本發(fā)明涉及一種沙丁胺醇免疫磁珠試劑盒及其對(duì)樣品中沙丁胺醇的分離富集方法。屬于免疫學(xué)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

沙丁胺醇(salbutamol,sal)，又名舒喘靈，為選擇性β-受體激動(dòng)劑，能選擇性激動(dòng)支氣管平滑肌的β-受體，有較強(qiáng)的支氣管擴(kuò)張作用。用于預(yù)防支氣管哮喘。實(shí)驗(yàn)證實(shí)sal能夠促進(jìn)動(dòng)物骨骼肌生長(zhǎng)，減少脂肪蓄積。人食用含沙丁胺醇較高的動(dòng)物組織后會(huì)出現(xiàn)肌肉顫動(dòng)、肌痛、頭痛、惡心、嘔吐等中毒癥狀。在鹽酸克侖特羅的非法使用受到了極大限制后，不法分子不得不尋找新的替代品，如沙丁胺醇、西馬特羅等。因而，國(guó)內(nèi)外有部分養(yǎng)殖場(chǎng)非法使用本類(lèi)藥物。我國(guó)農(nóng)業(yè)部發(fā)布的《食品動(dòng)物禁用的獸藥及其它化合物清單》明確規(guī)定沙丁胺醇等β-興奮劑被禁止所有用途，禁用所有食品動(dòng)物。

目前，對(duì)于沙丁胺醇的殘留檢測(cè)主要有高效液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析法、氣相色譜-質(zhì)譜法、毛細(xì)管區(qū)帶電泳法等方法。由于上述檢測(cè)方法的樣品前處理均需要使用凈化裝置，包括c18柱、石墨化碳固相萃取柱、弗羅里硅土固相萃取柱、硅膠spe固相萃取柱等。上述固相萃取柱價(jià)格昂貴，約為500-2000元/支，且凈化步驟繁瑣，需要多種有機(jī)溶劑。沙丁胺醇免疫磁珠分離技術(shù)由于內(nèi)含fe3o4的納米磁珠的表面修飾官能團(tuán)可與沙丁胺醇特異性單克隆抗體結(jié)合構(gòu)成沙丁胺醇免疫磁珠，通過(guò)外加磁場(chǎng)利用抗體的特異性免疫反應(yīng)從混合溶液中富集和分離沙丁胺醇，沙丁胺醇免疫磁珠的凈化載體為分散狀，可提高特異性單克隆抗體與檢測(cè)靶物質(zhì)的結(jié)合概率，從而提高樣品中沙丁胺醇的回收率，增加了沙丁胺醇檢測(cè)方法的準(zhǔn)確度。免疫磁珠的磁珠與抗體之間的結(jié)合鍵為化學(xué)結(jié)合鍵，結(jié)合程度較為牢固；免疫親和柱是利用抗原和抗體的特異性結(jié)合性質(zhì)的特殊的spe小柱?？贵w與載體存在的共價(jià)鍵為疏水作用力及離子交換作用力等物理結(jié)合力，其結(jié)合力度沒(méi)有免疫磁珠的化學(xué)結(jié)合鍵的結(jié)合力度大。而且免疫親和柱的載體為固相，抗體與檢測(cè)靶物質(zhì)的結(jié)合概率與免疫磁珠相比較會(huì)低。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于提供一種沙丁胺醇免疫磁珠分離富集試劑盒，采用該試劑盒進(jìn)行樣品中沙丁胺醇的分離富集時(shí)具有較高的特異性、回收率和準(zhǔn)確度，簡(jiǎn)化樣品前處理步驟，避免樣品前處理過(guò)程中使用多種和大量的有機(jī)溶劑。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種沙丁胺醇免疫磁珠分離富集試劑盒，其包括偶聯(lián)沙丁胺醇單克隆抗體的磁珠、復(fù)溶液和磁鐵，所述偶聯(lián)沙丁胺醇單克隆抗體的磁珠是由沙丁胺醇單克隆抗體與磁珠的質(zhì)量比為1：500～600混合并溶于2-(n-嗎啉代)乙磺酸一水合物中偶聯(lián)制備而成，所述沙丁胺醇單克隆抗體是由沙丁胺醇半抗原與牛血清白蛋白得到的偶聯(lián)物作為免疫原免疫balb/c小鼠制備獲得。

