反式度骨標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液。再取該儲(chǔ)備液2.0ml于100ml棕色容量瓶中，再用溶液稀釋定容至刻度，即得到約2ug/ml的5,6-反式度骨化醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液，取此溶液50μl注入液相色譜儀中，測定5,6-反式度骨化醇標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積：
f反＝c反/a反；
f反：5,6-反式度骨化醇的響應(yīng)因子；
c反：5,6-反式度骨化醇的濃度；
a反：5,6-反式度骨化醇的峰面積。
(4)破壞試驗(yàn)：取一定量的度骨化醇標(biāo)準(zhǔn)品于棕色容量瓶中，加入80％體積的溶劑，冰水浴約超聲10min，加入0.05～0.20％氫氧化鈉水溶液，加入量為每ml度骨化醇溶液加入0.01～0.016ml，放至室溫后再用溶液定容，得到約100ug/ml標(biāo)準(zhǔn)品溶液，將此液體放在70～85℃條件下破壞2～4h。再取該破壞溶液2.0ml放于100ml棕色容量瓶中，再用溶液稀釋定容至刻度，即得到約2ug/ml破壞后的度骨化醇溶液，取此溶液50μl注入液相色譜儀中，測定度骨化醇、度骨化醇前體和5,6-反式度骨化醇的峰面積：
c度前＝m稱*％標(biāo)含/v；
c度后＝f度*a度后；
c反后＝f反*a反后；
f前＝(c度前-c度后-c反后)/a前；
f校＝f前/f度；
c度前：度骨化醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液破壞前的度骨化醇濃度；
m稱：度骨化醇標(biāo)準(zhǔn)品的稱樣量；
％標(biāo)含：度骨化醇標(biāo)準(zhǔn)品的含量；
v：度骨化醇標(biāo)準(zhǔn)品的配液體積；
c度后：度骨化醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液破壞后余留的度骨化醇濃度；
a度后：度骨化醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液破壞后余留的度骨化醇峰面積；
c反后：度骨化醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液破壞后生成的5,6-反式度骨化醇濃度；
a反后：度骨化醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液破壞后生成的5,6-反式度骨化醇峰面積；
f前：度骨化醇前體的響應(yīng)因子；
a前：度骨化醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液破壞后生成的度骨化醇前體的峰面積；
f校：度骨化醇前體折算為度骨化醇的校正因子。
(5)度骨化醇注射液中含量的計(jì)算方法：取配制的度骨化醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液50μl和按照處方配制的度骨化醇注射液50μl分別注入液相色譜儀中，測定標(biāo)準(zhǔn)品溶液中度骨化醇和度骨化醇前體的峰面積，注射液中度骨化醇和度骨化醇前體的峰面積，按照下面公式計(jì)算注射液中度骨化醇的含量：
c注效＝c標(biāo)效*(a度注+f校*a前注)/(a度標(biāo)+f校*a前標(biāo))；
％注含＝c注效/c樣稱*％樣含；
c注效：度骨化醇注射液中的度骨化醇的有效濃度；
m標(biāo)效：度骨化醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液中度骨化醇的有效質(zhì)量；
a度注：度骨化醇注射液中度骨化醇的峰面積；
a前注：度骨化醇注射液中度骨化醇前體的峰面積；
a度標(biāo)：度骨化醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液中度骨化醇的峰面積；
a前標(biāo)：度骨化醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液中度骨化醇前體的峰面積；
c樣稱：配制度骨化醇注射液時(shí)稱取量折算的的度骨化醇濃度；
％樣含：配制注射液的度骨化醇原料藥含量；
％注含：度骨化醇注射液的含量。
