本發(fā)明涉及牛奶中雙酚a殘留的檢測方法。

背景技術：

雙酚a(bpa)是一種重要的有機化工原料，廣泛用于環(huán)氧樹脂、聚碳酸酯等塑料制品的生產(chǎn)。在塑料制品中，添加雙酚a可以使其具有無色透明、耐用、抗氧化、輕巧和抗沖擊等特性，因此被廣泛用于制造塑料(奶)瓶、食品和飲料(尤其是奶制品)包裝的內(nèi)側涂層。食品包裝材料中bpa的使用，不可避免地會導致食品中bpa的殘留。動物實驗表明，雙酚a是一種主要的內(nèi)分泌干擾物之一，它能夠模仿雌激素樣的作用，擾亂正常雌激素的內(nèi)分泌功能，引起性早熟和代謝紊亂，誘發(fā)乳房腫瘤，降低免疫功能，損害生殖系統(tǒng)，甚至導致癌癥和人的死亡。而且，攝入痕量的bpa就會對人體造成嚴重的傷害。為了確保食品安全，開展食品(特別是牛奶)中痕量雙酚a殘留的檢測研究是十分必要的。從傳統(tǒng)意義上講，牛奶中雙酚a殘留的分析方法主要有電化學法、質(zhì)譜分析法、氣相色譜法、液相色譜法及酶聯(lián)吸附免疫測定法等。但是這些方法卻存在一些局限性。

在2007年第1-2期的《色譜b》(journalofchromatographyb)的文章《一種基于基質(zhì)固相分散萃取和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術分析雞蛋和牛奶中的烷基酚和雙酚a》(analysisofalkylphenolandbisphenolaineggsandmilkbymatrixsolidphasedispersionextractionandliquidchromatographywithtandemmassspectrometry)公開了一種檢測雞蛋和牛奶中的烷基酚和雙酚a的方法。該方法利用的是液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術同時檢測雞蛋和牛奶中的烷基酚(壬基苯酚和辛基酚)及雙酚a。他們采用c18作為分散劑的固相分散萃取(spe)對雞蛋和牛奶樣品進行提取處理，從而實現(xiàn)使用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法作為分析技術對雞蛋和牛奶中的烷基酚和雙酚a進行同步檢測。通過這一技術，雞蛋中壬基苯酚和辛基酚以及雙酚a的檢出限分別可以達到0.25、0.10和0.10μg/kg^-1；牛奶中壬基苯酚和辛基酚以及雙酚a的檢出限分別可以達到0.05、0.10和0.10μg/kg^-1。這種檢測方法的缺點在于不僅生物樣品提取過程復雜且不易保存，而且樣品前處理成本高且檢測時間過長。

2011年第3期的《食品化學》(foodchemistry)報道了一種基于玻璃碳電極修飾的fe3o4磁性納米粒子測定牛奶中的雙酚a的電流測定方法(amperometricdeterminationofbisphenolainmilkusingpamam-fe3o4modifiedglassycarbonelectrode)，其中雙酚a殘留的提取操作是通過玻璃碳電極修飾的fe3o4磁性納米粒子對牛奶樣品中的雙酚a進行純化和提取實現(xiàn)的。雙酚a的檢出限可以低至5×10^-9mol/l。這種檢測方法的缺點在于實驗操作過程復雜，樣品前處理過程耗時且檢測成本高，大大限制了它在實際分析領域中的應用。

