本發(fā)明涉及一種蛋白標(biāo)志物psg3在輔助診斷肝癌或消化道患者中的應(yīng)用，以及制備相應(yīng)的檢測試劑盒中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

原發(fā)性肝癌是全球第6位、中國第3位最常見的癌癥。據(jù)國際癌癥研究中心(iarc)估計，2000年全球肝癌發(fā)病數(shù)為56.4萬人，其中約55％發(fā)生在中國，即中國肝癌發(fā)病30.6萬人，肝癌死亡30.0萬，占我國居民腫瘤死亡的第二位。肝癌出現(xiàn)癥狀時多屬中晚期，切除后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移率高。因此，肝癌的早期診斷對延長患者的生存時間和降低肝癌死亡率具有重要意義。

目前，影像學(xué)診斷、細胞與組織學(xué)診斷及化學(xué)診斷是腫瘤診斷的三大主要方法。影像學(xué)診斷在肝癌診斷中起重要的作用，但是在診斷小肝癌及區(qū)分良惡性結(jié)節(jié)中均具有一定的局限。超聲檢查或ct陽性結(jié)果，結(jié)合血清甲胎蛋白(α-fetoprotein，afp)水平高于400ng/ml的檢測結(jié)果，可對肝癌做出確診。但是，通常當(dāng)這些條件都符合時，已經(jīng)錯過了治療的最佳時機。無論是超聲波檢查、ct掃描還是核磁共振，對小病灶的鑒定都有一定的局限性，尤其是肝硬化結(jié)節(jié)在影象學(xué)上與小肝癌結(jié)節(jié)有許多的相似之處。因此，雖然影像學(xué)技術(shù)取得了巨大的進步，但臨床上仍需結(jié)合肝癌的分子標(biāo)志物，在較為復(fù)雜的病例中將良惡性肝病進行區(qū)分。此外，腫瘤的臨床分期及腫瘤大小是肝癌治療效果的決定因素，因此，腫瘤標(biāo)志物還可用于肝癌危險人群(如hbv慢性攜帶者和肝硬化患者)的普查。

目前肝癌診斷最常用的標(biāo)志物是甲胎蛋白(afp)，在癥狀和影像學(xué)改變發(fā)生前數(shù)月即可出現(xiàn)異常。正常人血清中afp含量一般小于10ng/ml。當(dāng)afp的診斷值定為20ng/ml時，其敏感性為50～60％，但在腫瘤較小的病例中，敏感性顯著降低，有報道僅為40％。單獨使用afp作為肝癌診斷標(biāo)志物的另一個問題是缺乏特異性，在相當(dāng)多的慢性肝炎患者尤其是肝硬化患者中，afp含量也達20-200ng/ml。目前認為可與afp互補診斷的標(biāo)志物有afp異質(zhì)體、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶同工酶ii和異常凝血酶原等，但由于它們在敏感性和特異性上的不足，以及檢測方法的繁瑣復(fù)雜，使其始終停留在實驗室研究水平，未能轉(zhuǎn)化成臨床常規(guī)檢查項目。因此，探索新的腫瘤分子標(biāo)志物，以及建立相應(yīng)的易于推廣的檢測方法，仍是當(dāng)今肝癌研究領(lǐng)域的重要課題之一。

同樣，消化道腫瘤在我國也是導(dǎo)致死亡的主要病因之一。其中的結(jié)直腸癌起病隱匿，早期常無明顯的臨床癥狀，而且病情發(fā)展較慢，病人出現(xiàn)明顯癥狀時大多已經(jīng)到了中晚期。目前，結(jié)腸的治療主要是以手術(shù)為主，但結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移后的化療效果差，術(shù)后約有40％的患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)，且晚期患者術(shù)后生存率較低。盡管有許多學(xué)者已經(jīng)做了大量的關(guān)于結(jié)腸癌分子水平的研究，但是目前仍然缺乏有效地早期診斷結(jié)腸癌的分子標(biāo)志物。腫瘤標(biāo)志物可以有效地作為臨床診斷依據(jù)，可以監(jiān)測高危人群、早期診斷、指導(dǎo)治療、判斷治療療效、檢測復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移，是腫瘤患者的重要檢查指標(biāo)、具有重要的臨床意義。結(jié)腸癌的發(fā)生前期會有一段時間的癌前病變，如結(jié)腸息肉，因此在早期發(fā)現(xiàn)并阻斷或延遲癌癥的發(fā)展，有極其重要的意義。因此，尋找發(fā)現(xiàn)有價值的腫瘤標(biāo)志物對于提高消化道腫瘤、尤其是結(jié)直腸癌的診斷和預(yù)測發(fā)生、發(fā)展及改善預(yù)后具有重要的臨床指導(dǎo)意義。

