本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物類免疫檢測試劑領(lǐng)域，具體涉及一種人表皮生長因子受體her-2/neu定量檢測試劑盒及其制備方法與應(yīng)用，更具體地說，是涉及一種基于磁微粒分離化學(xué)發(fā)光法定量檢測腫瘤標(biāo)志物人表皮生長因子受體her-2/neu的試劑盒及其制備方法，以及應(yīng)用該試劑盒定量檢測腫瘤標(biāo)志物人表皮生長因子受體her-2/neu的方法。
背景技術(shù)：
：人表皮生長因子受體her-2/neu基因是一種最初在化學(xué)物質(zhì)誘發(fā)的大鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的dna中被發(fā)現(xiàn)的原癌基因，也稱為c-erb2，其由922個腺嘌呤、1,382個胞嘧啶、1,346個鳥嘌呤和880個胸腺嘧啶組成，位于人染色體17q21上，編碼相對分子量為185kda的跨膜糖蛋白(p185)，由1255個氨基酸組成，720-987位屬于酪氨酸激酶區(qū)。her-2/neu蛋白是具有酪氨酸蛋白激酶活性跨膜糖蛋白，是egfr家族成員之一。her-2/neu基因?qū)儆谝环N胞內(nèi)具有酪氨酸激酶活性的細(xì)胞表面受體家族，且結(jié)構(gòu)上與表皮生長因子受體相關(guān)(erbb-1)。her-2/neu蛋白由胞外的配體結(jié)合區(qū)、單鏈跨膜區(qū)及胞內(nèi)的蛋白酪氨酸激酶區(qū)三部分組成，由于目前尚未發(fā)現(xiàn)能與her-2/neu蛋白直接結(jié)合的配體。其主要通過與家族中其他成員包括egfr(herl/erbbi)，her3/erbb3，her4/erbb4形成異二聚體而與各自的配體結(jié)合。her-2/neu蛋白常為異二聚體首選伴侶，且活性常強(qiáng)于其它異二聚體。當(dāng)與配體結(jié)合后，主要通過引起受體二聚化及胞漿內(nèi)酪氨酸激酶區(qū)的自身磷酸化。激活酪氨酸激酶的活性。her-2/neu蛋白介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑主要有ras/raf/分裂素活化蛋白激酶(mapk)途徑，磷脂酰肌醇3羥基激酶(p13k)/akt途徑，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活(stat)途徑和plc通路等。2her-2/neu蛋白在胃癌中的表達(dá)情況及影響因素her-2/neu蛋白通常只在胎兒時期表達(dá)，成年以后只在極少數(shù)組織內(nèi)低水平表達(dá)。然而在多種人類腫瘤中卻過度表達(dá)，如乳腺癌、卵巢癌、肺腺癌、原發(fā)性。腎細(xì)胞癌、子宮內(nèi)膜癌等，并提示預(yù)后不良。在胃癌細(xì)胞上her-2/neu蛋白主要定位在細(xì)胞膜上，少量表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)中。在胃癌中，常見her-2/neu基因擴(kuò)增和rna及蛋白質(zhì)的過度表達(dá)，但在所有非胃癌組織中均檢測不到，表明her-2/neu蛋白在胃癌的發(fā)生、發(fā)展和侵襲性轉(zhuǎn)移性上發(fā)揮著重要作用。her2癌基因的致瘤機(jī)制是抑制凋亡，促進(jìn)增殖；增加腫瘤細(xì)胞的侵襲力；促進(jìn)腫瘤血管新生和淋巴管新生。her2基因擴(kuò)增是影響乳腺癌生長與轉(zhuǎn)移的最重要的因素之一。在大約30％的乳腺癌中可出現(xiàn)her2基因過度表達(dá)，并與患者預(yù)后較差相關(guān)。her2過度表達(dá)的乳腺癌患者病情進(jìn)展迅速，化療緩解期短，內(nèi)分泌治療效果差，無病生存和總生存率低。her2的含量可作為一個獨(dú)立的強(qiáng)有力的預(yù)后指標(biāo)，尤其對那些腋窩淋巴結(jié)陽性的乳腺癌患者它甚至比目前常用的一些腫瘤指標(biāo)更有說服力。her2擴(kuò)增陽性的乳腺癌具有一些特殊的生物學(xué)和臨床特征，例如組織學(xué)分級更差、低er、pr水平、更多的非整倍體、更傾向于轉(zhuǎn)移至中樞神經(jīng)系統(tǒng)和內(nèi)臟、內(nèi)分泌治療無效、腫瘤的增殖指數(shù)更高、對阿霉素敏感等。目前把her2基因擴(kuò)增狀態(tài)作為乳腺癌藥物治療(環(huán)磷酰胺、阿霉素、5-氟尿嘧啶和赫賽汀)的主要參考指標(biāo)。由于只有her2過度表達(dá)和基因擴(kuò)增的乳腺癌患者用赫賽汀治療才有效，因此正確檢測和評定乳腺癌的her2基因擴(kuò)增狀態(tài)至關(guān)重要。fda批準(zhǔn)了赫賽汀和拉帕替尼兩種針對her2擴(kuò)增的腫瘤的靶向藥物。赫賽汀主要通過阻斷her2/src相互作用、引起her2受體下調(diào)和促進(jìn)抗體介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用而達(dá)到治療腫瘤的目的。