所述沙丁胺醇半抗原是由沙丁胺醇與氨基苯甲酸經(jīng)重氮化反應(yīng)，在酚羥基旁邊引入帶羧基間隔臂得到的，沙丁胺醇半抗原得率為87％，其結(jié)構(gòu)式如式ⅰ所示。

所述復(fù)溶液含有0.2％牛血清白蛋白、0.04％吐溫-20以及0.02％nan3的磷酸鹽緩沖液或ph7.4的三羥甲基氨基甲烷緩沖液，所述百分含量均為質(zhì)量百分含量，所述偶聯(lián)沙丁胺醇單克隆抗體的磁珠在復(fù)溶液中保存。

所述磁鐵產(chǎn)生外加磁場(chǎng)，使偶聯(lián)沙丁胺醇單克隆抗體的磁珠聚集在磁鐵上，達(dá)到分離磁珠的目的。

本發(fā)明還提供了分離富集樣品中沙丁胺醇的方法，包括下列步驟：

1)用試劑盒進(jìn)行樣品中沙丁胺醇的分離富集；

2)將富集有沙丁胺醇的偶聯(lián)沙丁胺醇單克隆抗體的磁珠用甲醇洗脫，回收甲醇液，用于檢測(cè)分析。

本發(fā)明的有益效果如下：

1)本發(fā)明試劑盒的具有較高的特異性和準(zhǔn)確性，對(duì)沙丁胺醇的捕獲濃度可達(dá)到20ng/mg(每毫克免疫磁珠可以捕獲20ng沙丁胺醇)，樣品添加回收率≥85％；

2)本發(fā)明試劑盒中的偶聯(lián)沙丁胺醇單克隆抗體的磁珠與液體經(jīng)磁力作用容易快速分離開(kāi)來(lái)，分離過(guò)程簡(jiǎn)單，可省去離心和過(guò)濾等繁瑣的操作過(guò)程，節(jié)約時(shí)間，在撤去外加磁場(chǎng)時(shí)，磁珠無(wú)磁性記憶，能夠均勻分散，不出現(xiàn)聚集現(xiàn)象；

3)磁珠具有一定的機(jī)械度和化學(xué)穩(wěn)定性，能耐受一定濃度的酸堿溶液和微生物的降解，其結(jié)構(gòu)內(nèi)的磁性物質(zhì)不易被氧化，磁性微粒的這種物理化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定特點(diǎn)，使其磁性不易下降；

4)磁珠的潤(rùn)洗和洗脫分別用去離子水和甲醇，0.1ml的偶聯(lián)沙丁胺醇單克隆抗體的磁珠只需1ml甲醇洗脫即可，所用試劑的量較少，磁珠的潤(rùn)洗和洗脫過(guò)程較環(huán)保。

附圖說(shuō)明

圖1為沙丁胺醇半抗原合成反應(yīng)式。

圖2為沙丁胺醇半抗原核磁共振氫譜圖。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1：試劑盒具體組分的制備

