本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及dna包被液及其制備方法和dna包被方法。
背景技術(shù)：
將核酸或抗原抗體固定在固相載體表面的過程稱為包被。蛋白質(zhì)與聚苯乙烯固相載體是通過物理吸附結(jié)合的，靠的是蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)上的疏水基團與固相載體表面的疏水基團間的作用力，這種物理吸附是非特異性的，受蛋白質(zhì)的分子量、等電點、濃度等的影響。載體對不同蛋白質(zhì)的吸附能力是不相同的，大分子蛋白質(zhì)較小分子蛋白質(zhì)通常含有更多的疏水基團，故更易吸附到固相載體表面。igg對聚苯乙烯等固相具有較強的吸附力，其聯(lián)結(jié)多發(fā)生在fc段上，抗體結(jié)合點暴露于外，因此抗體的包被一般均采用直接吸附法。蛋白質(zhì)抗原大多也可采用與抗體相似的方法包被。
當(dāng)抗原決定簇存在于或鄰近于疏水區(qū)域時，抗原與固相載體的直接吸附可使抗原決定簇不能充分暴露，在這種情況下，直接包被效果不佳，可以采用間接的捕獲包被法，即先將針對該抗原的特異抗體作預(yù)包被，其后通過抗原抗體反應(yīng)使抗原固相化。此間接結(jié)合在固相上的抗原遠(yuǎn)離載體表面，其抗原決定簇也得以充分暴露。間接包被的抗原經(jīng)固相抗體的親和層析作用，包被在固相上的抗原純度大大提高，因此含雜質(zhì)較多的抗原也可采用捕獲包被法，試驗的特異性、敏感性均由此得以改善，重復(fù)性亦佳。間接包被的另一優(yōu)點是抗原用量少，僅為直接包被的1/10乃至于/100。
不易吸附在聚苯乙烯載體上的非蛋白質(zhì)抗原可采用特殊的包被方式。例如，在檢測抗dna抗體時，需用dna作為包被抗原，而普遍的固相載體一般不能直接與核酸結(jié)合?？蓪⒕郾揭蚁┌逑冉?jīng)紫外線照射(例如30w紫外燈，75cm照射12小時)，以增加其吸附性能。固相載體先用堿性蛋白質(zhì)，如聚賴氨酸、魚精蛋白等作預(yù)包被，也可提高核酸的結(jié)合力。也可用親和素生物素系統(tǒng)作間接包被，即用親和素先包被載體，然后加入生物素化的dna，這種包被方法均勻、牢固，已擴大應(yīng)用于各種抗原物質(zhì)的定量測定，但是這種方法比較繁瑣，而且費用較高，費時費力，不適合大規(guī)模的生產(chǎn)應(yīng)用。
目前，dna包被時采用的包被緩沖液有pbs緩沖液、cbs緩沖液、tris鹽緩沖液、咪脞緩沖液。但這些普通的包被液有如下缺點：①dna包被過程中孵育時間長，dna包被到聚苯乙烯板表面后不夠穩(wěn)定，保存時間相對較短。②聚苯乙烯載體不易吸附dna，需要對聚苯乙烯板進(jìn)行處理，過程比較繁瑣，而且效果得不到很好的保證。③耗費的時間流程太長，聚苯乙烯板的處理導(dǎo)致成本較高。因此，需要提供一種包被效率高、穩(wěn)定性好的dna包被液。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
有鑒于此，本發(fā)明提供了dna包被液及其制備方法和dna包被方法。本發(fā)明解決了微孔板包被dna效率低，費用高的問題降低了人工成本和能源消耗，這種高效的dna包被液可以快速將dna通過化學(xué)鍵結(jié)合的方式附在聚苯乙烯板的表面用于雜交，可以有效地將dna包被于微平板和微量樣品管表面。
為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：
本發(fā)明提供了一種dna包被液，由硫酸銨、氯化鈉和水組成。
本發(fā)明dna包被液可以快速將dna通過化學(xué)鍵結(jié)合的方式附在聚苯乙烯板的表面用于雜交，可以有效地將dna包被于固相載體表面，用于后續(xù)的雜交試驗。
作為優(yōu)選，以質(zhì)量百分比計，該dna包被液中各組分用量為：硫酸銨42.0％～43.0％，氯化鈉0.5％～0.8％，水補足。