在步驟(1)中，因現(xiàn)在沒有相關(guān)的文件和資料可查詢到度骨化醇的含量檢測方法，通過大量的試驗(yàn)摸索出得出可行的用來測試度骨化醇含量的高效液相方法。后續(xù)的度骨化醇、度骨化醇前體和5,6-反式度骨化醇的響應(yīng)因子均基于此色譜條件基礎(chǔ)上計(jì)算出來。
在步驟(2)中通過測試度骨化醇的標(biāo)準(zhǔn)品配制溶液，需保證度骨化醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液為現(xiàn)配現(xiàn)測，因?yàn)榉胖靡欢螘r(shí)間后標(biāo)準(zhǔn)品溶液中同樣會(huì)出現(xiàn)度骨化醇前體，一旦出現(xiàn)度骨化醇前體，在沒有確定前體的校正因子時(shí)，用這時(shí)的度骨化醇峰面積和配樣的濃度計(jì)算出的度骨化醇峰響應(yīng)因子將不準(zhǔn)確，但是度骨化醇前體峰面積＜600，可以忽略不計(jì)，因?yàn)閣aters中2ug/ml度骨化醇溶液進(jìn)樣量50μl，主峰峰面積為55～60萬，所以當(dāng)前體的峰面積＜600，占0.1％，前體峰基本積分不起來，所以可不計(jì)，這時(shí)校正因子按照1.0來計(jì)算。度骨化醇的校正因子只能通過標(biāo)注品來計(jì)算，因?yàn)槠浜繛橐阎獢?shù)據(jù)。按照公式計(jì)算出度骨化醇在該液相色譜條件下的響應(yīng)因子。
在步驟(2)、(3)和(4)中配制標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液的溶劑為甲醇、乙腈或兩者溶劑和水以任何比例混合的溶液。
在步驟(3)中通過測試5,6-反式度骨化醇標(biāo)準(zhǔn)品配制的溶液，5,6-反式度骨化醇在乙腈溶液中室溫下較穩(wěn)定，此時(shí)通過配制2ug/ml5,6-反式度骨化醇，進(jìn)樣量50μl，因?yàn)槭菢?biāo)準(zhǔn)品，這時(shí)譜圖中只有5,6-反式度骨化醇，沒有度骨化醇和度骨化醇前體峰，通過測試出的5,6-反式度骨化醇峰面積、配液濃度和標(biāo)準(zhǔn)品的含量計(jì)算出5,6-反式度骨化醇在該色譜條件下的響應(yīng)因子。
在步驟(4)中通過對度骨化醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行破壞計(jì)算出度骨化醇前體相對于度骨化醇響應(yīng)因子的校正系數(shù)。破壞試驗(yàn)：1mg/ml度骨化醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液50ml液體中加入0.05％～0.20％氫氧化鈉水溶液0.5～0.8ml，在70～85℃條件下破壞2～4h，約10～22％度骨化醇轉(zhuǎn)化為度骨化醇前體和5,6-反式度骨化醇。其中氫氧化鈉水溶液濃度為0.05％～0.20％，優(yōu)選0.10～0.15％，破壞條件為70～85℃，2～4h；優(yōu)選75～80℃，2.5～3h。
在步驟(4)中將破壞后的溶液同樣配制成2ug/ml濃度，取50μl注入waters液相色譜儀中，此時(shí)破壞后的樣品圖譜中有度骨化醇峰，度骨化醇前體峰和5,6-反式度骨化醇峰，即在該條件下破壞度骨化醇只轉(zhuǎn)變?yōu)槎裙腔记绑w峰和5,6-反式度骨化醇，結(jié)合步驟(2)中得到的5,6-反式度骨化醇響應(yīng)因子，計(jì)算出在該條件下度骨化醇轉(zhuǎn)化為5,6-反式度骨化醇的量，根據(jù)度骨化醇降低的含量、轉(zhuǎn)化為5,6-反式度骨化醇的量，計(jì)算出其中轉(zhuǎn)化為度骨化醇前體的量，根據(jù)譜圖中的度骨化醇前體峰面積，計(jì)算出度骨化醇前體的響應(yīng)因子。
在步驟(4)中需要在規(guī)定的破壞條件下進(jìn)行破壞，更溫和的條件破壞出的度骨化醇前體和5,6-反式度骨化醇量較少，這樣譜圖中的峰面積較小，據(jù)此計(jì)算出的響應(yīng)因子誤差較大，條件更劇烈，度骨化醇不止會(huì)破壞出前體和5,6-反式度骨化醇，會(huì)出現(xiàn)其它雜質(zhì)峰，這樣其它雜質(zhì)沒有標(biāo)準(zhǔn)品無法定量，所以也就無法確定轉(zhuǎn)變?yōu)槎裙腔记绑w的量。
