本發(fā)明涉及生物技術(shù)檢測領(lǐng)域。更具體地，涉及一種抗鼠傷寒沙門氏菌單克隆抗體及其制備得到的納米免疫磁珠以及納米免疫磁珠技術(shù)聯(lián)合酶聯(lián)免疫吸附快速檢測鼠傷寒沙門氏菌的方法。

背景技術(shù)：

鼠傷寒沙門氏菌(salmonellatyphimurium)是沙門氏桿菌屬其中一個血清型，是革蘭氏陰性菌，能導(dǎo)致多種宿主動物腸道疾病的致病菌，是引起沙門氏菌食物中毒的主要血清型之一，同時也是導(dǎo)致雞肉、雞蛋、鴨肉及相關(guān)產(chǎn)品污染的主要原因之一。鼠傷寒沙門氏菌可以通過被污染的食物及飲水進(jìn)入人體，從而引起人體的嘔吐、腸胃炎和腹瀉等不同程度的疾病。鼠傷寒沙門氏菌的感染對于老人、兒童以及有免疫缺陷的人還會造成生命危險。

目前，檢測鼠傷寒沙門氏菌的方法有三種：傳統(tǒng)的生物學(xué)分離培養(yǎng)法包括采樣、非選擇性富集培養(yǎng)、選擇性培養(yǎng)，生化檢測和血清型鑒定，整個過程費(fèi)時約3-5天；分子生物學(xué)檢測法如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法(pcr)、dna分子雜交法等，但分子檢測方法價格昂貴，操作專業(yè)性強(qiáng)；免疫檢測法包括elisa和簡體金免疫層析方法等，運(yùn)用了抗原抗體的特異性結(jié)合原理，其中elisa方法靈敏度高，檢測時間快。但現(xiàn)有文獻(xiàn)中記載的elisa方法檢測最低濃度為一般為10³-10⁴cfu/ml。隨著人們對健康要求的不斷提高，鼠傷寒沙門氏菌的檢測靈敏度等也將會有更嚴(yán)格的要求。

因此，提供一種具有快速、靈敏度高，準(zhǔn)確率高，低成本、高通量等優(yōu)點(diǎn)的利用免疫學(xué)原理將富集與檢測相結(jié)合來檢測鼠傷寒沙門氏菌的方法，對于菌檢測具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一個目的在于提供一種抗鼠傷寒沙門氏菌單克隆抗體及其分泌產(chǎn)生該抗體的雜交瘤細(xì)胞株。

本發(fā)明的第二個目的在于提供一種由上述單克隆抗體制備得到的納米免疫磁珠。

本發(fā)明的第三個目的在于提供一種納米免疫磁珠技術(shù)聯(lián)合酶聯(lián)免疫吸附快速檢測鼠傷寒沙門氏菌的試劑盒及其方法。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案：

本發(fā)明提供了一種抗鼠傷寒沙門氏菌單克隆抗體m11，是由保藏編號為cgmccno.10313的雜交瘤細(xì)胞株6e7分泌產(chǎn)生。該雜交瘤細(xì)胞株6e7已于2015年01月15日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱cgmcc，地址是中國北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號)，其保藏編號為cgmccno.10313，分類命名為產(chǎn)抗沙門氏菌單克隆抗體細(xì)胞株。

保藏編號為cgmccno.10313的雜交瘤細(xì)胞株也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

本發(fā)明還提供了一種由上述抗鼠傷寒沙門氏菌單克隆抗體制備得到的納米免疫磁珠。

在本發(fā)明中，所述納米免疫磁珠是抗鼠傷寒沙門氏菌單克隆抗體m11通過鏈霉親和素-生物素介導(dǎo)偶聯(lián)納米磁珠制得的。

進(jìn)一步地，所述納米免疫磁珠是采用活潑酯的方法，將鏈霉親和素與180nm磁珠偶聯(lián)獲得鏈霉親和素磁珠，采用生物素化抗體與鏈霉親和素磁珠連接制得。具體步驟為：取10mg磁珠依次用無水乙醇，依次用1mol/lnaoh，1mol/lhcl各洗滌1次，用pb(0.02mol/l，ph4.0)洗5次，mes(0.05mol/l，ph6.0)重懸。依次加入n-羥基硫代琥珀酰亞胺(nhss)0.4mg，二氯乙烷(edc)0.35mg，置于混勻儀上保持磁珠懸浮狀態(tài)，37℃活化2.5h。將每毫克活化磁珠與250μg鏈霉親和素偶聯(lián)；獲得的鏈霉親和素磁珠，按每毫克鏈霉親和素磁珠加入100mg生物素化鼠傷寒沙門氏菌單克隆抗體m11，置于混勻儀上37℃偶聯(lián)35min。磁力架回收磁珠，pb洗滌5次，10mlpbs(含0.05g/100mlnan3，0.5g/100mlbsa，ph7.4)重懸磁珠，即得。