人類血液中包含豐富的各種細胞成分和分子物質(zhì)，能很好地反映機體不同組織和器官的生理、病理狀態(tài)，且其標(biāo)本容易獲得，因此，是一種理想的腫瘤無創(chuàng)診斷手段。因此，仍有待開發(fā)敏感性和特異性良好的標(biāo)志物。

妊娠特異蛋白3(humanpregnancyspecificbeta-1-glycoprotein3，psg3)，是一種分泌到細胞外的糖蛋白。psg家族中共包含11個蛋白，包括psg1、psg2、psg3等。psg蛋白一般都包括n端同免疫球蛋白可變區(qū)類似的結(jié)構(gòu)，隨后是2-3個免疫球蛋白恒定區(qū)c2樣結(jié)構(gòu)域，以及一個短的疏水尾，位于c端。psg根據(jù)其結(jié)構(gòu)組成可分為4類，i型(n-a1-a2-b2-c)、iia型(n-a1-b2-c)和iib型(n-a2-b2-c)、iii型(n-b2-c)、iv型(a1-b2-c)。目前psg家族的作用機制尚不清楚，在正常情況下，胎盤的合胞體滋養(yǎng)層細胞中大量表達，在妊娠期女性外周血中psg蛋白含量升高，可達200-400μg/ml。關(guān)于psg家族在癌癥中的研究鮮有報道。

psg3蛋白長度428個氨基酸，分子量47,945da，蛋白的氨基酸序列如下(seqidno：1)：

mgplsappctqritwkgllltalllnfwnlpttaqvtiea

eptkvskgkdvlllvhnlpqnlagyiwykgqmkdlyhyit

syvvdgqiiiygpaysgretvysnaslliqnvtredagsy

tlhivkrgdgtrgetghftftlyletpkpsisssnlypre

dmeavsltcdpetpdasylwwmngqslpmthslqlsknkr

tlflfgvtkytagpyeceirnpvsasrsdpvtlnllpklp

kpyitinnlnprenkdvlaftcepksenytyiwwlngqsl

pvsprvkrpienrililpsvtrnetgpyqceiqdryggir

sypvtlnvlygpdlpriypsftyyhsgenlylscfadsnp

paeyswtingkfqlsgqklfipqittkhsglyacsvrnsa

tgmessksmtvkvsapsgtghlpglnpl

有關(guān)psgs在腫瘤中的研究報道較少。salahshor等應(yīng)用差異基因表達譜分析發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌、肝轉(zhuǎn)移癌、子宮腫瘤組織中均可檢測到異常升高的psg9轉(zhuǎn)錄本，與正常結(jié)直腸粘膜相比，psg9在腺瘤中上調(diào)2倍，且結(jié)直腸癌psg9表達異常上調(diào)呈apc突變依賴性(salahshoretal,2005)。kamarlizp等的研究表明，psg1在骨惡性腫瘤患者血清中蛋白濃度升高(kamarlietal,2004)。而關(guān)于psg3在腫瘤中的研究還未見報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明第一方面涉及檢測psg3蛋白的分子在制備用于輔助診斷癌癥，尤其是肝癌或消化道癌癥患者的試劑盒或檢測試劑中的用途。