在步驟(5)中按照度骨化醇注射液處方工藝配制度骨化醇注射液，此時(shí)度骨化醇原料藥含量為已知數(shù)據(jù)，并且據(jù)此數(shù)據(jù)折算原料藥量按照100％投料量來配制度骨化醇注射液，采用外標(biāo)法通過液相分別測試度骨化醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液和自行配制的度骨化醇注射液中度骨化醇和度骨化醇前體的峰面積。通過校正因子，將前體峰面積折算為度骨化醇峰面積，然后計(jì)算出注射液中度骨化醇的有效濃度，和投料濃度對比，得出注射液的含量，其中含量包括度骨化醇轉(zhuǎn)變生成的前體的含量。
本發(fā)明針對實(shí)際中遇到的通過液相以外標(biāo)法測試度骨化醇注射液含量時(shí)遇到的度骨化醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液和注射液中度骨化醇會(huì)產(chǎn)生度骨化醇前體的問題，不能采用傳統(tǒng)意義上的外標(biāo)法簡單的對比峰面積和稱樣量計(jì)算，通過使用0.05～0.20％氫氧化鈉水溶液在70～85℃條件下對度骨化醇標(biāo)準(zhǔn)品(雜質(zhì)盡可能少)進(jìn)行破壞，使破壞的度骨化醇只生成度骨化醇前體和5,6-反式度骨化醇，通過計(jì)算得到度骨化醇前體和度骨化醇響應(yīng)因子，從而可知度骨化醇前體折算為度骨化醇的校正因子，后續(xù)均可據(jù)此將標(biāo)準(zhǔn)品溶液和注射液中生產(chǎn)的度骨化醇前體峰面積折算為度骨化醇峰面積，然后可再通過外標(biāo)法計(jì)算出度骨化醇注射液的含量。該方法通過實(shí)踐檢驗(yàn)具有可操作性，計(jì)算出的度骨化醇含量準(zhǔn)確度高，重復(fù)性好，且對度骨化醇轉(zhuǎn)變?yōu)榍绑w的程度沒有要求，得出校正因子后續(xù)直接代入計(jì)算即可，簡單方便，從而可對注射液中度骨化醇含量的進(jìn)行有效的控制。
具體實(shí)施方式
液相色譜條件為儀器：waters；色譜柱：kinetexc18；檢測波長：275nm；流速：1.2ml/min；柱溫：30～35℃；運(yùn)行時(shí)間：55min；流動(dòng)相a：乙腈或甲醇，流動(dòng)相b：水；洗脫梯度：0～10min：a(75％)：b(25％)；10～30min：a(85％)：b(15％)；30～45min：a(0％)：b(100％)；45～55min：a(75％)：b(25％)。
實(shí)施例1：
稱取度骨化醇標(biāo)準(zhǔn)品(批號：dos150224，含量99.9％)5.02mg于50ml棕色容量瓶中，加40ml乙腈，冰水浴超聲10min，放至室溫后再用乙腈定容得到度骨標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液(批號：nrd20150415)。取該儲(chǔ)備液2.0ml于100ml棕色容量瓶中，乙腈稀釋定容得到度骨化醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液，取此溶液50μl注入液相色譜儀中，測出度骨化醇標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積為586217，前體585，總計(jì)586802：
f度＝5.02mg*99.9％/50ml/50/586802＝0.342*10-5ug/ml。
稱取5,6-反式度骨化醇標(biāo)準(zhǔn)品(批號：dts150229，含量99.5％)5.10mg于50ml棕色容量瓶中，加40ml乙腈，冰水浴超聲10min，放至室溫后再用乙腈定容得到5,6-反式度骨標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液。取該儲(chǔ)備液2.0ml于100ml棕色容量瓶中，乙腈稀釋定容得到5,6-反式度骨化醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液，取此溶液50μl注入液相色譜儀中，測出5,6-反式度骨化醇標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積為622564：
f反＝5.10mg*99.5％/50ml/50/622564＝0.325*10-5ug/ml。