在本發(fā)明提供的一具體實施例中，以質(zhì)量百分比計，dna包被液中各組分用量為：硫酸銨42.0％，氯化鈉0.6％，水補足。
在本發(fā)明提供的另一具體實施例中，以質(zhì)量百分比計，dna包被液中各組分用量為：硫酸銨42.5％，氯化鈉0.8％，水補足。
在本發(fā)明提供的另一具體實施例中，以質(zhì)量百分比計，dna包被液中各組分用量為：硫酸銨43.0％，氯化鈉0.5％，水補足。
作為優(yōu)選，該dna包被液的ph值為6.0～6.2。
在本發(fā)明提供的實施例中，dna包被液的ph值為6.1。
本發(fā)明還提供了該dna包被液的制備方法，包括：將硫酸鈉、氯化鈉溶解于水中，調(diào)節(jié)ph值至6.0～6.2，過濾除菌。
作為優(yōu)選，調(diào)節(jié)ph值采用的試劑為硫酸或氨水。
本發(fā)明還提供了一種dna的包被方法，包括：采用本發(fā)明提供的dna包被液作為緩沖液，將dna樣品與固相載體進(jìn)行孵育。
作為優(yōu)選，孵育的溫度為15～30℃，孵育的時間為15～25h。
在本發(fā)明提供的實施例中，孵育的溫度為室溫，孵育的時間為20h。
作為優(yōu)選，固相載體為聚苯乙烯固相載體。
在本發(fā)明提供的實施例中，固相載體為聚苯乙烯微平板或微量樣品管。
本發(fā)明還提供了一種原位雜交方法，包括如下步驟：
采用本發(fā)明的dna包被液作為緩沖液，將dna樣品與固相載體進(jìn)行孵育；
去除緩沖液，將包被有dna的固相載體進(jìn)行干燥；
將特定標(biāo)記的探針與包被有dna的固相載體進(jìn)行孵育；
檢測目的dna。
作為優(yōu)選，干燥為在10％濕度條件下干燥3h。
本發(fā)明提供了dna包被液及其制備方法和dna包被方法。該dna包被液由硫酸銨、氯化鈉和水組成。本發(fā)明至少具有如下有益效果之一：
1、本發(fā)明dna包被液可以快速將dna通過化學(xué)鍵結(jié)合的方式附在聚苯乙烯板的表面用于雜交，可以有效地將dna包被于微平板和微量樣品管等固相載體表面，用于后續(xù)的雜交試驗。
2、本發(fā)明dna包被液組成簡單，成本低，易于大量配制，適合大規(guī)模的生產(chǎn)應(yīng)用。
具體實施方式
本發(fā)明公開了dna包被液及其制備方法和dna包被方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動或適當(dāng)變更與組合，來實現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。
術(shù)語解釋：
包被：將核酸或者抗原抗體固定在微孔板上的過程稱為包被，換言之，包被即是核酸或者抗原抗體結(jié)合到固相載體表面的過程。
dna：脫氧核糖核酸，又稱去氧核糖核酸，是一種生物大分子，可組成遺傳指令，引導(dǎo)生物發(fā)育與生命機能運作。主要功能是信息儲存，可比喻為“藍(lán)圖”或“食譜”。其中包含的指令，是建構(gòu)細(xì)胞內(nèi)其他的化合物如蛋白質(zhì)與核糖核酸所需。帶有蛋白質(zhì)編碼的dna片段稱為基因。
本發(fā)明提供的dna包被液及其制備方法和dna包被方法中所用試劑均可由市場購得。
下面結(jié)合實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明：
實施例1dna包被液的制備
本實施例中dna包被液的配方如下：
制備方法為：
硫酸銨、氯化鈉、水按照上述質(zhì)量分?jǐn)?shù)混合溶解，調(diào)ph為6.1，過濾除菌。
實施例2dna包被液的制備
本實施例中dna包被液的配方如下：
制備方法為：
硫酸銨、氯化鈉、水按照上述質(zhì)量分?jǐn)?shù)混合溶解，調(diào)ph為6.0，過濾除菌。
實施例3dna包被液的制備
本實施例中dna包被液的配方如下：
制備方法為：
硫酸銨、氯化鈉、水按照上述質(zhì)量分?jǐn)?shù)混合溶解，調(diào)ph為6.2，過濾除菌。
試驗例1雜交試驗
微孔板：nuncmaxisorp微孔板。