1.沙丁胺醇半抗原合成

沙丁胺醇半抗原是由沙丁胺醇與對(duì)氨基苯甲酸經(jīng)重氮化反應(yīng)，在酚羥基旁邊引入帶羧基的間隔臂，得到沙丁胺醇半抗原。

取0.5g對(duì)氨基苯甲酸，加入到300μl1mol/l的鹽酸溶液中，再加入4ml蒸餾水稀釋?zhuān)鋮s至0℃并攪拌，加入0.23g，繼續(xù)攪拌2h，得到重氮鹽溶液。取0.7g沙丁胺醇，用甲醇溶解，向其中加入0.21g氫氧化鈉，攪拌，加入重氮鹽溶液，繼續(xù)攪拌4h，停止反應(yīng)，加入稀鹽酸調(diào)節(jié)ph值至5.0，加乙酸乙酯萃取，分去水相，將有機(jī)相蒸干，加入乙醚重結(jié)晶得到沙丁胺醇半抗原產(chǎn)物0.61g，收率為87％。合成反應(yīng)式如圖1所示。取上述半抗原產(chǎn)物經(jīng)核磁氫譜測(cè)定，如圖2所示，化學(xué)位移δ＝11ppm的位置為羧基氫，化學(xué)位移δ＝8.21～8.41的位置為苯甲酸上苯環(huán)的氫，這些特征峰的存在證明偶聯(lián)成功，半抗原結(jié)構(gòu)正確。核磁鑒定結(jié)果：¹hnmr(cdcl3,300mhz)δ:11.0(s,1h,cooh),8.21-8.41(d,4h,arh),7.39(s,1h,arh),7.75(s,1h,arh),5.35(s,1h,oh),4.87(t,1h,-ch-),4.67(d,2h,ch2),3.65(s,1h,-oh),3.15(d,2h,-ch2),2.0(s,1h,-nh),1.27(d,9h,-ch3)。

2.免疫原的制備

取9mg沙丁胺醇半抗原，溶解于1mln,n-二甲基甲酰胺(dmf)中；取30mg二氯乙烷(edc)和n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)用0.2ml水充分溶解后，加入半抗原溶液中，室溫下攪拌24h，即可得到反應(yīng)液a；稱(chēng)取牛血清白蛋白(bsa)50ml，使之充分溶解在3.8mlph值為7.2的磷酸鹽緩沖液中，將反應(yīng)液a逐滴緩慢滴加到bsa溶液中，并于室溫下攪拌24h；用0.01mol/l的磷酸鹽緩沖液于4℃透析3天，每天換3次透析液，以除去未反應(yīng)的小分子物質(zhì)，得到沙丁胺醇免疫原；分裝，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3.沙丁胺醇單克隆抗體的制備

1)動(dòng)物免疫：用上述制備出的免疫原(rac-bsa)按100μg/只，以生理鹽水溶解免疫原與弗氏完全佐劑等體積混勻，頸背部皮下注射免疫6～8周齡balb/c雌鼠，初次免疫后第7、14、28天以免疫原與弗氏不完全佐劑等體積混勻，各追加免疫一次，融合前3天以免疫復(fù)合物100μg/只，不加弗氏佐劑再追加免疫一次。

2)細(xì)胞融合：按常規(guī)方法進(jìn)行，取免疫小鼠的脾細(xì)胞與處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的小鼠骨髓瘤細(xì)胞(sp2/0)混合，然后在45秒內(nèi)緩慢加入預(yù)熱的融合劑(peg4000)進(jìn)行融合，用hat培養(yǎng)基懸浮均勻，再加入適量的飼養(yǎng)細(xì)胞，培養(yǎng)于96孔培養(yǎng)板，于37℃，5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，5天后用ht培養(yǎng)基半換液，9天時(shí)候進(jìn)行全換液。

3)雜交瘤細(xì)胞的篩選：細(xì)胞融合后，待細(xì)胞長(zhǎng)到培養(yǎng)孔面積的1/4時(shí)，采用分步篩選法篩選雜交瘤細(xì)胞。初選采用間接elisa方法，以包被抗原(預(yù)先用方陣法常規(guī)滴定其最佳包被濃度和陽(yáng)性血清稀釋度)包被酶標(biāo)板，加入被測(cè)孔培養(yǎng)上清，孵育，清洗后加入沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液50μl，再加入細(xì)胞上清液50μl和羊抗鼠igg-hrp50μl，于37℃反應(yīng)30min，洗板，再加入底物液顯色液100μl，于25℃下避光反應(yīng)15min，再加入終止液50μl，測(cè)定od450nm值下降到對(duì)照孔的50％以下，判為陽(yáng)性，經(jīng)2～3次檢測(cè)都為陽(yáng)性的孔，立即用有限稀釋法進(jìn)行亞克隆化。