2015年第10期的《食品分析方法》(foodanal.methods)文章《利用超靈敏熒光免疫方法以功能化的金納米粒子作為探針檢測奶制品中的雙酚a的方法》(ultrasensitivefluorescenceimmunoassayfordetectionofbisphenolainmilkproductsusingfunctionalizedgoldnanoparticlesasprobe)報道了一種基于功能化的金納米粒子作為探針進行定性和定量檢測牛奶中痕量雙酚a的熒光免疫分析法。他們利用金納米粒子作為探針，使用巰基修飾的單鏈dna(sh-ssdnas)作為牛奶中雙酚a特異性識別的抗體。該文獻所提出的熒光免疫分析方法可以直接用于牛奶中雙酚a的檢測而不受牛奶中其他物質(zhì)的干擾。通過這種方法，其檢出限可以達到3.4×10^-13ng/l，這要比歐盟(eu)規(guī)定的最大殘留量0.6mg/kg少。這種檢測方法利用巰基修飾的單鏈dna(sh-ssdnas)作為牛奶中雙酚a特異性識別的抗體和金納米粒子探針構建載體，實驗成本大大增加。

到目前為止，基于表面增強拉曼散射(sers)技術對牛奶中雙酚a殘留進行檢測的研究尚未見報道。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明是要解決現(xiàn)有的檢測牛奶中雙酚a殘留的方法前處理復雜、成本高的技術問題，而提供一種牛奶中雙酚a殘留的表面增強拉曼檢測方法。

本發(fā)明的牛奶中雙酚a殘留的表面增強拉曼檢測方法，按以下步驟進行：

一、制備金納米粒子(aunps)溶膠，然后利用鹵化物水溶液修飾aunps，得到鹵化物修飾的具有sers活性的aunps改性基底；

二、向待測牛奶樣品中添加體積比為3:1的甲醇/水混合溶劑，超聲處理1～3min，再離心分離處理8～15min，移出上清液在室溫下自然蒸發(fā)至干得到殘余物；再向殘余物中加入體積比為3:1的甲醇/水混合溶劑并超聲處理1～3min，再離心分離處理5～8min，移出上清液，依次用0.45μm和0.22μm的水系膜對上清液進行過濾，得到待測牛奶樣品上清液；

三、將鹵化物修飾的具有sers活性的aunps改性基底與待測牛奶樣品上清液混合，然后再向混合物中添加硫酸鹽水溶液作為聚集劑，之后再將其加載到玻璃點樣毛細管中，得到待測牛奶樣品檢測管；

四、用拉曼光譜儀測試步驟三得到的待測牛奶樣品檢測管的表面增強拉曼光譜，將該光譜與雙酚a標準品的拉曼圖譜比對，如果待測牛奶樣品的表面增強拉曼光譜中出現(xiàn)雙酚a標準品的特征信號峰，則說明待測牛奶樣品存在雙酚a。

利用標準曲線法可實現(xiàn)對待測牛奶樣品中雙酚a殘留的定量檢測。

本發(fā)明將待測牛奶樣品通過水輔助溶劑兩步分離技術進行前處理，然后用鹵化物水溶液修飾的aunps改性基底與牛奶樣品上清液進行混合，得到混合物，再向混合物中加入硫酸鹽水溶液作為聚集劑，如果待測牛奶樣品中有殘留的雙酚a分子存在，雙酚a分子則吸附在具有sers活性的aunps改性基底上，產(chǎn)生可識別的拉曼光譜信號，通過與雙酚a標準品的本體拉曼光譜比對，若牛奶樣品中出現(xiàn)雙酚a的特征sers信號峰，即認定牛奶樣品中有雙酚a的存在，從而實現(xiàn)牛奶樣品中雙酚a殘留的定性鑒別和定量檢測；采用本方法不僅可以檢測牛奶中殘留的雙酚a分子，通過與標準品的光譜比對，也可以實現(xiàn)對雙酚衍生物(如雙酚b、雙酚f等)進行定性鑒別。

本發(fā)明首次將sers技術應用于牛奶中雙酚a分子殘留的檢測，采用鹵化物水溶液和硫酸鹽水溶液修飾和改性aunpssers活性基底；其中，硫酸鹽水溶液作為聚集劑，大大提高了sers檢測的靈敏度，并獲得了極低的檢出限，其檢出限可以達到4.3×10^-9mol/l，遠低于歐盟規(guī)定的最大殘留限量(0.6mg/kg)。檢測無需標記，操作簡單；檢測快速，需要樣品量少而且易得，試劑水不產(chǎn)生干擾，是一種無損檢測方法，這種成本低廉、環(huán)境友好、方便快速的sers檢測方法易于商業(yè)化應用，填補sers技術在牛奶中雙酚a分子檢測方面的空白，為牛奶中雙酚a分子及其衍生物的分析檢測提供新的思路。