her2基因擴(kuò)增陽性的轉(zhuǎn)移性乳腺癌中，25％的患者單藥治療有效，并且與其他化療藥聯(lián)合應(yīng)用具有協(xié)同作用，與阿霉素、環(huán)磷酰胺、紫杉醇聯(lián)合應(yīng)用可顯著延長患者無病生存期和總生存期。在er和her2均陽性的患者中，赫賽汀和激素聯(lián)合治療有效。her2蛋白通常只在胎兒時期表達(dá)，成年以后只在極少數(shù)組織內(nèi)低水平表達(dá)。然而有研究表明30％以上的人類腫瘤中存在her2基因的擴(kuò)增/過度表達(dá)(如乳腺癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、輸卵管癌、胃癌和前列腺癌等)；其中20％－30％的原發(fā)性浸潤性乳腺癌有her2基因的擴(kuò)增/過度表達(dá)。研究證實(shí)：her2的過度表達(dá)與腫瘤的發(fā)生和侵襲有關(guān)，可提高轉(zhuǎn)移的危險；轉(zhuǎn)染的細(xì)胞和動物模型證實(shí)，其可改變腫瘤對激素和化療藥物的敏感性。目前在乳腺癌中p185已經(jīng)被認(rèn)為是一個預(yù)后因子、預(yù)測因子和治療的靶蛋白。關(guān)于her2的血清學(xué)檢測意義：細(xì)胞表面her2蛋白胞外段會受蛋白酶裂解脫落進(jìn)入血液循環(huán)，循環(huán)中有her-2蛋白的胞外段的存在為血清學(xué)檢測her2提供了可能。目前檢測血清her2的方法有：酶聯(lián)免疫分析(eia)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(elisa)、化學(xué)發(fā)光免疫分析法等。近期發(fā)現(xiàn)的nids快速反應(yīng)法則有待進(jìn)一步研究。近來研究表明，血清學(xué)與組織學(xué)her2的檢測結(jié)果一致性較好，約有20％-30％乳腺癌患者血清中可溶性her2蛋白水平升高。血清her2可作為反映腫瘤生長、復(fù)發(fā)或者轉(zhuǎn)移的檢測指標(biāo)。高血清her2水平提示腫瘤的高侵襲性，與臨床分期、病情進(jìn)展、無瘤生存期和總生存期有關(guān)，并能監(jiān)測化療藥的治療效果，是重要的預(yù)后因素。通過檢測血清中her2的水平，有助于診斷、預(yù)測患者組織her2的狀態(tài)，在接受化療的晚期乳腺癌患者中監(jiān)測血清her2含量有助于預(yù)測療效、無病生存期和總生存期。在指導(dǎo)靶向藥物應(yīng)用方面，血清her2的檢測也可以作為組織學(xué)檢測的一個補(bǔ)充，并可能使靶向治療的適應(yīng)人群得以放寬。血清her2的檢測也可以作為重要的預(yù)后因素，可在乳腺癌隨訪監(jiān)測、療效觀察尤其是靶向治療后的療效觀察中發(fā)揮其獨(dú)到的作用。綜上所述，her2與乳腺癌的關(guān)系涉及到腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、診斷與鑒別診斷、治療和預(yù)后評價等方面，目前的研究取得一定進(jìn)展，使乳腺癌的診治上了一個新臺階。因此，有待開發(fā)對人表皮生長因子受體her-2/neu檢測靈敏度高與可靠性并能降低檢測成本的檢測技術(shù)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的一個目的在于針對上述現(xiàn)有技術(shù)檢測人表皮生長因子受體her-2/neu所存在的問題，提供一種新的可定量檢測人表皮生長因子受體her-2/neu的試劑盒，提高檢測靈敏度及可靠性，并降低成本，延長有效期。本發(fā)明的另一目的在于提供制備人表皮生長因子受體her-2/neu定量檢測試劑盒的方法。本發(fā)明的另一目的在于提供利用所述的試劑盒檢測人表皮生長因子受體her-2/neu的方法。一方面，本發(fā)明提供了一種人表皮生長因子受體her-2/neu定量檢測試劑盒，該試劑盒包括以下試劑組分：校準(zhǔn)品、磁分離試劑、酶反應(yīng)物、穩(wěn)定增強(qiáng)劑以及化學(xué)發(fā)光底物；其中：所述校準(zhǔn)品是按照以下方法配制得到的：將人表皮生長因子受體her-2/neu抗原溶解于含非離子表面活性劑的蛋白緩沖液中配制得到校準(zhǔn)品；其中，所述非離子表面活性劑選自tween20、tritonx100、bronidox中的一種或多種，非離子表面活性劑在蛋白緩沖液中的濃度為0.01％～0.5％；所述磁分離試劑是按照以下方法制備得到的：將鏈霉親和素和磁微粒偶聯(lián)制得鏈霉親和素磁微粒，利用長臂生物素標(biāo)記人表皮生長因子受體her-2/neu捕獲抗體制得生物素化抗體，然后將生物素化抗體與鏈霉親和素磁微粒免疫固定，制得磁分離試劑；所述酶反應(yīng)物包括堿性磷酸酶標(biāo)記的人表皮生長因子受體her-2/neu示蹤抗體；所述穩(wěn)定增強(qiáng)劑包括mak33和抗異嗜性抗體干擾的多組分免疫復(fù)合物，所述mak33在穩(wěn)定增強(qiáng)劑中的終濃度為80～120μg/ml；所述多組分免疫復(fù)合物是按照以下方法制備得到的：新生牛血清、小鼠血清、綿羊血清按1：1.5～2.5：0.4～0.6的體積比混合，加入硫酸銨沉淀過夜，離心，去上清，將沉淀溶于含0.5％牛血清白蛋白的pbsph7.2緩沖液中，70～75℃放置0.5～2小時，干燥，制得抗異嗜性抗體干擾的多組分免疫復(fù)合物；所述化學(xué)發(fā)光底物為經(jīng)緩沖液稀釋的aps-5化學(xué)發(fā)光底物。