本發(fā)明涉及生物試劑，具體涉及檢測試劑盒，尤其涉及一種膠乳增強免疫比濁法檢測α1-微球蛋白的試劑盒及其制備方法。
背景技術(shù)：
：α1-微球蛋白(α1-mg)是一種廣泛分布在體液和淋巴細胞膜表面的糖蛋白，由167個氨基酸組成，分子量約27kda，主要合成于肝臟和淋巴細胞；血液中，α1-微球蛋白有兩種存在形式：游離態(tài)α1-mg及與iga(免疫球蛋白a)結(jié)合的α1-mg-1ga；游離態(tài)α1-mg可自由通過腎小球過濾，約95％-99％在腎小管重吸收和代謝，只有微量從尿液排出；結(jié)合態(tài)α1-mg-iga則不能通過腎小球，其在尿液中的濃度為零。α1-mg在體內(nèi)的產(chǎn)生量恒定，較少受腎外因素影響，因此α1-mg濃度的測定對腎功能損傷的早期診斷具有意義。目前，已有檢測α1-mg的試劑盒主要根據(jù)膠乳增強免疫比濁法的測定制備而成。其制備過程一般包括物理吸附法和化學(xué)偶聯(lián)法；其中，物理吸附法穩(wěn)定性較差，抗體容易從膠乳顆粒上脫落下來，造成試劑性能下降；而化學(xué)偶聯(lián)法，使用的是帶有功能基團(例如羧基)的膠乳微球，在活化劑如edc(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽)的作用下，可與抗體偶聯(lián)，抗體與微球結(jié)合。但是，化學(xué)偶聯(lián)法檢測α1-mg的試劑盒對反應(yīng)體系的要求較苛刻。因此，需要進一步改進。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的在于克服上述不足之處，研究設(shè)計具有線性范圍寬、靈敏度高、特異性好、抗干擾能力強、制備成本低，穩(wěn)定性好等特點的檢測α1-微球蛋白的試劑盒。本發(fā)明提供一種檢測α1-微球蛋白的試劑盒，具體提供一種膠乳增強免疫比濁法檢測α1-mg的試劑盒。本發(fā)明檢測α1-微球蛋白的試劑盒。本發(fā)明的試劑盒由試劑r1和試劑r2按體積比1﹕1的比例組成。本發(fā)明試劑盒所述試劑r1由下列配比的成分組成：20～150mmol/l緩沖液、3～20g/l穩(wěn)定劑、5～20g/l電解質(zhì)、3～20g/l增敏劑、0.5～10g/l表面活性劑、0.2～1g/l防腐劑、和純化水，ph值為7.0～9.5。所述穩(wěn)定劑選自牛血清白蛋白、乙二胺四乙酸二鈉、氯化膽堿、蔗糖、海藻糖或山梨醇中的一種或幾種。所述增敏劑選自peg(聚乙二醇)2000、peg4000、peg6000、peg8000或peg20000中的一種或幾種；所述電解質(zhì)選自氯化鈉或氯化鉀中的一種或幾種；所述表面活性劑選自吐溫-20、曲拉通x-100或曲拉通x-405中的一種或幾種。所述防腐劑選自疊氮鈉(nan3)、proclin-300(商品名，主要成分為2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮、5-氯-2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮)或亞硝酸鈉(nano2)中的一種或幾種。所述ph調(diào)節(jié)劑為12mol/l濃鹽酸或10mol/lnaoh溶液。試劑r1有利于α1-微球蛋白的抗原與抗體充分結(jié)合。所述試劑r2由下列配比的成分組成：1.5～3.5g/l兩種粒徑的、分別偶聯(lián)同一種抗人α1-微球蛋白多克隆抗體的膠乳微球、20～150mmol/l的緩沖液、3～20g/l的穩(wěn)定劑，5～20g/l的電解質(zhì)，0.5g/l的防腐劑，以及純化水，ph值為7.0～9.5。所述偶聯(lián)同一種抗人α1-微球蛋白多克隆抗體的膠乳微球指的是將同一種抗體分別偶聯(lián)在兩種粒徑的膠乳微球上，為r2中的主要成分；所述兩種粒徑按小粒徑：大粒徑＝8:2～5:5的比例小粒徑的粒徑為：20～125nm；大粒徑的粒徑為：150～300nm。所述膠乳微球的粒徑為20～300nm的聚苯乙烯微球，其中羧基含量為0.080～0.470mmol/g。所述抗人α1-mg多克隆抗體選自羊抗人α1-微球蛋白多克隆抗體或兔抗人α1-微球蛋白多克隆抗體中的一種或幾種。