附圖說明

圖1是試驗1中雙酚a濃度為1×10^-3mol/l的加標牛奶樣品在1×10^-3mol/l氟化鉀水溶液和1×10^-2mol/l硫酸鋅水溶液修飾的aunps改性基底上的sers光譜及雙酚a濃度為1×10^-3mol/l的甲醇水溶液和雙酚a固體粉末本體的拉曼光譜圖；

圖2是試驗2中雙酚a濃度為1×10^-3mol/l的加標牛奶樣品在不同鹵化物水溶液修飾的aunps改性基底上的sers光譜；

圖3是試驗3中雙酚a濃度為1×10^-3mol/l的加標牛奶樣品在1×10^-3mol/l氟化鉀水溶液和不同硫酸鹽水溶液修飾的aunps改性基底上的sers光譜；

圖4是試驗4中不同濃度雙酚a加標牛奶樣品的sers光譜；

圖5是試驗4中加標牛奶樣品的雙酚a濃度與641cm^-1處峰強度標準曲線。

具體實施方式

具體實施方式一：本實施方式的牛奶中雙酚a殘留的表面增強拉曼檢測方法，按以下步驟進行：

一、制備金納米粒子(aunps)溶膠，然后利用鹵化物水溶液修飾aunps，得到鹵化物修飾的具有sers活性的aunps改性基底；

二、向待測牛奶樣品中添加體積比為3:1的甲醇/水混合溶劑，超聲處理1～3min，再離心分離處理8～15min，移出上清液在室溫下自然蒸發(fā)至干得到殘余物；再向殘余物中加入體積比為3:1的甲醇/水混合溶劑并超聲處理1～3min，再離心分離處理5～8min，移出上清液，依次用0.45μm和0.22μm的水系膜對上清液進行過濾，得到待測牛奶樣品上清液；

三、將鹵化物修飾的具有sers活性的aunps改性基底與待測牛奶樣品上清液混合，然后再向混合物中添加硫酸鹽水溶液作為聚集劑，之后再將其加載到玻璃點樣毛細管中，得到待測牛奶樣品檢測管；

四、用拉曼光譜儀測試步驟三得到的待測牛奶樣品檢測管的表面增強拉曼光譜，將該光譜與雙酚a標準品的拉曼圖譜比對，如果待測牛奶樣品的表面增強拉曼光譜中出現(xiàn)雙酚a標準品的特征信號峰，則說明待測牛奶樣品存在雙酚a。

具體實施方式二：本實施方式與具體實施方式一不同的是：步驟一中，制備金納米粒子(aunps)溶膠，然后利用鹵化物水溶液修飾aunps，制備鹵化物修飾的具有sers活性的aunps改性基底的具體步驟如下：

a、將1ml1％的haucl4加入到裝有99ml去離子水的三口燒瓶中，在磁力攪拌下加熱使其溶解；當溶液加熱至94℃的沸騰狀態(tài)時加入4ml質(zhì)量百分濃度為1％的檸檬酸鈉水溶液，三口燒瓶中溶液由無色透明逐漸轉變成淡紫色、紫色，最終生成酒紅色的透明溶膠；透明溶膠在96℃的微沸狀態(tài)下保持15min，然后停止加熱，自然冷卻至室溫，得到金溶膠；

b、將aunps溶膠離心，得到aunps濃縮物；將鹵化物水溶液與aunps濃縮物進行充分混合，靜止，得到鹵化物修飾的aunps改性基底。其它與具體實施方式一相同。

具體實施方式三：本實施方式與具體實施方式二不同的是：步驟b中，離心時間為5～10min，離心速度為5000～10000轉/秒；aunps濃縮物與鹵化物水溶液混合的體積比為1：1。其它與具體實施方式二相同。

