本發(fā)明屬于一種生物技術(shù)核酸提取純化領(lǐng)域，特別是涉及一種微量的病毒核酸提取純化試劑及其使用方法，尤其是人體體液如血清、血漿、全血、尿液、腦脊液等樣本中的核酸提取。

背景技術(shù)：

核酸的分離與純化技術(shù)是生化與分子生物學(xué)的一項基本技術(shù)，核酸是遺傳信息的攜帶者，是蛋白表達(dá)的物質(zhì)基礎(chǔ)。無論是進(jìn)行核酸結(jié)構(gòu)還是功能研究，首先需要對核酸進(jìn)行分離純化。目前核酸分離技術(shù)雖然發(fā)展迅速，但是均存在一些缺點(diǎn)：經(jīng)典的酚氯仿抽提法，雖然核酸得率高，但其對人體有害，且容易造成環(huán)境污染，同時提取過程需要反復(fù)抽提，多次高速離心換管，步驟繁瑣，會造成樣本的丟失與交叉污染。堿裂解法:該法操作相對簡單，但提取的核酸不容易保存，純度低且不能用于rna提取。硅膠膜吸附柱法：操作簡便易于標(biāo)準(zhǔn)化，提取的核酸dna/rna純度高得率高，但難于實(shí)現(xiàn)自動化、成本高、單位時間的提取通量低、提取的核酸片段不夠完整(條件劇烈導(dǎo)致斷裂較多)。

磁珠是由四氧化三鐵或三氧化二鐵等磁性粒子與各種含功能基團(tuán)的二氧化硅材料復(fù)合而成的球形微粒，磁珠表面可被賦予多種活性功能基團(tuán)，如羧基、羥基等，也可共價結(jié)合寡聚核苷酸、酶、細(xì)胞、抗體等生物活性物質(zhì)。磁珠在磁場條件下可以發(fā)生聚集或分散，當(dāng)粒徑處于一定范圍時，具有很好的瞬時響應(yīng)性，即超順磁性，可避免發(fā)生磁團(tuán)聚，可在外加磁場作用下被定位、導(dǎo)向和分離。表面結(jié)合的基團(tuán)或活性物質(zhì)可以特異吸附核酸或其他生物大分子，并在磁場作用下達(dá)到分離純化生物大分子的作用。

當(dāng)前，磁珠已在核酸提取純化中得以廣泛應(yīng)用，然而絕大多數(shù)商售的磁珠法核酸提取試劑盒存在缺點(diǎn)：提取效率低(與qiagen或roche的硅膜吸附柱法比較明顯遜色)，操作步驟繁瑣(宣稱自動化、實(shí)際操作卻涉及多次人工干預(yù)并且無法從試劑角度避免)，不是即用型試劑(用戶使用前需要加入乙醇或異丙醇等，還需要復(fù)溶蛋白酶，載體核酸或助沉劑等)。這些缺點(diǎn)限制了磁珠試劑的大規(guī)模應(yīng)用，用戶并沒有獲得比傳統(tǒng)吸附柱法更好的結(jié)果，與其它方法比較，除了可以自動化之外幾乎沒有其它優(yōu)點(diǎn)，當(dāng)前磁珠法的現(xiàn)狀是，用戶多一種選擇，僅此而已。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明致力于開發(fā)一種操作簡捷、可自動化、可標(biāo)準(zhǔn)化的即用型磁珠法核酸提取試劑，并提供其大規(guī)模工業(yè)化制造的方法。該試劑盒操作簡便，提取核酸片段完整、純度高，得率高，適用于雜交分析、測序、pcr、電泳、基因芯片等分子克隆等下游實(shí)驗。其組分如下:①裂解結(jié)合液、②磁珠懸液、③洗滌液a、④洗滌液b、⑤洗脫液。所述裂解結(jié)合液為含有表面活性劑的異硫氰酸胍/硫氰酸胍/鹽酸胍溶液，并含乙醇/異丙醇的緩沖液。優(yōu)選的是2m-5mguscn，20-200mm檸檬酸鈉-檸檬酸，2％-20％tritonx-100，1-6％thesit，0.1-1％sds，10-30％乙醇，所述裂解液的ph值＝6-7；所述洗滌液a，優(yōu)選的是30％-60％乙醇、1-2mguscn、1-20mmtris；所述洗滌液b優(yōu)選的是60％-80％乙醇、10-100mmnacl和1-20mmtris；所述洗脫液含有10mmtris-hcl，0.5mmedta，ph值＝8.0或者純水；所述磁珠懸浮液優(yōu)選的是磁珠含量為20-100mg/ml，磁珠顆粒直徑為直徑在0.1-2.5μm。