本發(fā)明進(jìn)一步提供了所述抗鼠傷寒沙門氏菌單克隆抗體、所述雜交瘤細(xì)胞株或所述納米免疫磁珠在檢測食品中鼠傷寒沙門氏菌的應(yīng)用。

本發(fā)明進(jìn)一步還提供了一種納米免疫磁珠技術(shù)聯(lián)合酶聯(lián)免疫吸附快速檢測鼠傷寒沙門氏菌的試劑盒，所述試劑盒包括所述抗鼠傷寒沙門氏菌單克隆抗體和由所述抗鼠傷寒沙門氏菌單克隆抗體制備得到納米免疫磁珠。

進(jìn)一步地，所述試劑盒還包括：酶標(biāo)抗體、陽性對照、陰性對照以及所需的酶聯(lián)免疫檢測試劑。

其中，所述酶標(biāo)抗體為與本發(fā)明所述單克隆抗體m11配對的抗鼠傷寒沙門氏菌單克隆抗體，用辣根過氧化物酶采用過碘酸鹽氧化法進(jìn)行偶聯(lián)所得到的；優(yōu)選的，所述與本發(fā)明所述單克隆抗體m11配對的抗鼠傷寒沙門氏菌單克隆抗體為編號為58018的單克隆抗體；

所述陽性對照為滅活的鼠傷寒沙門氏菌，陰性對照為正常小鼠血清；

所述所需的酶聯(lián)免疫檢測試劑均為常規(guī)的酶聯(lián)免疫檢測試劑，包括但不限于洗滌液、顯色液、終止液、封閉液。

本發(fā)明納米免疫磁珠技術(shù)聯(lián)合酶聯(lián)免疫吸附快速檢測鼠傷寒沙門氏菌的方法，包括以下步驟：

(1)取樣增菌；

(2)取增菌上清液，加入上述制備的納米免疫磁珠，孵育后，磁分離，棄去上清液，濃縮重懸并熱處理納米免疫磁珠，磁分離后棄去納米免疫磁珠，得到待測樣品；

(3)將所述的單克隆抗體包被到固相載體上；

(4)加待測樣品：將待測樣品加到步驟(3)獲得的固相載體上，溫育；

(5)加洗滌液洗滌；

(6)加酶標(biāo)抗體，溫育；

(7)加洗滌液洗滌后，加蒸餾水洗滌；

(8)加顯色液顯色；

(9)加終止液終止反應(yīng)；

(10)測定450nm處的吸光值，即od450nm；

(11)將上述即od450nm帶入方程式進(jìn)行計算，即可獲得樣品中鼠傷寒沙門氏菌濃度；所述方程式是將已知濃度的鼠傷寒沙門氏菌進(jìn)行稀釋，得到待測樣品，依次完成步驟(4)-(10)，得到各濃度的吸光值，根據(jù)各濃度的吸光值生成標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的。

在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施例中，步驟(2)中所述納米免疫磁珠的加入量為每毫升增菌上清液加入0.15mg納米免疫磁珠；所述納米免疫磁珠中單克隆抗體與納米磁珠的偶聯(lián)質(zhì)量比為3:50。

在本發(fā)明中，對納米免疫磁珠的加入量進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明：當(dāng)納米免疫磁珠添加量達(dá)到0.15mg時，1ml菌液捕獲效率大于99％。因此，為了保證有效分離，確定在檢測中每毫升菌液中加入納米免疫磁珠0.15mg。

在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施例中，步驟(3)中所述單克隆抗體的包被濃度為40μg/ml；步驟(6)中所述酶標(biāo)抗體的使用濃度為200-300μg/ml。