具體實施方式四：本實施方式與具體實施方式二或三不同的是：步驟b中鹵化物為氟化鉀、氯化鉀、溴化鉀或者碘化鉀；其它與具體實施方式二或三相同。

具體實施方式五：本實施方式與具體實施方式二至四之一不同的是：步驟b中，鹵化物水溶液的濃度為1×10^-2～1×10^-4mol/l；其它與具體實施方式二至四之一相同。

具體實施方式六：本實施方式與具體實施方式二至五之一不同的是：步驟b中，鹵化物水溶液與aunps濃縮物混合后的靜止時間為5～10min。其它與具體實施方式二至五之一相同。

具體實施方式七：本實施方式與具體實施方式一至六之一不同的是：步驟三中，鹵化物修飾的具有sers活性的aunps改性基底與待測牛奶樣品上清液的體積比為1：1。其它與具體實施方式一至六之一相同。

具體實施方式八：本實施方式與具體實施方式一至七之一不同的是：步驟三中，硫酸鹽水溶液為硫酸鈉、硫酸鋅或硫酸鋁。其它與具體實施方式一至七之一相同。

具體實施方式九：本實施方式與具體實施方式一至八之一不同的是：步驟三中，硫酸鹽水溶液的濃度為1×10^-2～1×10^-4mol/l。其它與具體實施方式一至八之一相同。

具體實施方式十：本實施方式與具體實施方式一至九之一不同的是：步驟三中，硫酸鹽水溶液的添加體積為10μl。其它與具體實施方式二至九之一相同。

用以下的試驗驗證本發(fā)明的有益效果：

試驗1：牛奶中雙酚a殘留的表面增強拉曼檢測方法，按以下步驟進行：

一、將0.2283g雙酚a(bpa)分子直接添加到無雙酚a分子的牛奶中并定容至10ml，獲得濃度為1×10^-1mol/l的bpa加標牛奶母液，然后以無雙酚a分子的空白液態(tài)牛奶作為溶劑將加標牛奶母液稀釋成1×10^-3mol/l，得到雙酚a濃度為1×10^-3mol/l的加標牛奶樣品，將制備好的加標牛奶樣品在4攝氏度的冷藏條件下儲存7天；該操作的目的是使待測樣品更接近于含有雙酚a分子殘留的真實牛奶樣品；

二、制備金納米粒子(aunps)溶膠，然后利用氟化鉀水溶液修飾aunps，制備氟化鉀修飾的具有sers活性的aunps改性基底。具體的操作步驟如下：a、將1ml1％的haucl4加入到裝有99ml去離子水的三口燒瓶中，在磁力攪拌下加熱使其溶解；當溶液加熱至94℃的沸騰狀態(tài)時快速加入4ml濃度為1％的檸檬酸鈉水溶液，三口燒瓶中溶液由無色透明逐漸轉變成淡紫色、紫色，最終生成酒紅色的透明溶膠；透明溶膠在96℃的微沸狀態(tài)下保持15min，然后停止加熱，自然冷卻至室溫，得到金溶膠；b、取10ml的aunps溶膠，在7000轉/秒下離心10min，得到aunps濃縮物；將30μl濃度為1×10^-3mol/l的氟化鉀水溶液與30μl的aunps濃縮物進行充分混合，靜止10min，得到氟化鉀修飾的aunps改性基底；

三、向待測加標牛奶樣品中添加體積比為3:1的甲醇/水混合溶劑，超聲處理1～3min，再離心分離處理8～15min，移出上清液在室溫下自然蒸發(fā)至干得到殘余物；再向殘余物中加入體積比為3:1的甲醇/水混合溶劑并超聲處理1～3min，再離心分離處理5～8min，移出上清液，依次用0.45μm和0.22μm的水系膜對上清液進行過濾，得到待測加標牛奶樣品上清液；