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，本發(fā)明的人表皮生長因子受體her-2/neu定量檢測試劑盒還可進(jìn)一步包括質(zhì)控品，質(zhì)控品的配制同標(biāo)準(zhǔn)品。具體地，該質(zhì)控品是按照以下方法配制得到的：將人表皮生長因子受體her-2/neu抗原稀釋至含非離子表面活性劑的蛋白緩沖液中配制得到質(zhì)控品；其中，所述非離子表面活性劑選自tween20、tritonx100、bronidox中的一種或多種，非離子表面活性劑在蛋白緩沖液中的濃度為0.01％～0.5％。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，本發(fā)明的人表皮生長因子受體her-2/neu定量檢測試劑盒中，所述校準(zhǔn)品是按照以下方法配制得到的(如包含質(zhì)控品，質(zhì)控品的具體配制也可按照該方法進(jìn)行)：將人表皮生長因子受體her-2/neu抗原溶解于pbsph7.2緩沖液中至0.5mg/ml，15分鐘后，加入終濃度為1mm賴氨酸反應(yīng)5～120分鐘；將上述反應(yīng)物，按不同濃度用含非離子表面活性劑的pbs蛋白緩沖液稀釋成不同濃度點(diǎn)，并定標(biāo)，得到校準(zhǔn)品；所述含非離子表面活性劑的pbs蛋白緩沖液組分為：磷酸二氫鈉50mm，氯化鈉75mm，tween200.02％，tritonx1000.03％，蔗糖1％，酪蛋白0.15％，牛血清白蛋白3％，proclin3000.02％，氫氧化鈉ph6.8。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，本發(fā)明的人表皮生長因子受體her-2/neu定量檢測試劑盒中，所述磁分離試劑是按照以下方法制備得到的：取磁微粒，加入mes緩沖液中，加入sulfo-nhs、edc，反應(yīng)，之后去上清，洗滌；加入人表皮生長因子受體her-2/neu包被抗體反應(yīng)過夜，備用；加入含bsa、蔗糖、聚乙二醇6000的pbsph7.2緩沖液，將磁微粒濃縮液置于平皿中，封閉；用ph6.0緩沖液洗滌數(shù)次；用含酪蛋白、牛血清白蛋白、tween20、proclin300的pbsph7.2緩沖液復(fù)溶；制得磁分離試劑。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，本發(fā)明的人表皮生長因子受體her-2/neu定量檢測試劑盒中，所述酶反應(yīng)物是按照以下方法配制得到的：堿性磷酸酶標(biāo)記人表皮生長因子受體her-2/neu示蹤抗體：將堿性磷酸酶透析至pbsph7.2緩沖液中；將人表皮生長因子受體her-2/neu示蹤抗體透析至pbsph6.8緩沖液中；在堿性磷酸酶溶液中加入預(yù)先用二甲基亞砜溶解的smcc溶液，反應(yīng)5分鐘后透析至pbsph7.2緩沖液，得活化的堿性磷酸酶溶液；在示蹤抗體溶液中加入預(yù)先用的用pbsph6.8緩沖液溶解的2-it溶液，反應(yīng)15分鐘后，透析至pbsph7.2緩沖液，得活化的示蹤抗體溶液；將活化的堿性磷酸酶溶液和活化的示蹤抗體溶液混合，反應(yīng)過夜，得堿性磷酸酶標(biāo)記的人表皮生長因子受體her-2/neu示蹤抗體；將上述堿性磷酸酶標(biāo)記的人表皮生長因子受體her-2/neu示蹤抗體稀釋至如下組分的緩沖液中：磷酸二氫鈉50mm、氯化鈉75mm、tween200.02％、蔗糖1％、酪蛋白0.15％、牛血清白蛋白0.5％、proclin3000.02％、氫氧化鈉ph6.8，制得所述酶反應(yīng)物。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，本發(fā)明的人表皮生長因子受體her-2/neu定量檢測試劑盒中，所述穩(wěn)定增強(qiáng)劑是按照以下方法配制得到的：制備抗異嗜性抗體干擾的多組分免疫復(fù)合物：將新生牛血清、小鼠血清、綿羊血清按1：2：0.5的體積比混合；加入終濃度為57％的飽和硫酸銨，4攝氏度過夜；次日將處理后的混合血清離心，去上清，將沉淀溶于含0.5％牛血清白蛋白的pbsph7.2緩沖液中，放置于溫箱中，72℃放置1小時；用pbsph7.2緩沖液稀釋至50mg/ml，分裝后冷凍干燥；按如下配方配制穩(wěn)定增強(qiáng)劑：磷酸二氫鈉50mm，氯化鈉75mm，三乙醇胺2％，多組分免疫復(fù)合物6μg/ml，mak33100μg/ml，酪蛋白0.15％，牛血清白蛋白0.5％，proclin3000.02％，氫氧化鈉ph6.8。