本發(fā)明涉及一種利用抗鰭藻毒素的單克隆抗體與鰭藻毒素抗原結(jié)合，而分析檢測(cè)環(huán)境樣品中鰭藻毒素含量的快速檢測(cè)試劑盒。
背景技術(shù)：
鰭藻毒素是我國(guó)近岸海域常見的赤潮毒素組分之一，在近岸海域貝類體內(nèi)?？蓹z出，已嚴(yán)重影響了貝類出口貿(mào)易，引起了各級(jí)政府及研究領(lǐng)域的極大關(guān)注。建立鰭藻毒素的快速靈敏準(zhǔn)確的檢測(cè)方法和產(chǎn)品，對(duì)確保海產(chǎn)品食用安全和維持水產(chǎn)養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)健康可持續(xù)發(fā)展具有十分重要的意義。目前已知有腹瀉性貝毒檢測(cè)試劑盒，主要檢測(cè)腹瀉性貝毒組分為軟海綿酸，檢測(cè)靈敏度為0.1ng/ml。而且同類產(chǎn)品多為進(jìn)口產(chǎn)品，價(jià)格比較貴。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
為了解決快速、靈敏分析大批量環(huán)境樣品中的鰭藻毒素的問(wèn)題，本技術(shù)發(fā)明提供一種利用抗鰭藻毒素的單克隆抗體研制的間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫分析鰭藻毒素的試劑盒。
本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的：鰭藻毒素快速酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，包括96孔酶標(biāo)板可拆卸條板、酶標(biāo)記二抗、含吐溫-20的緩沖鹽洗液、底物液和終止液，96孔酶標(biāo)板上包被有蛋白偶聯(lián)物的完全抗原，并加入抗鰭藻毒素的單克隆抗體。
制法為：將半抗原的腹瀉性貝毒主要成分oa與蛋白偶聯(lián)，合成完全抗原，將獲得的完全抗原免疫小鼠，待小鼠血清滴度達(dá)到預(yù)期后，將小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，獲得抗鰭藻毒素（dtx1和dtx2）的單克隆陽(yáng)性細(xì)胞株，擴(kuò)大培養(yǎng)后，注入小鼠腹腔誘生腹水，將獲得的腹水純化后，制得抗鰭藻毒素的單克隆抗體，用合成的完全抗原包被96孔酶標(biāo)板，加入dtx標(biāo)準(zhǔn)品或樣品，再加入抗鰭藻毒素的單克隆抗體，包被抗原oa與自由的dtx競(jìng)爭(zhēng)抗體mab-dtx，自由的dtx和抗體復(fù)合物被洗去，與包被抗原oa結(jié)合的抗體mab-dtx再與酶標(biāo)記的二抗結(jié)合，經(jīng)底物顯色，終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔的吸光值(od)，od值越大，樣品中自由的dtx含量越少，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品回歸的方程，計(jì)算樣品dtx的含量。
本技術(shù)發(fā)明利用抗鰭藻毒素的單克隆抗體研制的間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫分析鰭藻毒素的試劑盒，價(jià)格比同類進(jìn)口試劑盒便宜10倍以上，而且靈敏度可達(dá)0.6ng/ml。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步解釋說(shuō)明。
鰭藻毒素快速酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，包括96孔酶標(biāo)板可拆卸條板、酶標(biāo)記二抗、含吐溫-20的緩沖鹽洗液、底物液和終止液，96孔酶標(biāo)板上包被有蛋白偶聯(lián)物的完全抗原，并加入抗鰭藻毒素的單克隆抗體。具體制法為：
將半抗原的腹瀉性貝毒主要成分oa溶于少量二甲亞砜中，加入edc和nhc，25℃反應(yīng)1.5h后，加入溶解于磷酸緩沖液的（pbs,ph7.0）的血藍(lán)蛋白（klh），25℃反應(yīng)3h。將反應(yīng)混合物移入透析卡中，對(duì)pbs透析3d，4℃，每12h換液1次，透析結(jié)束后，將透析物分裝，獲得完全抗原oa-klh，oa與卵清蛋白(ova)的偶聯(lián)方法同oa-klh，可獲得oa-ova。將制備得到oa-klh和oa-ova-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>
將獲得的完全抗原oa-klh免疫6-8周齡的雌性balb/c小鼠，免疫6次后次后殺鼠取脾，將脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞sp2/0融合，經(jīng)hat選擇性培養(yǎng)，獲得分泌抗鰭藻毒素（dtx）的單克隆陽(yáng)性細(xì)胞株。
制備抗鰭藻毒素（dtx）單克隆抗體；分泌抗鰭藻毒素（dtx）單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。取8周齡健康balb/c雌性小鼠或雜交一代鼠，腹腔注射液體石蠟0.5ml/每只，待用。1500r/min離心收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞，懸浮于生理鹽水中，濃度為106/ml。在石蠟油處理的小鼠腹腔內(nèi)注射0.5ml雜交瘤細(xì)胞懸液誘生腹水，收集腹水，3000r/min離心10min，收集上清液即為含單克隆抗體腹水。腹水用優(yōu)化的辛酸硫酸氨純化方法得到粗制抗體蛋白，再用蛋白g親和柱純化，制得抗鰭藻毒素的單克隆抗體。
建立酶聯(lián)免疫吸附方法檢測(cè)dtx。用oa-ova作包被抗原，用碳酸鹽緩沖液（ph9.6）稀釋，包被96孔酶標(biāo)板，每孔100μl，4℃過(guò)夜；棄去殘夜，96孔酶標(biāo)板用pbs-t洗三次，用1%pva-pbs溶液封閉，37℃3h，4℃保存待用。測(cè)定時(shí)，棄去封閉液，洗板三次，加入50μl系列稀釋的dtx-pbs標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液或海水或貝肉萃取液樣品，再加入適當(dāng)稀釋的抗鰭藻毒素單克隆抗體溶液，振搖混勻，室溫放置30min，37℃恒溫1h，洗板，加入酶標(biāo)羊抗鼠第二抗體，37℃恒溫40min；洗板，加顯色液（tmb-過(guò)氧化氫尿素）100μl，0.5mol/lh2so4終止反應(yīng)，450nm波長(zhǎng)酶標(biāo)儀測(cè)定od值，以dtx標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度對(duì)od值或抑制率繪制曲線，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品回歸的方程，計(jì)算樣品dtx的含量。
以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實(shí)施方式，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明披露的技術(shù)范圍內(nèi)，根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其發(fā)明構(gòu)思加以等同替換或改變，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。