上述的磁珠法核酸提取試劑的提取方法，包括以下步驟:

1)在一次性塑料耗材中加入含有磁珠及內(nèi)標(biāo)的工作裂解結(jié)合液500-800μl，加入樣本200μl，吸打混勻一次，使樣本裂解釋放出dna/rna，并結(jié)合到磁珠上，10-15分鐘結(jié)合充分后，在磁場作用下，磁珠富集，磁珠-核酸復(fù)合物與液體分離。

2)向磁珠-核酸復(fù)合物加入800-1000μl洗滌液a，洗去復(fù)合物表面蛋白質(zhì)、脂類以及鹽離子等雜質(zhì)，在磁場作用下，得到洗滌后的復(fù)合物。

3)向磁珠-核酸復(fù)合物加入800-1000μl洗滌液b，洗去復(fù)合物表面胍鹽及離子雜質(zhì)，在磁場作用下，得到洗滌后的復(fù)合物；

4)向洗滌后的磁珠-核酸復(fù)合物加入60-100μl洗脫液，改變磁珠和核酸結(jié)合情況，將核酸在磁珠上面洗脫下來，約需5分鐘，在磁場作用下，磁珠和核酸分離，得到純化的dna/rna。

本試劑盒適用的樣本包括血清、血漿、全血、組織提取液、拭子洗液、分泌物浸泡液、糞便預(yù)處理液、病毒培養(yǎng)液和其他體液等。本發(fā)明所提取的核酸可直接進(jìn)行pcr及rt-pcr等分子生物學(xué)實(shí)驗研究以及臨床檢測。本試劑盒可配合自動化儀器提取病毒核酸。速度快，通量高。以下實(shí)施例僅僅是例證，本發(fā)明并不局限于這些實(shí)施例。

附圖說明：

圖1-1是本發(fā)明對hbvdna國家線性標(biāo)準(zhǔn)品為待測樣本進(jìn)行提取后用熒光pcr法檢測hbvdna的結(jié)果圖，橫坐標(biāo)代表擴(kuò)增循環(huán)數(shù)，縱坐標(biāo)代表熒光值強(qiáng)度。

圖1-2是本發(fā)明對hbvdna國家線性標(biāo)準(zhǔn)品為待測樣本進(jìn)行提取后用熒光pcr法檢測內(nèi)標(biāo)的結(jié)果圖，橫坐標(biāo)代表擴(kuò)增循環(huán)數(shù)，縱坐標(biāo)代表熒光值強(qiáng)度。

圖1-3是本發(fā)明對hcvrna國家線性標(biāo)準(zhǔn)品為待測樣本進(jìn)行提取后用熒光pcr法檢測hcvrna的結(jié)果圖，橫坐標(biāo)代表擴(kuò)增循環(huán)數(shù)，縱坐標(biāo)代表熒光值強(qiáng)度。

圖1-4是本發(fā)明對hcvrna國家線性標(biāo)準(zhǔn)品為待測樣本進(jìn)行提取后用熒光pcr法檢測內(nèi)標(biāo)的結(jié)果圖，橫坐標(biāo)代表擴(kuò)增循環(huán)數(shù)，縱坐標(biāo)代表熒光值強(qiáng)度。

圖2-1是本發(fā)明對待測全血樣本進(jìn)行提取后測定吸光度的結(jié)果圖，od260值反應(yīng)為濃度，a260/280、a260/230值反應(yīng)為純度。