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，本發(fā)明的人表皮生長因子受體her-2/neu定量檢測試劑盒中，所述化學(xué)發(fā)光底物是按照以下方法配制得到的：按1：4～10的比例將aps-5化學(xué)發(fā)光底物稀釋至下列組分的緩沖液中：三乙醇胺2％，二乙醇胺0.75％，ctab2％，n，n-二甲二叮呢硝酸鹽0.3％，牛血清白蛋白0.15％，bronidox0.5％，鹽酸ph9.5。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，本發(fā)明的人表皮生長因子受體her-2/neu定量檢測試劑盒，還進(jìn)一步包括清洗液。該清洗液主要是用于在檢測過程中清洗與磁分離試劑反應(yīng)后的樣品，清洗液的具體組分可以參照所屬領(lǐng)域的常規(guī)操作進(jìn)行。通常是磷酸二氫鈉、氯化納、tween20、proclin300的混合溶液，在試劑盒制品中可以濃縮清洗液的形式存在，檢測時適當(dāng)稀釋后使用。另一方面，本發(fā)明還提供了所述的人表皮生長因子受體her-2/neu定量檢測試劑盒的制備方法，該方法包括步驟：分別配制校準(zhǔn)品、磁分離試劑、酶反應(yīng)物、穩(wěn)定增強(qiáng)劑、以及化學(xué)發(fā)光底物；各試劑組分的配制參見前面的記載，此處不再贅述；將校準(zhǔn)品、磁分離試劑、酶反應(yīng)物、穩(wěn)定增強(qiáng)劑、化學(xué)發(fā)光底物等各試劑組分獨(dú)立地置于包裝容器內(nèi)，得到人表皮生長因子受體her-2/neu定量檢測試劑盒。另一方面，本發(fā)明還提供了利用所述的試劑盒定量檢測人表皮生長因子受體her-2/neu的方法，該方法包括步驟：—分別加30μl人表皮生長因子受體her-2/neu標(biāo)準(zhǔn)品、待測樣本至對應(yīng)試管底部；—加45μl酶反應(yīng)物至每一試管中；—加45μl穩(wěn)定增強(qiáng)劑至每一試管中；—加30μl磁分離試劑至每一試管中；—用塑料薄膜覆蓋試管，多管混勻器輕輕振蕩試管架30s后，置37℃水浴15分鐘；—試管連架放至磁分離器上，確保每支試管都與分離器表面接觸，沉淀2分鐘；緩慢的倒轉(zhuǎn)分離器倒出上清液，把倒轉(zhuǎn)的試管連同分離器一起放在濾紙上，用力拍擊分離器底部以除去粘在管壁上的所有液滴；—加清洗液至每一試管中，置多管混勻器上輕輕振蕩混勻；—加200μl化學(xué)發(fā)光底物溶液至試管中混勻3秒，迅速用準(zhǔn)備好的發(fā)光檢測儀進(jìn)行檢測。本發(fā)明的關(guān)鍵包括：采用重組的her-2/neu抗原作為標(biāo)準(zhǔn)品抗原，并稀釋至含非離子表面活性劑的蛋白緩沖組分中，增加其分散性，防止自身凝集，保持活性，效期至一年以上；將her-2/neu蛋白抗體和磁微粒偶聯(lián)，采用優(yōu)化的固定化方法，和封閉方法，使磁分離組分穩(wěn)定性良好，效期可至一年以上；采用異官能團(tuán)的兩步活化方法，分別活化抗體和堿性磷酸酶的氨基位點(diǎn)，再通過硫基的結(jié)合將活化的堿性磷酸酶和活化的抗體結(jié)合，結(jié)合效率優(yōu)異，自身交聯(lián)極低，提高了最終試劑盒的靈敏度和特異性性能；同時，采用公司自產(chǎn)的多組分免疫復(fù)合物和羅氏主動型干擾去除蛋白mak33聯(lián)用。通過含免疫復(fù)合物的特別組分體系可解決腫瘤標(biāo)志物夾心法檢測中異嗜性抗體干擾的問題，提高了終產(chǎn)品的特異性；在化學(xué)發(fā)光底物方面，采用靈敏度高和平臺穩(wěn)定期長的aps-5底物，并優(yōu)化化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)體系，保證了終產(chǎn)品的信號靈敏度高和穩(wěn)定性好、變異?。辉诒井a(chǎn)品中，上述組分經(jīng)過大量實(shí)驗(yàn)的工藝優(yōu)化，得到完善統(tǒng)一工藝，并嚴(yán)格按照的標(biāo)準(zhǔn)生產(chǎn)操作規(guī)程和質(zhì)量控制規(guī)程進(jìn)行生產(chǎn)。用戶僅需按照操作說明進(jìn)行規(guī)范操作，就可得到可靠的結(jié)果。本發(fā)明的試劑盒中未詳細(xì)提及的試劑組分(例如清洗液、一些必要的緩沖液等)、試劑盒的外包裝以及各試劑組分的獨(dú)立包裝容器等均可以按照所屬領(lǐng)域的常規(guī)操作進(jìn)行，符合相關(guān)行業(yè)規(guī)定即可。本發(fā)明的方法中未詳細(xì)提及的操作步驟也可參照所屬領(lǐng)域的常規(guī)操作進(jìn)行，例如，在檢測前，可將各試劑放至室溫(18～25℃)，加樣前充分混勻；所用檢測儀器設(shè)備例如化學(xué)發(fā)光類測定儀的使用按照說明書操作進(jìn)行。