根據(jù)本發(fā)明第一方面任一項的用途，其中所述檢測psg3蛋白的分子是指能夠特異性檢測psg3蛋白表達的分子，例如可以為核酸、蛋白質(zhì)或化合物。

根據(jù)本發(fā)明第一方面任一項的用途，其中所述蛋白質(zhì)為抗體，其能夠與psg3蛋白特異性結(jié)合，優(yōu)選為單克隆抗體。

在本發(fā)明的實施方案中，所述檢測psg3蛋白的分子為單克隆抗體，其能夠與psg3蛋白特異性結(jié)合。

在本發(fā)明的具體實施方案中，采用免疫化學(xué)的方法檢測psg3蛋白。

根據(jù)本發(fā)明第一方面任一項的用途，其中所述的肝癌為肝細胞肝癌。

根據(jù)本發(fā)明第一方面任一項的用途，其中所述的消化道癌癥為結(jié)直腸癌。

根據(jù)本發(fā)明第一方面任一項的用途，所述試劑盒或檢測試劑用于血漿樣品的檢測。

根據(jù)本發(fā)明第一方面任一項的用途，其中所述輔助診斷的判斷方法為，血漿中psg3的含量高于551.65μg/ml，則待檢者為候選的肝細胞肝癌或結(jié)直腸癌患者。

根據(jù)本發(fā)明第一方面任一項的用途，其中所述檢測psg3蛋白的分子還帶有可檢測的標(biāo)記。

根據(jù)本發(fā)明第一方面任一項的用途，其中所述試劑盒或檢測試劑中還含有緩沖液及顯色劑。

根據(jù)本發(fā)明第二方面涉及一種用于輔助診斷癌癥，尤其是肝癌或消化道癌癥的試劑盒或檢測試劑，其含有檢測標(biāo)記物psg3蛋白的產(chǎn)品。

根據(jù)本發(fā)明第二方面涉及一種用于輔助診斷癌癥，尤其是肝癌或消化道癌癥的試劑盒或檢測試劑，所述檢測標(biāo)記物psg3蛋白的產(chǎn)品是指能夠特異性檢測psg3蛋白表達的分子，例如可以為核酸、蛋白質(zhì)或化合物。

根據(jù)本發(fā)明第二方面任一項的試劑盒或檢測試劑，其中所述蛋白質(zhì)為抗體，其能夠與psg3蛋白特異性結(jié)合，優(yōu)選為單克隆抗體。

在本發(fā)明的實施方案中，所述檢測psg3蛋白的分子為單克隆抗體，其能夠與psg3蛋白特異性結(jié)合。

在本發(fā)明的具體實施方案中，采用免疫化學(xué)的方法檢測psg3蛋白。

根據(jù)本發(fā)明第二方面任一項的試劑盒或檢測試劑，其中所述的肝癌為肝細胞癌，所述的消化道癌癥為結(jié)直腸癌。

根據(jù)本發(fā)明第二方面任一項的試劑盒或檢測試劑，所述試劑盒或檢測試劑用于血漿樣品的檢測，優(yōu)選地，所述檢測方法為免疫化學(xué)方法。

根據(jù)本發(fā)明第二方面任一項的試劑盒或檢測試劑，其中所述輔助診斷的判斷方法為，血漿psg3蛋白表達高于551.65μg/ml，則待檢者為候選的肝細胞肝癌或結(jié)直腸癌患者。

根據(jù)本發(fā)明第二方面任一項的試劑盒或檢測試劑，其中所述檢測psg3蛋白的分子還帶有可檢測的標(biāo)記。

根據(jù)本發(fā)明第二方面任一項的試劑盒或檢測試劑，其中所述試劑盒或檢測試劑中還含有緩沖液及顯色劑。

在本發(fā)明中，其中所述檢測psg3蛋白的分子是指能夠檢測psg3蛋白是否過表達的分子，例如可以為核酸、蛋白質(zhì)或化合物。

在本發(fā)明中，可以采用本領(lǐng)域公知的方法制備抗體。

可以使用免疫測定的方法定量或定性檢測蛋白標(biāo)志物的存在。所述免疫測定通常包括將生物樣品與抗體一起孵育，并通過多種熟知技術(shù)檢測結(jié)合抗體。