試驗方法：合成一段引物：5’-cacttcactttctttccaagag-3’，把上述引物分別與實施例1制備的dna包被液、pbs、cbs、tris鹽緩沖液、咪脞緩沖液混合均勻，每孔100μl加入到nunc微孔板中，室溫放置20h，棄掉孔內(nèi)液體，微孔板在10％濕度下干燥3h保存，然后進(jìn)行雜交試驗，首先加入預(yù)放大分子，55℃孵育40分鐘；再加入放大分子，55℃孵育40分鐘；然后加入探針標(biāo)記物，50℃孵育40分鐘，最后加入底物，46℃孵育20min，用冷光儀測定其化學(xué)發(fā)光信號的光子數(shù)。按表1所示方式布板，其中，bl為空白，p1、p2、p3為單鏈dna陽性質(zhì)控。表2是微孔板各孔中的光子數(shù)檢測結(jié)果，表3為各個緩沖液包被效果的統(tǒng)計分析結(jié)果。
表1布板表
表2測定的光子數(shù)
表3不同包被液效果的方差分析結(jié)果
注：pv1.35代表陰陽性，pv1.35＞1.0為陽性，pv1.35＜1.0為陰性。
結(jié)論：
1、從實驗結(jié)果的光子來看，dna包被液包被的微孔板的空白和陽性質(zhì)控光子數(shù)有明顯的差別，而pbs、cbs、tris鹽緩沖液、咪脞緩沖液包被的微孔板并無明顯的區(qū)別。
2、從實驗的結(jié)果值來看，dna包被液包被的微孔板的陽性質(zhì)控p1、p2、p3結(jié)果值較高，而pbs、cbs、tris鹽緩沖液、咪脞緩沖液包被的微孔板的陽性質(zhì)控p1、p2、p3結(jié)果值較低，有的甚至為陰性。
3、dna包被液包被的微孔板空白和陽性質(zhì)控的cv值能保持在5％以內(nèi)，而pbs、cbs、tris鹽緩沖液、咪脞緩沖液包被的微孔板cv值較大。
試驗例2雜交試驗
微孔板：康寧costar微孔板。
試驗方法：合成一段引物：5’-cacttcactttctttccaagag-3’，把上述引物分別與實施例1制備的dna包被液、pbs、cbs、tris鹽緩沖液、咪脞緩沖液混合均勻，每孔100μl加入到康寧微孔板中，室溫放置20h，棄掉孔內(nèi)液體，微孔板在10％濕度下干燥3h保存，然后進(jìn)行雜交試驗，首先加入預(yù)放大分子，55℃孵育40分鐘；再加入放大分子，55℃孵育40分鐘；然后加入探針標(biāo)記物，50℃孵育40分鐘，最后加入底物，46℃孵育20min，用冷光儀測定其化學(xué)發(fā)光信號的光子數(shù)。(試驗方法同nuncmaxisorp微孔板)。按表1所示方式布板。表4是微孔板各孔中的光子數(shù)檢測結(jié)果，表5為各個緩沖液包被效果的統(tǒng)計分析結(jié)果。
表4測定的光子數(shù)
表5不同包被液效果的方差分析結(jié)果
注：pv1.35代表陰陽性，pv1.35＞1.0為陽性，pv1.35＜1.0為陰性。
結(jié)論：
1、從實驗結(jié)果的光子來看，dna包被液包被的微孔板的空白和陽性質(zhì)控光子數(shù)有明顯的差別，而pbs、cbs、tris鹽緩沖液、咪脞緩沖液包被的微孔板并無明顯的區(qū)別。
2、從實驗的結(jié)果值來看，dna包被液包被的微孔板的陽性質(zhì)控p1、p2、p3結(jié)果值較高，而pbs、cbs、tris鹽緩沖液、咪脞緩沖液包被的微孔板的陽性質(zhì)控p1、p2、p3結(jié)果值較低，有的甚至為陰性。
3、dna包被液包被的微孔板空白和陽性質(zhì)控的cv值能保持在5％以內(nèi)，而pbs、cbs、tris鹽緩沖液、咪脞緩沖液包被的微孔板cv值較大。
試驗例3
參照試驗例1方法檢測實施例2、3包被液的包被效果，其結(jié)果如下：
表6本發(fā)明實施例2、3包被液效果的方差分析結(jié)果
注：pv1.35代表陰陽性，pv1.35＞1.0為陽性，pv1.35＜1.0為陰性。
結(jié)果顯示，實施例2、3包被液的包被效果與實施例1包被效果相近，具有包被效果高、穩(wěn)定性好的特點。
以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。