四、將30μl的濃度為1×10^-3mol/l的氟化鉀水溶液修飾的aunps改性基底與30μl加標牛奶樣品上清液進行充分混合，然后再向混合物中添加10μl濃度為1×10^-2mol/l的硫酸鋅水溶液作為聚集劑，之后再將其加載到玻璃點樣毛細管中，得到待測加標牛奶樣品檢測管；同時將未加硫酸鋅水溶液處理的樣品、未加氟化鉀水溶液修飾的樣品、氟化鉀水溶液與硫酸鋅水溶液均未加的樣品、雙酚a甲醇水溶液、氟化鉀水溶液和硫酸鋅水溶液雙重修飾的aunps改性基底空白溶液也加載到玻璃點樣毛細管中，制成對比的檢測管；

五、用激發(fā)光源的波長為633nm的horibalabramaramis型拉曼光譜儀測試步驟四得到的待測加標牛奶樣品檢測管及對比檢測管的拉曼光譜，拉曼光譜儀采集信號的時間為2min，將該光譜與雙酚a標準品的拉曼圖譜比對，實現(xiàn)對待測牛奶樣品中雙酚a殘留的定性鑒別和定量檢測。

在本試驗中，30μl雙酚a加標牛奶樣品上清液與30μl濃度為1×10^-3mol/l氟化鉀水溶液修飾的aunps改性基底混合后，再添加10μl濃度為1×10^-2mol/l硫酸鋅水溶液的sers光譜圖如圖1a中的曲線a所示，圖1a中的曲線b是30μl濃度為1×10^-3mol/l氟化鉀水溶液修飾的aunps改性基底與30μl雙酚a加標牛奶樣品上清液混合后的sers光譜圖；c是將10μl濃度為1×10^-2mol/l硫酸鋅水溶液修飾的aunps改性基底與30μl雙酚a加標牛奶樣品上清液混合后的sers光譜圖；d是30μl未修飾aunps基底與30μl雙酚a加標牛奶樣品上清液混合后的sers光譜圖；e是雙酚a濃度為1×10^-3mol/l的甲醇水溶液的本體拉曼光譜圖；f是空白1×10^-3mol/l氟化鉀水溶液和1×10^-2mol/l硫酸鋅水溶液雙重修飾的aunps改性基底的拉曼光譜圖；圖1b中的曲線是雙酚a固體粉末本體的拉曼光譜圖。從圖1b可以看出，雙酚a的特征拉曼信號峰出現(xiàn)在641cm^-1和1112cm^-1處，歸屬于兩苯環(huán)的特征振動。從圖1可以看出，1×10^-3mol/l加標牛奶樣品上清液在未經(jīng)任何修飾的aunps基底上不產(chǎn)生拉曼信號；而在經(jīng)過鹵化物水溶液和硫酸鹽水溶液修飾的aunps改性基底上則表現(xiàn)出很強的拉曼信號強度。并且，通過與雙酚a固體粉末本體的拉曼光譜比對，可以指認加標牛奶樣品中雙酚a在aunps改性基底上的sers光譜，證明本試驗能夠定性鑒別牛奶中殘留的雙酚a分子的存在。

試驗2：本試驗與試驗1不同的是：

步驟二中的氟化鉀分別用氯化鉀、溴化鉀、碘化鉀替代，得到不同鹵化物修飾的aunps改性基底；

步驟四中的操作用以下操作代替：分別將30μl的濃度為1×10^-3mol/l氟化鉀、氯化鉀、溴化鉀或碘化鉀水溶液修飾的aunps改性基底與30μl加標牛奶樣品上清液進行充分混合，之后再將其加載到玻璃點樣毛細管中，得到待測加標牛奶樣品檢測管；