在本發(fā)明中，通過棋盤滴定法確定m11作為包被抗體以及酶標(biāo)抗體的最佳工作條件，結(jié)果顯示當(dāng)m11以40μg/ml濃度包被，且酶標(biāo)抗體使用濃度為200μg/ml或300μg/ml，其od值(1.087和0.988)接近1.0，且陰性對照較低，p/n值比較大，所以選定所述單克隆抗體的包被濃度為40μg/ml；所述酶標(biāo)抗體的使用濃度為200-300μg/ml。

在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施例中，所述單克隆抗體、待測樣品和酶標(biāo)抗體的用量比為1:1:1。

本發(fā)明的有益效果如下：

本發(fā)明將納米免疫磁珠分離技術(shù)與elisa相結(jié)合，通過納米磁珠偶聯(lián)抗體，形成免疫磁珠進(jìn)而富集捕獲菌體，再將捕獲的菌體進(jìn)行基于雙抗體夾心原理的elisa體系檢測，這種方法具有用時少、準(zhǔn)確率高、檢測費(fèi)用低、不需要專業(yè)操作人員，且靈敏度高，可達(dá)到50cfu/ml。因此，本方法特別很適于快速定量檢測鼠傷寒沙門氏菌。

附圖說明

下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。

圖1示出本發(fā)明納米免疫磁珠富集捕獲菌體過程示意圖。

圖2示出特異性檢測結(jié)果。

圖3示出elisa標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖4示出elisa靈敏度檢測結(jié)果。

具體實(shí)施方式

為了更清楚地說明本發(fā)明，下面結(jié)合優(yōu)選實(shí)施例和附圖對本發(fā)明做進(jìn)一步的說明。附圖中相似的部件以相同的附圖標(biāo)記進(jìn)行表示。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，下面所具體描述的內(nèi)容是說明性的而非限制性的，不應(yīng)以此限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。

實(shí)施例1納米免疫磁珠的制備及捕獲富集沙門氏菌菌體

1、抗體的制備與純化

以高壓滅菌處理鼠傷寒沙門氏菌體作為抗原免疫8周齡健康balb/c雌性小鼠，按常規(guī)的雜交瘤技術(shù)和極限稀釋法制備和篩選出單克隆抗體細(xì)胞株，進(jìn)而將抗鼠傷寒沙門氏菌的特異性抗體細(xì)胞株增殖培養(yǎng)，注射到小鼠體內(nèi)制備腹水，所得腹水經(jīng)辛酸-硫酸銨沉淀法進(jìn)行抗體純化，-20℃保存。

其中，分泌產(chǎn)生抗鼠傷寒沙門氏菌的單克隆抗體m11的雜交瘤細(xì)胞株6e7已于2015年01月15日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱cgmcc，地址是中國北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號)，其保藏編號為cgmccno.10313，分類命名為產(chǎn)抗沙門氏菌單克隆抗體細(xì)胞株。

2、納米磁珠與抗體的偶聯(lián)

采用活潑酯的方法，將鏈霉親和素與納米磁珠偶聯(lián)獲得鏈霉親和素磁珠，采用生物素化抗體與鏈霉親和素磁珠連接制成鏈霉親和素納米免疫磁珠。具體地，取10mg180nm磁珠依次用無水乙醇，用1mol/lnaoh，1mol/lhcl各洗滌1次，用pb(0.02mol/l，ph4.0)洗5次，mes(0.05mol/l，ph6.0)重懸。依次加入n-羥基硫代琥珀酰亞胺(nhss)0.4mg，二氯乙烷(edc)0.35mg，置于混勻儀上保持磁珠懸浮狀態(tài)，37℃活化2.5h。將每毫克活化磁珠與250μg鏈霉親和素偶聯(lián)；獲得的鏈霉親和素磁珠，按每毫克鏈霉親和素磁珠加入100mg生物素化鼠傷寒沙門氏菌單克隆抗體m11，置于混勻儀上37℃偶聯(lián)35min。磁力架回收磁珠，pb洗滌5次，10mlpbs(含0.05g/100mlnan3，0.5g/100mlbsa，ph7.4)重懸磁珠，即得納米免疫磁珠，于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

3、納米免疫磁珠捕獲富集沙門氏菌菌體

取1ml10⁵cfu/ml的鼠傷寒沙門氏菌菌液于2ml的離心管中，取60mg/g(單克隆抗體/磁珠)偶聯(lián)比制備的納米免疫磁珠0.15mg于上述離心管。室溫下在dynal-mix1旋轉(zhuǎn)混合儀上37℃反應(yīng)30min(10r/min)后取下，將離心管插入磁力架分離2min，棄去上清液。用1mlpb(0.02％吐溫-20)濃縮重懸磁珠，85℃水浴15min，磁分離后棄去磁珠，得到待測樣品(具體步驟如圖1所示)。