4)單克隆抗體制備：將2～3次亞克隆建株后的雜交瘤細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，收集上清液用間接elisa測(cè)定效價(jià)，凍存；并取8～10周齡balb/c小鼠腹腔注射液體石蠟0.5ml/只，7～10日后腹腔注射雜交瘤細(xì)胞1～2×10⁶/只，7～10日后抽取小鼠腹水，離心取上清，測(cè)定效價(jià)，并凍存?zhèn)溆谩?/p>

5.偶聯(lián)沙丁胺醇單克隆抗體的磁珠的制備

1)磁珠活化

表面有-cooh基團(tuán)的磁珠(購(gòu)于dynal，粒徑為2.8μm)，其含量是0.1eq/g～0.3eq/g，取100μl磁珠，用含有ph5.0、0.05％的吐溫-20的濃度為25mmol/l的2-(n-嗎啉)乙磺酸一水合物(mes)100ml洗滌兩次，磁分離后移除上清；磁珠活化前，用4℃貯存的上述mes溶液分別配制50mmol/l的edc和nhs溶液；分別向裝有磁珠的離心管中加入新配置的edc和nhs溶液各50μl，渦旋混勻，室溫活化30min；將離心管置于磁分離架上進(jìn)行磁分離4min，移除上清液，再向其中加入100μl、ph5.0、25mmol/l的mes清洗2～3次后即可得到表面有羧基活化的磁珠。所述百分含量為質(zhì)量百分含量。

2)偶聯(lián)沙丁胺醇單克隆抗體的磁珠的制備

將10μg沙丁胺醇單克隆抗體溶解到60μl、ph5.0、25mmol/l的mes中，向其中加入5mg活化的磁珠，或?qū)?μg沙丁胺醇單克隆抗體溶解到60μl、ph5.0、25mmol/l的mes中，向其中加入3mg活化的磁珠，并用上述濃度mes溶液調(diào)節(jié)總體積至100μl，輕柔地混勻磁珠與沙丁胺醇單克隆抗體；室溫條件下偶聯(lián)30min或4℃偶聯(lián)2h，該期間可利用渦旋儀使磁珠保持混勻狀態(tài)；離心管置于磁分離架上進(jìn)行磁分離5min，移除上清液；為了淬滅未反應(yīng)的-cooh，可加入100μl，ph7.2～ph7.6的三羥甲基氨基甲烷(tris)反應(yīng)15min或100μl、ph8.0、乙醇胺濃度為50mmol/l的磷酸鹽緩沖液封閉磁珠；用100μl、0.2％bsa、0.1％吐溫-20的磷酸鹽緩沖液清洗封閉好的磁珠3～5次，將磁珠復(fù)溶于含0.3％的bsa、0.08％吐溫-20、0.02％nan5的磷酸鹽緩沖液中，于2℃～8℃保藏。所述百分含量為質(zhì)量百分含量。

實(shí)施例2：試劑盒的組建

組建檢測(cè)沙丁胺醇磁免疫磁珠分離富集試劑盒，使其含有下列組分：

偶聯(lián)沙丁胺醇單克隆抗體的磁珠

復(fù)溶液

磁鐵

將偶聯(lián)沙丁胺醇單克隆抗體的磁珠加入到復(fù)溶液中，至終濃度為10mg/ml。

實(shí)施例3：試劑盒對(duì)樣品中沙丁胺醇的分離富集方法

1)取溶有偶聯(lián)沙丁胺醇單克隆抗體的磁珠復(fù)溶液0.1ml于10ml離心管中，用5ml去離子水潤(rùn)洗磁珠1-2次，將離心管在磁鐵上靜置2-3min，確保磁珠全部吸附在磁鐵上，每次用磁鐵分離磁珠和洗液；

2)將尿液樣品5ml加入到裝有潤(rùn)洗好的偶聯(lián)沙丁胺醇單克隆抗體磁珠的10ml的離心管中，混勻，室溫下反應(yīng)20min；或者將動(dòng)物組織、飼料樣品用均質(zhì)器均質(zhì)后，稱(chēng)取5.0±0.05g樣品至樣品瓶中，分別加入1.5±0.05g氯化鈉，20ml50％甲醇溶液，用渦旋儀渦旋5min，室溫下3000r/min離心5min，或靜置后取10ml上清液過(guò)濾代替離心過(guò)程，吸取5ml離心上清液/濾液，加入5ml去離子水，混勻，吸取離心上清液/濾液與去離子水的混合液5ml與偶聯(lián)沙丁胺醇單克隆抗體的磁珠混勻，在室溫下反應(yīng)20min；