本發(fā)明中，未特別注明單位的比例與含量，固體組分為質(zhì)量比例與含量，液體組分為體積比例與含量。綜上所述，本發(fā)明的人表皮生長因子受體her-2/neu定量檢測試劑盒，具有以下有益效果：性能優(yōu)異，成本較低，同時有效期長。樣本和試劑一次加入，即方便手動操作也利于提高全自動操作效率。附圖說明圖1為本發(fā)明具體實(shí)施例中對兩種試劑盒產(chǎn)品(評價試劑、對照試劑)進(jìn)行線性回歸分析數(shù)據(jù)圖。圖2a為本發(fā)明具體實(shí)施例中評價試劑-對照試劑散點(diǎn)圖。圖2b為本發(fā)明具體實(shí)施例中評價試劑測值偏倚-對照試劑散點(diǎn)圖。具體實(shí)施方式為了更清楚地理解本發(fā)明，現(xiàn)參照下列實(shí)施例及附圖進(jìn)一步描述本發(fā)明。實(shí)施例僅用于解釋而不以任何方式限制本發(fā)明。實(shí)施例中所用各試劑材料均可商購獲得，所用各儀器設(shè)備也是所屬領(lǐng)域的現(xiàn)有儀器設(shè)備，未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法為所屬領(lǐng)域熟知的常規(guī)方法和常規(guī)條件，或按照制造商所建議的條件。實(shí)施例1本發(fā)明中，本發(fā)明所述的捕獲抗體為能與人體內(nèi)人表皮生長因子受體her-2/neu抗原特異結(jié)合的單克隆抗體，所訴的示蹤抗體為能與人表皮生長因子受體her-2/neu特異結(jié)合的單克隆抗體。捕獲抗體和示蹤抗體除能與人表皮生長因子受體her-2/neu特異性結(jié)合外，配對使用時可與抗原形成“三明治”夾心結(jié)構(gòu)。1、本實(shí)施例所用的人表皮生長因子受體her-2/neu抗原采購自無錫傲銳東源生物科技有限公司，本實(shí)施例所用的人表皮生長因子受體her-2/neu捕獲抗體和示蹤抗體采購自無錫傲銳東源生物科技有限公司。本實(shí)施例中所述的各種試劑的配方如下：【pbsph7.2緩沖液】試劑廠商終濃度1000ml試劑用量磷酸二氫鈉sigma50mm6.0g氯化鈉sigma75mm4.39g4m氫氧化鈉sigmaph7.2～25ml【pbsph6.8緩沖液】試劑廠商終濃度1000ml試劑用量磷酸二氫鈉sigma50mm6.0g氯化鈉sigma75mm4.39g4m氫氧化鈉sigmaph6.8～25ml【20mmmesph6.0】試劑廠商終濃度1000ml試劑用量messigma50mm2.44g氯化鈉sigma150mm8.78g4m氫氧化鈉sigmaph6.0～35ml【100mm賴氨酸溶液】試劑廠商終濃度1000ml試劑用量磷酸二氫鈉sigma50mm6.0g賴氨酸sigma100mm18.27g4m氫氧化鈉sigmaph6.8～25ml【飽和硫酸銨溶液】【校準(zhǔn)品緩沖液】試劑廠商終濃度1000ml試劑用量磷酸二氫鈉sigma50mm6.0g氯化鈉sigma75mm4.39gtween20sigma0.02％0.2mltritonx100sigma0.03％0.3ml蔗糖sigma1％10g酪蛋白sigma0.15％1.5g牛血清白蛋白元亨圣馬3％30gproclin300sigma0.02％0.2ml4m氫氧化鈉sigmaph6.8～25ml【磁分離試劑緩沖液】試劑廠商終濃度1000ml試劑用量磷酸二氫鈉sigma50mm6.0g氯化鈉sigma75mm4.39gtween20sigma0.02％0.2ml酪蛋白sigma0.15％1.5g牛血清白蛋白元亨圣馬0.5％5gproclin300sigma0.02％0.2ml氫氧化鈉sigmaph7.2～25ml【酶反應(yīng)物緩沖液】試劑廠商終濃度1000ml試劑用量磷酸二氫鈉sigma50mm6.0g氯化鈉sigma75mm4.39gtween20sigma0.02％0.2ml蔗糖sigma1％10g酪蛋白sigma0.15％1.5g牛血清白蛋白元亨圣馬0.5％5gproclin300sigma0.02％0.2ml4m氫氧化鈉sigmaph6.8～25ml【穩(wěn)定增強(qiáng)劑】試劑廠商終濃度1000ml試劑用量磷酸二氫鈉sigma50mm6.0g氯化鈉sigma75mm4.39g三乙醇胺sigma2％20ml多組分免疫復(fù)合物自產(chǎn)6μg/ml6mgmak33roche100ug/ml100mg酪蛋白sigma0.15％1.5g牛血清白蛋白元亨圣馬0.5％5gproclin300sigma0.02％0.2ml4m氫氧化鈉sigmaph6.8～25ml【化學(xué)發(fā)光底物增強(qiáng)緩沖液】【濃縮洗液】試劑廠商終濃度1000ml試劑用量trissigma25mm3.03gnaclsigma900mm52.65tween20sigma0.2％2mltritonx100sigma0.05％0.5mlph7.0-7.42、本實(shí)施例的人表皮生長因子受體her-2/neu磁微?