實(shí)施例2納米免疫磁珠添加量的確定及捕獲富集沙門氏菌菌體效果

1、納米免疫磁珠添加量的確定

取1ml10⁵cfu/ml的鼠傷寒沙門氏菌菌液于2ml的離心管中，取60mg/g(單克隆抗體/磁珠)偶聯(lián)比制備的納米免疫磁珠0.15mg于上述離心管，另設(shè)對照組。室溫下在dynal-mix1旋轉(zhuǎn)混合儀上37℃反應(yīng)30min(10r/min)后取下，將離心管插入磁力架分離2min，吸出上清液。加1mlpb(0.02％吐溫-20)洗滌2遍，分離后吸出洗滌液，最后用1mlpb濃縮重懸磁珠，將上清液、洗滌液、磁珠重懸液及對照組作合適倍數(shù)稀釋，取100μl涂布于鼠傷寒沙門氏菌選擇性培養(yǎng)基，平行6個樣品，37℃培養(yǎng)12h，選擇菌落數(shù)在20-200范圍內(nèi)的進(jìn)行計數(shù)，按公式計算其捕獲效率(ce):ce(％)＝(c1-c2-c3)/c1*100％(c1為對照組菌落總數(shù)，c2為上清液菌落總數(shù)，c3為洗滌液菌落總數(shù))

當(dāng)納米免疫磁珠添加量達(dá)到0.15mg時，1ml10⁵cfu/ml菌液捕獲效率大于99％。為了保證有效分離，確定在檢測中每毫升菌液中加入納米免疫磁珠0.15mg。

2、納米免疫磁珠在肉樣中捕獲富集沙門氏菌菌體效果

稱取25g市售雞肉切碎置于無菌的三角瓶內(nèi)，添加培養(yǎng)好的鼠傷寒沙門氏菌模擬污染，至目標(biāo)菌濃度約為100cfu/g，然后加入225ml肉湯，37℃160r/min搖床培養(yǎng)8h，取1ml上層清液到離心管里，各添加0.15mg本發(fā)明納米免疫磁珠，在旋轉(zhuǎn)混合儀上室溫反應(yīng)30min，結(jié)束后放入磁場分離2min。將對照組、分離上清液、洗滌液、磁珠重懸液作合適倍數(shù)稀釋，取100μl涂布于鼠傷寒沙門氏菌選擇性培養(yǎng)基上，(對照組同時涂布瓊脂培養(yǎng)基計算菌落總數(shù))，平行制備6個樣品。37℃培養(yǎng)12h后，對鼠傷寒沙門氏菌和雜菌分別計數(shù)，計算捕獲效率。同時，購買商品磁珠進(jìn)行同一實(shí)驗(yàn)，并計算其捕獲效率。在雞肉樣中的捕獲效果：本發(fā)明納米免疫磁珠雞豬肉樣品中的捕獲效率為98.9％，而商品性免疫磁珠在豬肉樣品中的捕獲效率為97.5％。說明本發(fā)明納米免疫磁珠比商品性免疫磁珠在樣品中的捕獲效率要高，本發(fā)明納米免疫磁珠可達(dá)到要求，可以進(jìn)行檢測使用。

實(shí)施例3elisa體系的建立以及鑒定

1、相關(guān)溶液的配制

洗滌液(含0.05％tween20的pbs)：1lpbs中加入tween-20500μl。

封閉液(含1％牛血清白蛋白，0.1％tween20的pbs)：10mlpbs中加入100mgbsa，10μltween-20。

酶標(biāo)抗體：將辣根過氧化物酶與編號為58018的單克隆抗體(產(chǎn)自英國abcam公司)采用過碘酸鹽氧化法進(jìn)行偶聯(lián)。

顯色液：底物顯色a液與b液等量混合，避光保存，現(xiàn)用現(xiàn)配。底物顯色a液：ch3coona13.6g，檸檬酸1.6g，30％h2o20.3ml，蒸餾水加至500ml。底物顯色b液：乙二胺四乙酸二鈉0.2g，檸檬酸0.95g，丙三醇50ml，0.15gtmb·2hcl蒸餾水加至500ml。