3)反應(yīng)完成后，用磁鐵分離磁珠，用5ml去離子水清洗磁珠，清洗兩次；

4)將1ml甲醇加入到裝有經(jīng)過(guò)步驟3)清洗過(guò)的磁珠的10ml離心管中，混勻，靜置

1min，用磁鐵分離磁珠，回收甲醇溶液，用于檢測(cè)分析。

實(shí)施例4：試劑盒質(zhì)量的測(cè)定

1.試劑盒的捕獲量和回收率

試劑盒捕獲量的定義為：每毫克偶聯(lián)沙丁胺醇單克隆抗體的磁珠可以捕獲沙丁胺醇的最大量。制備沙丁胺醇濃度分別為10ng/ml、15ng/ml、20ng/ml、25ng/ml、30ng/ml樣品溶液，每份豬尿、牛尿、羊尿、飼料、豬肉、豬肝、牛肉、羊肉樣品溶液為1ml，取沙丁胺醇單克隆抗體免疫磁珠0.1ml分別加入至上述樣品中，用試劑盒進(jìn)行樣品中沙丁胺醇的分離和富集，并用沙丁胺醇酶聯(lián)免疫(elisa)檢測(cè)試劑盒對(duì)用偶聯(lián)沙丁胺醇單克隆抗體的磁珠處理過(guò)樣品進(jìn)行檢測(cè)，偶聯(lián)沙丁胺醇單克隆抗體的磁珠捕獲量和樣品添加回收率如表1所示：

表1偶聯(lián)沙丁胺醇單克隆抗體的磁珠捕獲量和樣品添加回收率結(jié)果

由表1可以看出，樣品中沙丁胺醇濃度為10ng/ml、15ng/ml和20ng/ml時(shí)，經(jīng)沙丁胺醇免疫磁珠分離富集試劑盒對(duì)樣品中沙丁胺醇分離富集后，再經(jīng)elisa檢測(cè)方法檢測(cè)，得出沙丁胺醇添加回收率范圍為87.0％-99.0％，當(dāng)樣品中沙丁胺醇濃度為25ng/ml和30ng/ml時(shí)，得出沙丁胺醇添加回收率范圍為62.0％-78.8％，表明沙丁胺醇免疫磁珠分離富集試劑盒對(duì)樣品中沙丁胺醇的捕獲量為20ng/ml。

2.特異性

以沙丁胺醇作為標(biāo)準(zhǔn)，設(shè)沙丁胺醇的交叉反應(yīng)率為100％，用于試劑盒交叉反應(yīng)性研究的藥物均為與沙丁胺醇結(jié)構(gòu)或者功能相似的競(jìng)爭(zhēng)藥物：克侖特羅、萊克多巴胺、苯乙醇胺a、溴氯布特羅、溴布特羅、特布他林、羥甲基沙丁胺醇、西馬特羅、妥布特羅、馬噴特羅、賽布特羅、克侖潘特、齊帕特羅、噴布特羅、克侖丙羅、馬布特羅、氯丙那林。豬尿、牛尿、羊尿、飼料、豬肉、豬肝、牛肉、羊肉樣品中分別添加上述18種藥物(包括沙丁胺醇)濃度為20ng/ml，按試劑盒步驟操作，對(duì)樣品中沙丁胺醇進(jìn)行分離富集后，利用elisa檢測(cè)方法對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果列于表2：

表2試劑盒特異性試驗(yàn)

從表2可以看出，試劑盒對(duì)沙丁胺醇具有較高的特異性，對(duì)與沙丁胺醇結(jié)構(gòu)或者功能相似的競(jìng)爭(zhēng)藥物均無(wú)交叉反應(yīng)。