本發(fā)明屬于生物、環(huán)境檢測技術領域，特別涉及一種磁共振/熒光雙模態(tài)探針及其應用。

背景技術：

氟是人體必需的微量元素之一，氟攝入不足會造成齲齒和骨質(zhì)疏松等疾病。但過量攝入反而會造成氟中毒。過量的氟經(jīng)消化道或呼吸道進入人體，經(jīng)血液循環(huán)散布全身。在血漿中氟與鈣、鎂離子結合使得二者的濃度下降，出現(xiàn)手足搐搦、肌肉痙攣和肌肉疼痛等癥狀；其次，依賴鈣、鎂離子輔助方起作用的酶受到抑制，進而影響到許多代謝過程；過量的氟主要作用于骨骼的磷灰石并取代其羥基，對人體的成骨細胞、破骨細胞、軟骨組織及骨的礦化等造成一系列的損害。地方性氟中毒(簡稱地氟病)是典型的由氟元素攝入過量引起的一種生物地球化學性疾病。鑒于目前我國高氟水地區(qū)改水降氟工程與地氟病防治的應用需求，亟需開發(fā)一種快速、定量監(jiān)測水樣中氟離子含量的技術，對于氟污染分布區(qū)域的調(diào)查、水質(zhì)監(jiān)控具有重要應用價值；而在無創(chuàng)傷條件下，檢測活體內(nèi)氟離子的水平，則可用于地氟病發(fā)病機制的探究和輔助治療。

熒光探針法具有專一性強、靈敏度高以及實時快捷等特點，而且檢測過程可通過熒光、紫外-可見光譜等途徑實現(xiàn)“可視化”，簡便直觀，是一種新型的氟離子定性和定量檢測技術。然而建立在熒光探針技術上的熒光成像存在空間分辨率低的缺陷，不能顯像深層組織和器官內(nèi)的目標物。而磁共振成像(mri)技術具有卓越的空間分辨率，能對組織及活體提供三維立體的成像，但磁共振成像存在靈敏度低等缺點。現(xiàn)在單一模態(tài)的成像技術已不足以滿足日益復雜的臨床診斷和環(huán)境監(jiān)測需求。開發(fā)一種既能定量檢測水樣品中又能顯像活體內(nèi)不同層次的氟離子探針試劑是一項具有意義的工作。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是為了開發(fā)一種既能定量檢測水樣品中又能顯像生物體內(nèi)氟離子的探針試劑，提供了一種磁共振/熒光雙模態(tài)探針及其應用。本發(fā)明的探針在gd(iii)基造影劑gd-do3a上引入熒光基團，當探針遇到氟離子時探針分解，探針上的gd(iii)能與氟離子形成穩(wěn)定絡合物，且選擇性高、吸附能力強；該探針不僅克服了單模態(tài)探針技術的固有局限性，使不同探針技術的優(yōu)勢得到互補，而且實現(xiàn)對水樣中和活體內(nèi)氟離子專一性的定量檢測。

本發(fā)明的技術方案之一為，一種磁共振/熒光雙模態(tài)探針(do3a-gd-ca)，基于1，4，7-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷的gd(iii)配合物gd-do3a和香豆素染料(ca)的結構，具體結構式如下：

其中，r＝-h，-n(c2h5)2，-oh或-o(ch2)2o(ch2)2oh。

本發(fā)明的技術方案之二為，上述磁共振/熒光雙模態(tài)探針的應用，所述探針用于定性和定量檢測水中或生物體內(nèi)(包括血液和組織液)氟離子；

進一步的，上述磁共振/熒光雙模態(tài)探針檢測氟離子用于定性和定量檢測水中或生物體內(nèi)(包括血液和組織液)氟離子的熒光光譜方法，具體為：

在模擬生理ph條件下，量取濃度為5～20μm的探針(do3a-gd-ca)儲備液適量，置于比色皿中，然后向比色皿中加入待檢測的含氟離子溶液，利用熒光分光光度計用408nm的光激發(fā)，于460nm處測定加入含氟離子溶液前后比色皿的熒光強度變化；

其中，探針(do3a-gd-ca)對氟離子的檢測限為70μm，線性工作區(qū)間為0～30μm。

進一步的，上述磁共振/熒光雙模態(tài)探針檢測氟離子用于定性和定量檢測水中或生物體內(nèi)(包括血液和組織液)氟離子的紫外-可見光光譜方法，具體為：

在模擬生理ph條件下，量取濃度為5～20μm的探針(do3a-gd-ca)儲備液適量，置于比色皿中，然后向比色皿中加入待檢測的含氟離子溶液，利用紫外-可見光光譜儀測定430nm處的加入含氟離子溶液前后比色皿光強度變化；