；瘜W(xué)發(fā)光檢測試劑盒的主要試劑組分包括：1)用校準(zhǔn)品緩沖液稀釋的穩(wěn)定化處理人表皮生長因子受體her-2/neu抗原的校準(zhǔn)品(s0，s1，...，s5)。2)用校準(zhǔn)品緩沖液稀釋的穩(wěn)定化處理人表皮生長因子受體her-2/neu抗原的質(zhì)控品(q1，q2)。質(zhì)控品濃度范圍每批標(biāo)定。3)用磁分離緩沖液稀釋的延臂偶聯(lián)人表皮生長因子受體her-2/neu捕獲抗體的磁分離試劑，磁微粒濃度每次滴定，約為0.0015％。4)用酶反應(yīng)物緩沖液稀釋的堿性磷酸酶標(biāo)記人表皮生長因子受體her-2/neu示蹤抗體的酶反應(yīng)物，酶標(biāo)抗體每次滴定，約為0.8μg/ml。5)含抗異嗜性抗體的多組分免疫復(fù)合物組分的穩(wěn)定增強(qiáng)劑。6)濃縮洗液，15ml稀釋至100ml使用。7)用化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)緩沖液稀釋的aps-5化學(xué)發(fā)光底物。3、本實(shí)施例的人表皮生長因子受體her-2/neu磁微?；瘜W(xué)發(fā)光檢測試劑盒的各試劑組分的制備過程為：1)校準(zhǔn)品和質(zhì)控品的制備—將重組人表皮生長因子受體her-2/neu重組抗原溶解于pbsph7.2緩沖液至0.5mg/ml，按不同濃度用多非離子表面活性劑組成的pbs蛋白緩沖體系稀釋成不同濃度點(diǎn)，并定標(biāo)。非離子表面活性劑組成的pbs蛋白緩沖體系組分為：試劑廠商終濃度磷酸二氫鈉sigma50mm氯化鈉sigma75mmtween20sigma0.02％tritonx100sigma0.03％蔗糖sigma1％酪蛋白sigma0.15％牛血清白蛋白元亨圣馬3％proclin300sigma0.02％氫氧化鈉sigmaph6.8—校準(zhǔn)品和質(zhì)控品的目標(biāo)濃度為：試劑名稱目標(biāo)濃度標(biāo)準(zhǔn)品s00ng/ml標(biāo)準(zhǔn)品s13.5ng/ml標(biāo)準(zhǔn)品s210ng/ml標(biāo)準(zhǔn)品s335ng/ml標(biāo)準(zhǔn)品s4100ng/ml標(biāo)準(zhǔn)品s5350ng/ml質(zhì)控品q110ng/ml質(zhì)控品q2100ng/ml2)磁分離試劑的制備—取250μl5％的磁微粒；—用20mmmesph6.0緩沖液洗滌數(shù)次；—去上清后加入20mmmesph6.0緩沖液400μl，80mg/ml的sulfo-nhs50μl，25mg/mledc50μl，反應(yīng)30分鐘；去上清；—用20mmmesph6.0緩沖液洗滌數(shù)次；—加入2mg/ml人表皮生長因子受體her-2/neu包被抗體500μl反應(yīng)過夜，備用；—加入含0.5％bsa，1％蔗糖，5％的聚乙二醇6000的pbsph7.2緩沖液5毫升；將磁微粒濃縮液置于平皿中，封閉4小時；—用20mmmesph6.0緩沖液洗滌數(shù)次；—用含0.15％酪蛋白，0.5％的牛血清白蛋白，0.2％tween20，0.02％proclin300的pbsph7.2緩沖液稀釋至15ml，使用時稀釋至工作濃度?！?jīng)過和不同濃度酶反應(yīng)物做正交棋盤滴定，確定工作濃度。一般工作濃度約為0.0015％。3)酶反應(yīng)物的配制—將堿性磷酸酶透析至pbsph7.2緩沖液并濃縮至0.8mg/ml；—將人表皮生長因子受體her-2/neu示蹤抗體透析至pbsph6.8緩沖液并濃縮至1mg/ml；—按摩爾比1：20的比例在堿性磷酸酶溶液中加入預(yù)先用二甲基亞砜溶解的smcc溶液，反應(yīng)5分鐘后透析至pbsph7.2緩沖液并計算濃度；—按摩爾比1：20比例在示蹤抗體溶液中加入預(yù)先用的用pbsph6.8緩沖液溶解的2—it溶液，反應(yīng)15分鐘后，透析至pbsph7.2緩沖液；—將活化的堿性磷酸酶和活化的抗體按質(zhì)量比2：1的比例混合，反應(yīng)過夜備用。—經(jīng)過和不同濃度磁分離試劑做正交棋盤滴定，確定工作濃度。一般工作濃度約為0.8ug/ml?！獙A性磷酸酶標(biāo)記的her-2示蹤抗體稀釋至如下緩沖液至滴定完確定濃度：試劑廠商終濃度磷酸二氫鈉sigma50mm氯化鈉sigma75mmtween20sigma0.02％蔗糖sigma1％酪蛋白sigma0.15％牛血清白蛋白元亨圣馬0.5％proclin300sigma0.02％氫氧化鈉sigmaph6.84)穩(wěn)定增強(qiáng)劑的配制—按如下方法制備多組分免疫復(fù)合物：—將新生牛血清，小鼠血清，綿羊血清按1：2：0.5的體積比混合；—加入終濃度為57％的飽和硫酸銨，4攝氏度過夜；—次日將處理后的混合血清以10,000g冷凍離心，去上清，將沉淀溶于含0.5％牛血清白蛋白的pbsph7.2緩沖液中，測定濃度；—將上述溶液放置于溫箱中，72℃放置1小時；—測定濃度，用pbsph7.2緩沖液稀釋至50mg/ml，1ml每瓶分裝后冷凍干燥，制備得到多組分免疫復(fù)合物?！