在本發(fā)明中，所述化合物具有本領(lǐng)域公知的含義，其可以和psg3蛋白特異性結(jié)合，進而用于檢測psg3蛋白的表達。

在本發(fā)明中，所述檢測psg3蛋白的分子上可以連接有可檢測的標(biāo)記分子。

在本發(fā)明中，所述試劑盒或檢測試劑中還可以包含能夠與檢測psg3蛋白的分子結(jié)合的分子，例如抗體，例如第二抗體，該分子也可以連接有可檢測的標(biāo)記分子。

在本發(fā)明中，所述可檢測的標(biāo)記分子例如可以為酶、熒光素、金屬離子或同位素等。

附圖說明

圖1a為psg3區(qū)分正常人和肝細胞肝癌患者(hcc)的roc曲線。

圖1b為psg3區(qū)分正常人和結(jié)直腸癌患者(cc)的roc曲線。

具體實施方式

下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明的實施方案進行詳細描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

實施例1制備psg3檢測的elisa試劑盒

采用大腸桿菌原核表達psg3蛋白，表達載體為pet30a。取5-6周齡balb/c小鼠，利用psg3全長蛋白作為抗原添加弗氏佐劑免疫制備psg3抗體。每只小鼠免疫4次，每次間隔2周，每次利用15-30μg抗原蛋白，第一次免疫注射時利用完全佐劑，后三次利用不完全佐劑。細胞融合前三天，從三只脾細胞供體小鼠挑選一只進行靜脈注射psg3抗原做進一步免疫。細胞融合、雜交瘤篩選均依據(jù)j.m.davis的方法(davisetal1982)。簡略過程如下：加強免疫后的小鼠脾細胞和sp2/0骨髓瘤細胞混合，慢慢加入促融合劑50％聚乙二醇0.7ml。37℃培養(yǎng)1min，10mlimdm培養(yǎng)基稀釋，低速離心。然后用40ml含1.25％甲基纖維素、25％胎牛血清、2％hat(含次黃嘌呤、甲氨蝶呤和胸腺嘧啶核苷)的imdm培養(yǎng)基重懸。上下顛倒混合，轉(zhuǎn)移到35mm平板中，每板約2ml，于37℃、5％co2環(huán)境中培養(yǎng)。7天后克隆轉(zhuǎn)移入96孔板，加入含15％胎牛血清和2％ht(含次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷)的imdm培養(yǎng)基再次培養(yǎng)。當(dāng)細胞融合度達到50％～70％，收集培養(yǎng)基上清，利用elisa和westernblot檢測是否存在抗體。

建立檢測psg3抗原的酶標(biāo)雙抗體夾心法。檢測psg3抗原的酶標(biāo)雙抗體夾心法的建立：首先利用小鼠腹腔生產(chǎn)單克隆抗體，將得到的陽性雜交瘤細胞分別注入小鼠腹腔，使其產(chǎn)生腹水，注射降植烷，每只小鼠0.5ml；注射降植烷1周后，注射雜交瘤細胞，每只小鼠注射10⁶個細胞。7-10天后分別收集腹水，用正辛酸-硫酸銨沉淀法分別提純抗體，再用過碘酸鈉法將抗體分別進行辣根過氧化物酶標(biāo)記(酶標(biāo)抗體)。用純化的單克隆抗體分別包被酶標(biāo)板，并分別與酶標(biāo)抗體配對檢測psg3抗原，獲得最佳配對的包被抗體p201以及酶標(biāo)捕獲抗體p209。其中包被抗體p201和酶標(biāo)的捕獲抗體p209分別由雜交瘤細胞株p201和p209制備產(chǎn)生。雜交瘤細胞系p201和p209已于2015年11月27日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏號分別為cgmccno.11597和cgmccno.11598，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路一號院3號。