終止液：2mol/lh2so4。

2、elisa體系的建立

運(yùn)用棋盤滴定法確定m11作為包被抗體以及酶標(biāo)抗體的最佳工作條件，酶標(biāo)抗體為與編號為58018的單克隆抗體，從表1中可以看出，當(dāng)m11以40μg/ml包被，且酶標(biāo)抗體使用濃度為200μg/ml和300μg/ml，其od值(1.087和0.988)接近1.0，且陰性對照較低，p/n值比較大，所以以上條件為elisa系統(tǒng)最佳工作量。

表1棋盤滴定實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3、elisa體系交叉反應(yīng)測定

(1)以40μg/mlm11100μl/孔進(jìn)行提前包被到板上。

(2)加待測樣品：將待測樣品100μl/孔加到已包被的板上。陽性對照為滅活的鼠傷寒沙門氏菌，陰性對照為正常小鼠血清。以相同的劑量加入對應(yīng)的孔中，加蓋37℃恒溫箱溫育30min。

(3)用洗滌液洗3次，甩干。

(4)加酶標(biāo)抗抗體：200μg/ml酶標(biāo)抗體，100μl/孔，加蓋37℃恒溫箱溫育30min。

(5)用洗滌液洗5次，蒸餾水洗2次。

(6)顯色：加新鮮配制的顯色液100μl/孔，室溫暗處放置15min，顯示藍(lán)色。

(7)終止反應(yīng)、比色：加50μl/孔終止液。顏色變黃。

(8)用酶標(biāo)儀測定450nm處各孔的吸光值即od450nm。

以配對的抗體進(jìn)行雙抗體夾心elisa檢測特異性，經(jīng)酶標(biāo)儀在吸光度450nm處檢測，結(jié)果見圖2，從圖2中可以看出：兩個抗體夾心檢測的特異性很好，與英諾克李斯特菌、雞白痢沙門氏菌、福氏志賀氏菌、腸炎沙門氏菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌及空白對照幾乎沒有反應(yīng)。

實(shí)施例4elisa體系靈敏度反應(yīng)測定

將已知濃度的鼠傷寒沙門氏菌稀釋，濃度分別設(shè)置為0、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000cfu/ml，用elisa體系反應(yīng)后測得相應(yīng)濃度的450nm吸光度值，用數(shù)據(jù)處理軟件以濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)自動生成標(biāo)準(zhǔn)曲線和對應(yīng)的方程，如圖3。取雞肉將其用不同濃度鼠傷寒沙門氏菌污染，檢測靈敏度，結(jié)果見圖4，從圖4中可以看出，該elisa體系靈敏度為500cfu/g。

實(shí)施例5納米免疫磁珠富集聯(lián)合酶聯(lián)免疫吸附確定本發(fā)明檢測靈敏度

取10g雞肉按每克加0，10，50，10²，10³，10⁴，10⁵cfu鼠傷寒沙門氏菌來進(jìn)行模擬污染，各取出10ml加入1.5mg本發(fā)明納米免疫磁珠。室溫下，在旋轉(zhuǎn)混合儀上孵育30min，磁分離后用棄去上清液，用1mlpb濃縮重懸磁珠，85℃水浴15min，磁分離后吸出100μl上清進(jìn)行elisa檢測，結(jié)果表明，經(jīng)過免疫磁珠分離富集反應(yīng)，濃度為10²cfu/g和10³cfu/g(od值為0.428和0.901，陰性對照為0.112)菌液的檢測結(jié)果為強(qiáng)陽性；濃度為50cfu/g檢測結(jié)果為弱陽性(od值為0.321，陰性對照為0.112)，可以表明濃度為50cfu/g的鼠傷寒沙門氏菌經(jīng)過免疫磁珠分離富集后能通過elisa檢出，該方法大大減少了增菌時間，可將取樣后的增菌時間縮短至4-5小時，對于檢測機(jī)構(gòu)和相關(guān)企業(yè)有重要意義。

顯然，本發(fā)明的上述實(shí)施例僅僅是為清楚地說明本發(fā)明所作的舉例，而并非是對本發(fā)明的實(shí)施方式的限定，對于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在上述說明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動，這里無法對所有的實(shí)施方式予以窮舉，凡是屬于本發(fā)明的技術(shù)方案所引伸出的顯而易見的變化或變動仍處于本發(fā)明的保護(hù)范圍之列。