慈缦屡浞脚渲品€(wěn)定增強(qiáng)劑：試劑廠商終濃度磷酸二氫鈉sigma50mm氯化鈉sigma75mm三乙醇胺sigma2％多組分免疫復(fù)合物自產(chǎn)6μg/mlmak33roche100μg/ml酪蛋白sigma0.15％牛血清白蛋白元亨圣馬0.5％proclin300sigma0.02％氫氧化鈉sigmaph6.85)化學(xué)發(fā)光底物的配制—按1：10的比例將aps-5化學(xué)發(fā)光底物稀釋至下列組分的緩沖液中：試劑廠商終濃度三乙醇胺sigma2％二乙醇胺sigma0.75％ctabsigma2％光澤精sigma0.3％牛血清白蛋白sigma0.15％bronidoxsigma0.5％鹽酸sigmaph9.5上述校準(zhǔn)品、質(zhì)控品、磁分離試劑、酶反應(yīng)物、穩(wěn)定增強(qiáng)劑、化學(xué)發(fā)光底物各試劑組分配制好后，獨(dú)立地置于一個包裝容器內(nèi)(該包裝容器內(nèi)還可進(jìn)一步包括獨(dú)立包裝的濃縮洗液)，以組成本實(shí)施例的人表皮生長因子受體her-2/neu磁微?；瘜W(xué)發(fā)光檢測試劑盒套組。4、利用本實(shí)施例的磁微?；瘜W(xué)發(fā)光檢測試劑盒檢測人表皮生長因子受體her-2/neu時的具體操作方法為：—每次測定前準(zhǔn)備下列試管，做好標(biāo)記并放置在試管架上；—各濃度校準(zhǔn)品用試管各2支；—待測樣本(非抗凝型采血管采取全血，離心取上部血清。避免溶血)、質(zhì)控品用試管各1支；—測定前將各試劑放至室溫(18～25℃)，加樣前充分混勻；—設(shè)定好37℃水浴鍋；—準(zhǔn)備好化學(xué)發(fā)光類測定儀(請參閱儀器使用說明書)；—加30μlher-2/neu標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品、待測標(biāo)本至對應(yīng)試管底部?！?5μl酶反應(yīng)物至每一試管中。—加45μl穩(wěn)定增強(qiáng)劑至每一試管中?！?0μl分離試劑至每一試管中?！盟芰媳∧じ采w試管，多管混勻器輕輕振蕩試管架30s后，置37℃水浴15分鐘?！嚬苓B架放至磁分離器上，確保每支試管都與分離器表面接觸，沉淀2分鐘。緩慢的倒轉(zhuǎn)分離器倒出上清液，把倒轉(zhuǎn)的試管連同分離器一起放在濾紙上，用力拍擊分離器底部以除去粘在管壁上的所有液滴?！?00μl稀釋后的清洗液至每一試管中，置多管混勻器上輕輕振蕩混勻30s。加樣時應(yīng)避免加樣力度過大而導(dǎo)致磁珠濺出。混勻要徹底。—重復(fù)上述洗滌步驟—加200μl底物溶液至試管中混勻3秒，迅速用準(zhǔn)備好的發(fā)光檢測儀進(jìn)行檢測。結(jié)果計算參閱儀器的相關(guān)說明?！缡褂萌詣訖z測儀器，則上述手動操作步驟將由儀器自動操作所代替，請嚴(yán)格按照儀器使用說明書進(jìn)行檢測。—臨床的臨界值為15ng/ml。5、本實(shí)施例試劑盒的分析性能5.1靈敏度和重復(fù)性u1為零值標(biāo)準(zhǔn)品。以上結(jié)果計算靈敏度為：0.2316ng/ml，低值重復(fù)性為6.75％，高值重復(fù)性為6.76％。5.2回收率和線性以上結(jié)果計算線性為0.9996，回收率為92.10％。5.3交叉和干擾分別將afp、cea、ca125添加至零值標(biāo)準(zhǔn)品中至500ng/ml、200ng/ml、400u/ml。檢測結(jié)果如下表。檢測結(jié)果均小于0.5ng/ml。分別將環(huán)磷酰胺、順鉑、長春新堿、博來霉素添加至零值標(biāo)準(zhǔn)品中至250mg/l、60mg/l、5mg/l、10mg/l，檢測結(jié)果如下表。檢測結(jié)果均為無交叉。6、本實(shí)施例試劑盒的臨床性能按《體外診斷試劑注冊管理辦法(試行)》的要求進(jìn)行臨床驗(yàn)證。評價該試劑盒的臨床應(yīng)用性、有效性及適用性。在本次臨床研究中，共收集血清1050份，使用本實(shí)施例的原癌基因人類表皮生長因子受體2(her-2)定量測定試劑盒(磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法)和siemenshealthcarediagnosticsinc.生產(chǎn)的her-2/neu蛋白測定試劑盒(化學(xué)發(fā)光法)，分別測定血清樣本中原癌基因人類表皮生長因子受體2(her-2)的含量，通過比較兩種檢測系統(tǒng)的測定結(jié)果，驗(yàn)證北京大成生物工程有限公司所生產(chǎn)的原癌基因人類表皮生長因子受體2(her-2)定量測定試劑盒(磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法)與siemenshealthcarediagnosticsinc.生產(chǎn)的her-2/neu蛋白測定試劑盒(化學(xué)發(fā)光法)的等效性。