本發(fā)明的技術方案之三為，上述磁共振/熒光雙模態(tài)探針對生物體內(nèi)氟離子原位成像方法，具體為：

向生物體的皮下注射探針(do3a-gd-ca)，通過磁共振成像的t1-加權磁共振造影圖監(jiān)測生物體選定區(qū)域的氟離子成像。

本發(fā)明的檢測原理為：

本發(fā)明以1，4，7-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷的gd(iii)配合物(do3a-gd)為磁共振造影劑，與基于香豆素染料的熒光單元(ca)絡合形成一種磁共振/熒光雙模態(tài)氟離子探針。氟離子與探針作用后，通過競爭作用置換出探針中配位的水分子或(和)熒光基團，同時誘導熒光單元內(nèi)電子或電荷遷移以及增加了gd(iii)內(nèi)層配位水分子數(shù)，同步激活了磁共振和熒光雙模態(tài)響應信號，實現(xiàn)對氟離子的檢測。通過熒光光譜、紫外-可見光譜、高分辨質(zhì)譜等分析手段，建立氟離子檢測工作曲線，應用于水樣或生物體內(nèi)氟離子的定性、定量檢測；并通過磁共振成像(mri)成實現(xiàn)對生物體內(nèi)氟離子的原位成像。

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的優(yōu)勢在于：

1)本發(fā)明的磁共振/熒光雙模態(tài)氟離子探針可有效避免溶劑的質(zhì)子化作用和其他競爭陰離子的干擾，應用于水樣中氟離子的專一性和定量檢測，探針的檢測限遠低于國家生活飲用水衛(wèi)生標準設定的氟最高含量；

2)基于磁共振成像(mri)的極高組織穿透能力，通過mri成像獲得活體內(nèi)詳細的影像學信息，揭示氟離子在活體內(nèi)的動態(tài)分布、存儲和累積情況，可用于探究地氟病的發(fā)病機理和輔助治療。

3)本發(fā)明的探針和應用方法可為生活飲用水中氟含量的實時監(jiān)控以及地氟病的防治提供支持。

附圖說明

圖1：實施例1的向基于香豆素染料的熒光單元ca1溶液中加入磁共振造影單元(do3a-gd)前后的(a)紫外-可見光譜圖；(b)熒光光譜響應圖；以及向基于香豆素染料的熒光單元ca1溶液中加入磁共振造影單元(do3a-gd)后的(c)benesi-hildebrand線性工作曲線圖；(d)磁共振/熒光雙模態(tài)氟離子探針do3a-gd-ca1的動力學穩(wěn)定性。

圖2：實施例1的磁共振/熒光雙模態(tài)探針do3a-gd-ca1溶液中加入(a)氟離子和(b)競爭陰離子后的熒光光譜響應圖；(c)檢測氟離子的線性工作區(qū)間；

其中，圖2(b)的1.h2po4^-(0.2mm)，2.po4^3-(1mm)，3.hso4^-(0.2mm)，4.br^-(0.2mm)，5.i^-(0.2mm)，6.no3^-(0.2mm)，7.oh^-(0.2mm)，8.aco^-(0.2mm)，9.cl^-(100mm)，10.f^-(0.2mm)，11.所有陰離子混合物。

圖3：實施例1的磁共振/熒光雙模態(tài)探針do3a-gd-ca溶液中加入(a)氟離子和(b)競爭陰離子后的紫外-可見光譜響應圖；

其中，圖3(b)的陰離子為：h2po4^-(0.2mm)，po4^3-(1mm)，hso4^-(0.2mm)，br^-(0.2mm)，i^-(0.2mm)，no3^-(0.2mm)，oh^-(0.2mm)，aco^-(0.2mm)，cl^-(100mm)，f^-(0.2mm)；

圖4：實施例1的磁共振/熒光雙模態(tài)探針do3a-gd-ca1溶液中分別加入(a)0，0.1mm，0.3mm和0.5mm氟離子和(b)各種競爭陰離子后的縱向弛豫率(r1)變化及對應的磁共振造影圖；

其中，圖4(b)的1.br^-(0.5mm)，2.i^-(0.5mm)，3.cl^-(100mm)，4.po4^3-(1.0mm)，5.h2po4^-(0.5mm)，6.hso4^-(0.5mm)，7.no3^-(0.5mm)，8.oh^-(0.5mm)，9.aco^-(0.5mm)，10.f^-(0.5mm)，11.所有陰離子混合物。