取度骨化醇標(biāo)準(zhǔn)品(批號：dos150224，含量99.9％)5.12mg于50ml棕色容量瓶中，加40ml乙腈，冰水浴超聲10min，加入0.15％氫氧化鈉水溶液0.6ml，放至室溫后再用乙腈定容，將此液體放在74℃條件下破壞3.5h。再取該破壞溶液2.0ml于100ml棕色容量瓶中乙腈稀釋定容得到破壞后的度骨化醇溶液，取此溶液50μl注入液相色譜儀中，測度骨化醇、度骨化醇前體和5,6-反式度骨化醇的峰面積分別為：507078、77493、12096：
c度前＝5.12mg*99.9％/50ml/50＝2.045ug/ml；
c度后＝0.342*10-5ug/ml*507078＝1.734ug/ml；
c反后＝0.325*10-5ug/ml*12096＝0.039ug/ml；
f前＝(2.045ug/ml-1.734ug/ml-0.039ug/ml)/77493＝0.351*10-5ug/ml；
f校＝(0.351*10-5ug/ml)/(0.342*10-5ug/ml)＝1.026。
稱取10g聚山梨酯20、1.5g氯化鈉、20mg二叔丁基對甲酚、14.4g七水磷酸氫二鈉、1.8g一水磷酸二氫鈉和1.1g乙二胺四乙酸二鈉于1000ml容量瓶中，加入50ml100％乙醇，再稱取2.016mg度骨化醇原料藥(批號：doa140711，含量99.2％)然后加入注射用水溶解稀釋定容得到度骨化醇注射液。取度骨標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液(批號：nrd20150415)2.0ml于100ml棕色容量瓶中，乙腈稀釋定容得到度骨化醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液，取度骨化醇注射液和標(biāo)準(zhǔn)品溶液各50μl分別注入液相色譜儀測試出度骨化醇注射液中度骨化醇和度骨化醇前體的峰面積分別為579693和21552；度骨化醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液中度骨化醇和度骨化醇前體峰面積分別為：581075和17578：
c注效＝5.02mg*99.9％/50ml/50*(579693+1.026*21552)/(581075+1.026*17578)
＝1.997ug/ml
％注含＝(1.997ug/ml)/(2.016mg*99.2％)＝99.86％。
實(shí)施例2
取一批度骨化醇注射液，采用傳統(tǒng)的外標(biāo)法來計(jì)算注射液中的度骨化醇含量為93.5％，采用實(shí)施例1的方法計(jì)算總度骨化醇含量為96.7％。
計(jì)算過程：對照品溶液中度骨化醇濃度為1.991ug/ml，度骨化醇峰面積為306155，度骨化醇前體峰面積308；度骨化醇注射液中度骨化醇標(biāo)示量為2ug/ml，度骨化醇峰面積為287658，度骨化醇前體峰面積10133。
采用傳統(tǒng)的外標(biāo)法來計(jì)算注射液中的度骨化醇含量：
％＝(287658*1.991ug/ml/306155)/2ug/ml＝93.5％
采用實(shí)施例1的方法計(jì)算總度骨化醇含量：
％＝[(287658+10133)*1.991ug/ml/(306155+308)]/2ug/ml＝96.7％
實(shí)施例3
采用傳統(tǒng)的外標(biāo)法來計(jì)算原研注射液(hectorol，批號：6r1002)近效期產(chǎn)品中的度骨化醇含量為91.8％，采用實(shí)施例1的方法計(jì)算總度骨化醇含量為95.2％。
計(jì)算過程：對照品溶液中度骨化醇濃度為1.991ug/ml，度骨化醇峰面積為306155，度骨化醇前體峰面積308；度骨化醇注射液中度骨化醇標(biāo)示量為2ug/ml，度骨化醇峰面積為282386，度骨化醇前體峰面積10822。
采用傳統(tǒng)的外標(biāo)法來計(jì)算注射液中的度骨化醇含量：
％＝(282386*1.991ug/ml/306155)/2ug/ml＝91.8％
采用實(shí)施例1的方法計(jì)算總度骨化醇含量：
％＝[(282386+10822)*1.991ug/ml/(306155+308)]/2ug/ml＝95.2％
因?yàn)槎裙腔荚谌芤籂顟B(tài)下會(huì)一定程度轉(zhuǎn)化為度骨化醇前體，在采用對照品進(jìn)行外標(biāo)法計(jì)算注射液中度骨化醇含量時(shí)，由于對照品溶液是新鮮制備的，因此度骨化醇與前體之間的轉(zhuǎn)化程度與注射液不一致，不可以按照傳統(tǒng)的方式只以度骨化醇峰面積來計(jì)算，而應(yīng)該以總度骨化醇(度骨化醇+度骨化醇前體)峰面積來計(jì)算注射液中總度骨化醇的含量。