圖2-2是本發(fā)明對另一個待測全血樣本進(jìn)行提取后測定吸光度的結(jié)果圖，od260值反應(yīng)為濃度，a260/280、a260/230值反應(yīng)為純度。

實(shí)施案例1:血清或血漿中病毒核酸的提取純化，特點(diǎn)是快捷、靈敏、自動化、易于與全自動平臺集成

①裂解結(jié)合液：4.5mguscn、0.5％dtt、0.1m檸檬酸鈉、1mm檸檬酸、0.5％sds、3％thesit、5％tritonx-100、25％乙醇

②磁珠懸液：40mg/ml硅基磁珠

③洗滌液a：30％乙醇、2mguscn、6mmtris、1.2mm檸檬酸

④洗滌液b:80％乙醇、20mmnacl、2mmtris

⑤洗脫液:含有0.04％nan3的純水

以中檢院乙型肝炎核酸(hbvdna)國家標(biāo)準(zhǔn)品線性靈敏度l0-l7為待測樣本，l7為l611倍稀釋所得，濃度為10iu/ml，用上述試劑及操作方法對樣本進(jìn)行核酸提取及熒光pcr檢測。所用提取儀為西安天隆生物科技的np968磁珠法核酸提取系統(tǒng)和abi7500熒光pcr儀，在提取板上加含磁珠、內(nèi)標(biāo)的裂解結(jié)合液600μl(磁珠10μl，內(nèi)標(biāo)1μl)，樣本200μl，洗滌液a800μl、洗滌液b800μl、洗脫液100μl。上機(jī)執(zhí)行提取程序，20-30分鐘完成提取。結(jié)果如附圖1-1：采用本發(fā)明試劑提取中檢院hbv國家參考品l0-l7擴(kuò)增結(jié)果，圖1-2：采用本發(fā)明試劑提取中檢院hbv國家參考品l0-l7內(nèi)標(biāo)結(jié)果。

以中檢院丙型肝炎核酸(hcvrna)國家標(biāo)準(zhǔn)品線性靈敏度l0為待測樣本，以陰性血清10倍梯度稀釋至l5，濃度為10⁶～10¹iu/ml，同上試劑、儀器及操作，對樣本進(jìn)行核酸提取及熒光pcr檢測。結(jié)果如附圖1-3：采用本發(fā)明試劑提取中檢院hcv國家參考品10倍系列稀釋物擴(kuò)增結(jié)果，圖1-4：采用本發(fā)明試劑提取中檢院hcv國家參考品10倍系列稀釋物內(nèi)標(biāo)結(jié)果。

實(shí)施案例2:全血基因組dna的提取純化(純度得率高，無人工干預(yù))

1)在提取板一個操作單元(六孔)上分別加含磁珠的裂解結(jié)合液600μl(含磁珠10μl)、洗滌液a800μl、洗滌液a800μl、洗滌液b800μl、洗滌液b800μl，洗脫液100μl。

2)在裂解孔中加入全血200μl，蛋白酶(蛋白酶k干粉復(fù)溶成20mg/ml，復(fù)溶液采用5mmcacl2，10mmtris-hcl，ph7.5)10μl，混勻一次后，移入自動化提取儀，運(yùn)行全血程序即可。具體為60℃裂解結(jié)合15min、洗滌a洗滌2min×2次、洗滌b洗滌2min×2次，80℃5min洗脫。取洗脫液1μl在微量紫外分光光度計上測定od260、od280及od230。如附圖2-1采用本發(fā)明試劑提取全血1結(jié)果(101ng/μla260/280＝1.86a260/230＝1.37)及圖2-2采用本發(fā)明試劑提取全血2結(jié)果(161ng/μla260/280＝1.74a260/230＝2.73)。

以上描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)。本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下本發(fā)明還會有各種變化和改進(jìn)，這些變化和改進(jìn)都落入要求保護(hù)的本發(fā)明范圍內(nèi)。