elisa步驟如下：將psg3包被抗體p201包被96孔酶標(biāo)板，100μl/孔，4℃過夜；甩去包被抗體，0.5％pbst洗板3次，加入2％bsa封閉液，室溫4小時；甩去封閉液，0.5％pbst洗板3次，酶標(biāo)板中每孔分別加入psg3標(biāo)準(zhǔn)蛋白和待測樣本，100μl/孔；再加入psg3酶標(biāo)抗體p209，100μl/孔，混勻后4℃過夜；甩去反應(yīng)液體，0.5％pbst洗板5次，加入tmb顯色液，200μl/孔，避光反應(yīng)15分鐘；加入2m硫酸終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀od450nm處檢測吸光度；利用標(biāo)準(zhǔn)蛋白吸光度的值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計算待測樣本中psg3的蛋白濃度。

實施例2在大規(guī)模的腫瘤患者和正常人群血漿樣本中檢測psg3的蛋白濃度

利用制備的elisa試劑盒在懷孕婦女血漿中檢測psg3蛋白的濃度。檢測的樣本包括：11例懷孕早期婦女(11-12周)，17例懷孕晚期婦女(28-38周)。elisa的結(jié)果如表1顯示，psg3在懷孕早期婦女血漿中的蛋白濃度顯著高于懷孕晚期(p<0.001)。

表1.psg3在懷孕婦女血漿中的蛋白濃度(μg/ml)

利用制備的elisa試劑盒在大規(guī)模的腫瘤患者和正常人群血漿樣本中檢測psg3的蛋白濃度。檢測的樣本包括：178例肝細胞肝癌(hepatocarcinoma,hcc)，121例肺癌(lungcancer,lc)，159例卵巢癌(ovariancancer，oc)，88例結(jié)直腸癌(colorectalcancer，cc)，以及115例年齡與性別比例匹配的健康正常人(healthcontrol)。elisa的結(jié)果顯示，psg3在肝細胞肝癌、結(jié)直腸癌患者和肺癌患者的血漿蛋白水平顯著高于正常對照組(p<0.001，表2)。

表2.psg3在各組腫瘤患者和正常人群血漿中的蛋白濃度(μg/ml)

實施例3psg3血漿蛋白濃度在輔助診斷肝細胞癌或消化道癌癥中的作用

當(dāng)psg3血漿蛋白濃度值為551.65μg/ml時，檢測肝細胞肝癌的敏感性為64.2％，特異性為74.8％，roc曲線下面積為0.774，95％ci＝0.719-0.828，p<0.001(圖1a)。同一組肝癌病人血漿中也檢測了肝細胞肝癌標(biāo)志物甲胎蛋白(alpha-fetalprotein，afp)的水平。當(dāng)使用臨床常規(guī)檢測限值為25ng/ml時，肝細胞肝癌afp陰性的病人為107例，占標(biāo)本總數(shù)的60.1％(107/178)。而在此107例afp陰性的肝癌病人中，psg3陽性(血漿中psg3蛋白濃度>551.65μg/ml)的病例數(shù)為66例，提高了肝癌病人的檢出率，臨床上可以輔助肝細胞肝癌病人的診斷率。

當(dāng)psg3血漿蛋白濃度值為551.65μg/ml時，檢測結(jié)直腸癌(n＝88)的敏感性為92.0％，特異性為74.8％，roc曲線下面積為0.873，95％ci＝0.819-0.828，p<0.001(圖1b)。這88例病人血漿也檢測了結(jié)直腸癌標(biāo)志物癌胚抗原(carcinoembryonicantigen，cea)的蛋白水平。當(dāng)使用臨床常規(guī)檢測限值為5ng/ml時，結(jié)直腸癌患者中cea陰性的病人為67例，占標(biāo)本總數(shù)的76.1％(67/88)。而在此67例cea陰性的結(jié)直腸癌病人中，psg3陽性(血漿中psg3蛋白濃度>551.65μg/ml)的病例數(shù)為60例，顯著的提高了結(jié)直腸癌病人的檢出率，臨床上有較好的應(yīng)用前景。

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