其它步驟與參數(shù)與試驗1相同。

本試驗中，30μl雙酚a加標牛奶樣品上清液分別與30μl濃度為1×10^-3mol/l不同鹵化物水溶液修飾的aunps改性基底和未經(jīng)修飾的aunps基底混合后的sers光譜如圖2中的曲線a～e所示。從圖2a可以看出，1×10^-3mol/l加標牛奶樣品上清液在未經(jīng)鹵化物水溶液修飾的aunps基底上不產(chǎn)生任何拉曼信號。而1×10^-3mol/l加標牛奶樣品在經(jīng)濃度為1×10^-3mol/l的不同鹵化物水溶液修飾的aunps改性基底上則表現(xiàn)出了很強的拉曼信號強度。可見，鹵化物水溶液在一定程度上對加標牛奶中雙酚a的拉曼信號增強有重要的貢獻。而且，從圖2中可以看出，與其他鹵化物水溶液修飾的aunps改性基底相比，雙酚a加標牛奶樣品在1×10^-3mol/l氟化鉀水溶液修飾的aunps改性基底上表現(xiàn)出更強的拉曼信號。因此，選擇1×10^-3mol/l氟化鉀水溶液修飾的aunps改性基底進行下一步試驗操作。

試驗3：本試驗與試驗1不同的是：步驟四中的操作用以下操作代替：將30μl的濃度為1×10^-3mol/l氟化鉀水溶液修飾的aunps改性基底與30μl加標牛奶樣品上清液進行充分混合，然后再向混合物中不添加硫酸鹽溶液、或添加10μl濃度為1×10^-2mol/l的硫酸鈉水溶液作為聚集劑、或添加10μl濃度為1×10^-2mol/l的硫酸鋅水溶液作為聚集劑、或添加10μl濃度為1×10^-2mol/l的硫酸鋁水溶液作為聚集劑，然后再將它們加載到玻璃點樣毛細管中，得到待測加標牛奶樣品檢測管；其它與試驗1相同。

本試驗中，30μl雙酚a加標牛奶樣品上清液與30μl濃度為1×10^-3mol/l氟化鉀水溶液修飾的aunps改性基底進行混合，不加或再加入10μl濃度為1×10^-2mol/l不同硫酸鹽水溶液作為聚集劑的sers光譜圖如圖3中的曲線a～d所示。從圖3a可以看出，1×10^-3mol/l加標牛奶樣品上清液在只經(jīng)濃度為1×10^-3mol/l氟化鉀水溶液修飾的aunp改性基底上產(chǎn)生了一定強度的拉曼信號，但卻不能滿足牛奶中雙酚a殘留的痕量檢測需求。然而，當再加入濃度為1×10^-2mol/l的不同硫酸鹽水溶液作為聚集劑時，加標牛奶樣品上清液在aunps改性基底上則表現(xiàn)出了非常強的拉曼信號強度，可以實現(xiàn)對牛奶中雙酚a殘留的痕量檢測。可見，濃度為1×10^-2mol/l的硫酸鹽水溶液，包括硫酸鈉、硫酸鋅、硫酸鋁在一定程度上都對加標牛奶中雙酚a的拉曼信號增強有巨大的貢獻。而且，從圖3中還可以看出，與其他硫酸鹽水溶液和1×10^-3mol/l氟化鉀水溶液修飾的aunps改性基底相比，雙酚a加標牛奶樣品在經(jīng)1×10^-3mol/l氟化鉀水溶液和1×10^-2mol/l硫化鋅水溶液同時修飾的aunps改性基底上表現(xiàn)出更強的拉曼信號。因此選擇1×10^-2mol/l硫酸鋅水溶液和1×10^-3mol/l氟化鉀水溶液修飾的aunps改性基底進行下一步試驗操作。

試驗4：本試驗的牛奶中雙酚a殘留的表面增強拉曼檢測方法，按以下步驟進行：

一、將0.2283g雙酚a(bpa)分子直接添加到無雙酚a分子的牛奶中并定容至10ml，獲得濃度為1×10^-1mol/l的bpa加標牛奶母液，然后以無雙酚a分子的空白液態(tài)牛奶作為溶劑將加標牛奶母液分別稀釋成一系列的所需濃度：1×10^-1、1×10^-2、1×10^-3、1×10^-4、1×10^-5、1×10^-6、1×10^-7、1×10^-8和1×10^-9mol/l，得到加標牛奶樣品，將制備好的加標牛奶樣品在4攝氏度的冷藏條件下儲存7天使待測樣品更接近于含有bpa殘留的真實牛奶；