(1)一般分析：①陽性符合率：a/(a+c)×100％＝100％陰性符合率：d/(b+d)×100％＝100％總體符合率：(a+d)/(a+b+c+d)×100％＝100％95％可信區(qū)間：95％ci：p±1.96×[p(1-p)/n]1/2＝[99.93％，1％]②一致性系數(shù)kappa值(k)：對稱度量kappa＝1(k>0.80)評價試劑和對比試劑檢測結(jié)果完全一致。(k＝1>0.80)評價試劑與對比試劑的檢測結(jié)果不存在統(tǒng)計學(xué)意義上的差異，一致性分析kappa＝1，兩種試劑的檢測結(jié)果具有高度一致性?？梢哉J(rèn)為本發(fā)明實(shí)施例的原癌基因人類表皮生長因子受體2(her-2)定量測定試劑盒(磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法)和siemenshealthcarediagnosticsinc.生產(chǎn)的her-2/neu蛋白測定試劑盒(化學(xué)發(fā)光法)檢測結(jié)果一致性好(k＝1>0.80)。數(shù)據(jù)顯示本發(fā)明生產(chǎn)的原癌基因人類表皮生長因子受體2(her-2)定量測定試劑盒(磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法)在臨床檢測上有效性、適應(yīng)性很好。(2)回歸分析、相關(guān)性分析：兩種產(chǎn)品線性回歸分析結(jié)果參見圖1。結(jié)果顯示：試驗(yàn)試劑盒劑量-反應(yīng)曲線的回歸方程y＝0.9965x+0.114、線性r2＝0.9916(r2>0.95)。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，兩種試劑盒相關(guān)性良好。目測血清分布均勻，相關(guān)系數(shù)r2>0.95，血清滿足試驗(yàn)要求。(3)、偏倚數(shù)據(jù)分析評價試劑-對照試劑散點(diǎn)分析結(jié)果參見圖2a。評價試劑測值偏倚-對照試劑散點(diǎn)分析結(jié)果參見圖2b。對比試劑-評價試劑血清測值偏倚數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)如下表：注：x(c)為醫(yī)學(xué)決定水平：b為適當(dāng)濃度范圍內(nèi)的平均偏倚；bc為適當(dāng)濃度范圍內(nèi)的估計的預(yù)期(平均)偏倚；95％bc為bc95％置信區(qū)間的上下限；sd為兩系統(tǒng)測定值差值的標(biāo)準(zhǔn)差。從以上表格分析可以得知：評價試劑與對比試劑的偏倚值的中心線與y＝0十分接近(b＝-0.12)；95％bc的數(shù)值區(qū)間在1/2clia88區(qū)間之內(nèi)，評價試劑與對比試劑預(yù)期平均偏倚bc、方差sd都在可接受的范圍之內(nèi)。(4)統(tǒng)計分析采用spss軟件對試驗(yàn)系統(tǒng)測試值與對比系統(tǒng)測試值做配對t檢驗(yàn)，結(jié)果記錄于下表：t＝0.636(t＞0.05)說明兩系統(tǒng)無統(tǒng)計學(xué)差異。7、關(guān)于多組分免疫復(fù)合物和mak33聯(lián)用的對比。下表列出了穩(wěn)定增強(qiáng)劑中不添加多組分免疫復(fù)合物也不添加mak33、單獨(dú)添加多組分免疫復(fù)合物、單獨(dú)添加mak33與本實(shí)施例中同時添加多組分免疫復(fù)合物和mak33的檢測結(jié)果對比。其中，hama1～hama5是購自serecare的5支存在異常hama反應(yīng)的人血清標(biāo)本。hama5后三組數(shù)據(jù)都測出了陰性值，其數(shù)值大小主要由于實(shí)驗(yàn)變異帶來?？梢钥闯?，本發(fā)明中將多組分免疫復(fù)合物和mak33聯(lián)用，具有協(xié)同作用。結(jié)論：在本次臨床試驗(yàn)中要驗(yàn)證本實(shí)施例所生產(chǎn)的原癌基因人類表皮生長因子受體2(her-2)定量測定試劑盒(磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法)與siemenshealthcarediagnosticsinc.生產(chǎn)的her-2/neu蛋白測定試劑盒(化學(xué)發(fā)光法)的等效性。試驗(yàn)結(jié)果顯示本實(shí)施例所生產(chǎn)的原癌基因人類表皮生長因子受體2(her-2)定量測定試劑盒(磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法)與siemenshealthcarediagnosticsinc.生產(chǎn)的her-2/neu蛋白測定試劑盒(化學(xué)發(fā)光法)的檢測結(jié)果不存在統(tǒng)計學(xué)意義上的差異，并且具有高度一致性，即兩試劑的臨床應(yīng)用性能等效。當(dāng)前第1頁12