圖5：實施例1的磁共振/熒光雙模態(tài)探針do3a-gd-ca1(a)與mda-mb-231和u-343mga細胞孵化后的存活率；(b)ph對探針影響的熒光光譜圖；

圖6：實施例1中探針do3a-gd-ca1(0.2ml，0.2mm)通過磁共振成像，在位檢測活體小白鼠體內(nèi)的氟離子：a(a)空白裸鼠，(b)皮下注射探針試劑do3a-gd-ca1(0.2ml，0.2mm)，(c)繼續(xù)皮下注射0.5mm氟離子后的磁共振造影圖；(b)皮下注射探針do3a-gd-ca1(0.2ml，0.2mm)后在不同時間點對應的磁共振造影圖。

具體實施方式

實施例1

1、r＝-n(c2h5)2的磁共振/熒光雙模態(tài)探針的制備方法：

1)基于香豆素染料的熒光單元ca1的制備與表征

將7-二乙氨基-3-肼基-香豆素1.0mmol溶解在30ml甲醇中，然后向該溶液中滴加含有1.0mmol2，3-羥基-苯甲醛的10ml甲醇溶液，混合物在65℃反應7小時，得到大量黃色沉淀；過濾并用甲醇洗滌沉淀，干燥后得到黃色的目標物ca1，產(chǎn)率為75％。

對目標物ca1的表征：

¹hnmr(dmso-d6，500mhz)δ(ppm)：11.80(s，h)，11.22(s，h)，9.16(s，h)，8.75(s，h)，8.64(s，h)，7.74(d，j＝10.0hz，1h)，6.93(d，j＝5.0hz，1h)，6.85(t，j＝10.0hz，2h)，6.75(t，j＝5.0hz，1h)，6.66(s，1h)，3.50(q，4h)，1.16(t，6h)；¹³cnmr(dmso-d6，125mhz)δ(ppm)：161.77，159.41，157.92，153.37，150.38，149.05，146.61，146.06，132.34，120.90，119.61，119.11，118.00，111.88，108.60，108.37，96.47，44.91，12.80.esi-ms(m/z)：396.10[ca+h]⁺.elementalanalysiscalcd.forc21h21n3o5：c63.79，h5.35，n10.63；found：c63.69，h5.75，n10.75。

2)磁共振/熒光雙模態(tài)氟離子探針do3a-gd-ca1的制備

在水體系(水-乙腈，1∶9，v/v，ph＝7.4)中，將步驟1)制備的基于香豆素染料的熒光單元ca1(10μm)和基于gd(iii)配合物的磁共振成像單元(do3a-gd)1，4，7-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷的gd(iii)配合物按1∶1的計量比(摩爾比)混合，二者形成絡合物，即得到磁共振/熒光雙模態(tài)氟離子探針do3a-gd-ca1。

2、通過紫外-可見光譜和熒光光譜表征熒光單元與磁共振成像單元生成do3a-gd-ca1探針前后的光譜特征：

在水體系(水-乙腈，1∶9，v/v，ph＝7.4)中，熒光單元ca1紫外-可見光譜的最大吸收峰在402nm，加入等摩爾量的磁共振成像單元(do3a-gd)后，該吸收峰紅移到430nm處(附圖1a)，ca1熒光光譜的最大發(fā)射峰在460nm，加入等摩爾量的磁共振成像單元(do3a-gd)后，該發(fā)射峰淬滅了81.5％，同時紅移了12nm(附圖1b)。通過“benesi-hildebrand”工作曲線(附圖1c)，進一步證明熒光單元ca1與do3a-gd按照1∶1的計量比配位。通過監(jiān)測探針在水介質(zhì)中最大發(fā)射峰強度隨時間的變化(附圖1d)，表明探針具有較好的動力學穩(wěn)定性。

3、do3a-gd-ca1探針檢測水樣中的氟離子

氟離子與磁共振/熒光雙模態(tài)氟離子探針do3a-gd-ca1探針作用后，通過競爭作用置換出配位的水分子或(和)熒光基團，同時誘導熒光單元內(nèi)電子或電荷遷移以及增加了gd(iii)內(nèi)層配位水分子數(shù)，同步激活了磁共振和熒光雙模態(tài)響應信號，實現(xiàn)對氟離子的檢測。工作原理為：