二、制備金納米粒子(aunps)溶膠，然后利用氟化鉀水溶液修飾aunps，制備氟化鉀修飾的具有sers活性的aunps改性基底。具體的操作步驟如下：a、將1ml1％的haucl4加入到裝有99ml去離子水的三口燒瓶中，在磁力攪拌下加熱使其溶解；當溶液加熱至94℃的沸騰狀態(tài)時快速加入4ml濃度為1％的檸檬酸鈉水溶液，三口燒瓶中溶液由無色透明逐漸轉變成淡紫色、紫色，最終生成酒紅色的透明溶膠；透明溶膠在96℃的微沸狀態(tài)下保持15min，然后停止加熱，自然冷卻至室溫，得到金溶膠；b、取10ml的aunps溶膠，在7000轉/秒下離心10min，得到aunps濃縮物；將30μl濃度為1×10^-3mol/l的氟化鉀水溶液與30μl的aunps濃縮物進行充分混合，靜止10min，得到氟化鉀修飾的aunps改性基底；

三、向待測加標牛奶樣品中添加體積比為3:1的甲醇/水混合溶劑，超聲處理3min，再離心分離處理10min，移出上清液在室溫下自然蒸發(fā)至干得到殘余物；再向殘余物中加入體積比為3:1的甲醇/水混合溶劑并超聲處理3min，再離心分離處理5min，移出上清液，依次用0.45μm和0.22μm的水系膜對上清液進行過濾，得到待測加標牛奶樣品上清液；

四、將30μl的濃度為1×10^-3mol/l氟化鉀水溶液修飾的aunps改性基底分別與30μl不同濃度的加標牛奶樣品上清液進行充分混合，然后再向混合物中分別添加10μl的1×10^-2mol/l硫酸鋅水溶液作為聚集劑，之后再將其加載到玻璃點樣毛細管中，得到待測加標牛奶樣品檢測管；

五、用拉曼光譜儀測試步驟四得到的待測加標牛奶樣品檢測管的表面增強拉曼光譜，將該光譜與雙酚a標準品的拉曼圖譜比對，實現(xiàn)對待測牛奶樣品中雙酚a殘留的定性鑒別和定量檢測。

本試驗中，雙酚a濃度分別為1×10^-1、1×10^-2、1×10^-3、1×10^-4、1×10^-5、1×10^-6、1×10^-7、1×10^-8和1×10^-9mol/l的加標牛奶樣品的sers光譜如圖4所示。圖4中曲線由上到下對應著濃度為1×10^-1、1×10^-2、1×10^-3、1×10^-4、1×10^-5、1×10^-6、1×10^-7、1×10^-8和1×10^-9mol/l的樣品。從圖中可以看出，雙酚a在1×10^-2mol/l硫酸鋅水溶液和1×10^-3mol/l氟化鉀水溶液修飾的aunps改性基底上展現(xiàn)了濃度依賴的sers增強，證明本試驗可定性和定量檢測牛奶中殘留的痕量雙酚a分子的存在，牛奶中雙酚a殘留的最低檢測濃度可以達到1×10^-8mol/l。另外，在雙酚a濃度為1×10^-3～1×10^-8mol/l范圍內(nèi)，以拉曼位移641cm^-1處的峰強度為縱坐標，以加標牛奶中雙酚a濃度為橫坐標作圖，可以得到標準曲線如圖5所示；利用標準曲線可以實現(xiàn)對待測加標牛奶樣品中雙酚a濃度的定量檢測，牛奶中雙酚a殘留的檢出限可以達到4.3×10^-9mol/l(相對于3倍信噪比)。