①探針檢測氟離子的熒光光譜響應

量取3ml的探針(do3a-gd-ca1)(10μm)儲備液置于石英比色皿中，分別加入20倍的陰離子(f^-，br^-，i^-，h2po4^-，hso4^-，aco^-，no3^-，oh^-，cl^-，po4^3-)，用408nm的光激發(fā)，在460nm處測試其熒光強度。結果如附圖2(a)所示，加入氟離子后，取代下探針中的熒光單元ca1，探針的熒光強度升高5.2倍。探針do3a-gd-ca1表現(xiàn)出對氟離子良好的專一性，競爭陰離子均不會干擾氟離子的識別，如附圖2(b)所示。探針對氟離子的檢測限為70μm，低于國家生活飲用水衛(wèi)生標準設定的氟含量上限。

②探針檢測氟離子的紫外-可見光譜響應

探針do3a-gd-ca1(10μm)加入氟離子及各種競爭陰離子后的紫外-可見光譜測試與熒光光譜測試方法一致。結果如附圖3(a)所示，加入氟離子后，探針的吸收峰由402nm紅移到430nm處，而其他陰離子未引起探針吸收峰的明顯改變，如附圖3(b)所示。

③探針在水介質(zhì)中對氟離子的弛豫率響應

在水體系(水-乙腈，1∶9，v/v，ph＝7.4)中，測試探針do3a-gd-ca1(0.2mm)加入氟離子(0-0.5mm)及各種競爭陰離子的縱向弛豫率(r1)響應，并通過磁共振成像(mri)監(jiān)測響應的過程。響應效果如附圖4(a)所示，與氟離子作用后，探針的縱向弛豫率(r1)逐漸增加，由r1＝1.67mm^-1·s^-1增加到2.957mm^-1·s^-1。同時隨著氟離子濃度的增大，探針的t1-加權磁共振成像圖呈現(xiàn)逐漸變亮的效果，說明探針具備了磁共振造影活體內(nèi)氟離子的潛質(zhì)，而其他陰離子未引起t1-加權磁共振成像圖的明顯改變，如附圖4(b)所示。

4、do3a-gd-ca1探針的毒性和生物體內(nèi)實驗

1)探針do3a-gd-ca1的細胞毒性測試

選用mda-mb-231和u-343mga細胞株為模型，通過噻唑藍試驗法(mtt)測試探針do3a-gd-ca1的細胞毒性。實驗結果如附圖5(a)所示，表明探針do3a-gd-ca1對活體細胞具有較低的毒性，適合生物應用。

此外，探針do3a-gd-ca1(10μm)在ph4.0-11.0范圍內(nèi)效應效果理想，證明探針可應用在生理酸堿環(huán)境(附圖5b)。

2)探針do3a-gd-ca1檢測活體內(nèi)氟離子的磁共振成像

以裸鼠為活體模型，裸鼠皮下注射探針(0.2ml，0.2mm)，然后在原位皮下注射氟離子(0.5mm)，獲取對應的t1-加權磁共振造影圖，研究探針檢測活體內(nèi)氟離子的性能。探針在體內(nèi)具有合適的滯留時間，可實現(xiàn)活體內(nèi)持續(xù)增強mri成像，適用于臨床應用。結果如圖6所示，其中，圖6a為(a)空白裸鼠、(b)皮下注射探針試劑do3a-gd-ca1(0.2ml，0.2mm)、(c)繼續(xù)皮下注射0.5mm氟離子后的磁共振造影圖，說明探針在探測到氟離子后能夠通過t1-加權磁共振造影圖清晰的反映出來；圖6(b)分別為空白裸鼠、皮下注射探針do3a-gd-ca1(0.2ml，0.2mm)后0、4、8、12小時對應的磁共振造影圖，說明探針在體內(nèi)具有合適的滯留時間。

實施例2

r＝-h，-oh和-o(ch2)2o(ch2)2oh的磁共振/熒光雙模態(tài)探針的制備方法同實施例1，區(qū)別在于基于香豆素染料的熒光單元ca的制備原料。

其中，r＝-h的熒光單元ca2反應原料為3-肼基-香豆素和2，3-羥基-苯甲醛；

r＝-oh的熒光單元ca3反應原料為7-羥基-3-肼基-香豆素和2，3-羥基-苯甲醛；

r＝-o(ch2)2o(ch2)2oh的熒光單元ca4反應原料為7-(二乙基氨基)香豆素-3-甲酰肼和2，3-羥基-苯甲醛；

探針do3a-gd-ca2、do3a-gd-ca3、do3a-gd-ca4的應用方法同探針do3a-gd-ca1。