所述試劑r1和試劑r2的緩沖液選自三羥甲基氨基甲烷(tris)、2-(n-嗎啡啉)乙磺酸(mes)、3-(環(huán)已胺)-2-羥基-1-丙磺酸(capso)、3-嗎啉丙磺酸(mops)、n-三(羥甲基)甲基-3-氨基丙烷磺酸(taps)、4-羥乙基哌嗪乙磺酸(hepes)、硼酸(h3bo3)或氯化銨(nh4cl)中的一種或幾種。本發(fā)明另一目的是提供了所述檢測α1-微球蛋白的試劑盒制備方法，該方法包括下列步驟：一、制備試劑r1：組成：120～150mmol/l緩沖液、3～20g/l穩(wěn)定劑、5～20g/l電解質(zhì)、3～20g/l增敏劑、0.5～10g/l表面活性劑、0.2～1g/l防腐劑、和純化水，ph值為7.0～9.5。制備：取純化水于燒杯中，置于磁力攪拌器上，依次加入緩沖劑、穩(wěn)定劑、電解質(zhì)、增敏劑、表面活性劑以及防腐劑于燒杯中，每次添加物料需完全溶解后才能繼續(xù)添加下一種物料，待所有物料完全溶解后，用12mol/l濃鹽酸或10mol/lnaoh調(diào)節(jié)ph至7.0～9.5，用0.22um濾膜過濾，以去除不溶性的雜質(zhì)，即為試劑r1；二、制備試劑r2組成：1.5～3.5g/l兩種粒徑的、分別偶聯(lián)同一種抗人α1-微球蛋白多克隆抗體的膠乳微球、20～150mmol/l的緩沖液、3～20g/l的穩(wěn)定劑，5～20g/l的電解質(zhì)，0.5g/l的防腐劑，以及純化水，ph值為7.0～9.5。制備：(1)取0.7～1.5g小粒徑20～125nm膠乳微球，加入10mlph5.5～7.0的緩沖液、2ml新鮮配制的edc(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽)溶液10-30mg/ml，加入純化水至體積100ml，充分混勻，室溫混合15～40min；(2)取0.7～1.5g大粒徑150～300nm膠乳微球，加入10mlph5.5～7.0的緩沖液、1.5ml新鮮配制的edc溶液10-30mg/ml，加入純化水至體積100ml，充分混勻，室溫20～30℃混合15～40min；(3)將質(zhì)量比(微球：抗體)為12:1～20:1的抗人α1-mg抗體(6.2mg/ml)加入步驟1的體系中進行抗體偶聯(lián)，室溫(20～30℃)混合1h；(4)將質(zhì)量比(微球：抗體)為35:1～50:1的抗人α1-mg抗體(6.2mg/ml)加入步驟2的體系中進行抗體偶聯(lián)，室溫20～30℃混合1h；(5)將步驟3和步驟4中反應(yīng)完全的體系分別于10000～16000rpm離心20～50min，各加入100mlph值7.0～9.5、50mm的緩沖液，超聲重懸；(6)在步驟5重懸后的各體系中，分別加入5～15ml20％bsa(牛血清白蛋白)溶液，室溫(20～30℃)混合0.5～3h；(7)用ph7.0～9.0、50mm的緩沖液(含0.2～1.5％bsa，0.3～2％nacl，0.1～1.0％蔗糖，0.05％nan3)分別稀釋步驟(6)小粒徑和大粒徑偶聯(lián)抗體的膠乳微球溶液，至形成的小粒徑和大粒徑膠乳微球溶液終濃度為0.15～0.35％，稀釋后的體積各為500ml；(8)將小粒徑膠乳微球溶液與大粒徑膠乳微球溶液按8:2～1:1混合，即得試劑r2。三、組成試劑盒：r1：2×60ml/每瓶r2：2×15ml/每瓶?，F(xiàn)有技術(shù)中，由于單獨采用小粒徑膠乳微球時，試劑的線性、靈敏度及樣本檢測情況均良好，但是所需抗體的使用量很多，會非常明顯的提高生產(chǎn)成本；而加入大粒徑的膠乳微球后，對試劑的線性、靈敏度及樣本檢測情況都有影響，所以，兩種粒徑的膠乳微球的選擇(粒徑、比例、兩種膠乳微球上偶聯(lián)抗體的量)都會對試劑性能產(chǎn)生很大的影響。本發(fā)明克服了單用的小粒徑膠乳微球或大粒徑的膠乳微球的缺陷，用于檢測血清/血漿樣品與進口對照試劑相關(guān)性良好，對于與已有技術(shù)試劑盒比較，檢測樣品迅速，準(zhǔn)確度高，具有線性范圍寬、靈敏度高、特異性好、抗干擾能力強的特點。本發(fā)明大幅度降低了試劑的生產(chǎn)制備成本，減少抗體的使用量，且可以達到與對照試劑同樣的性能，同時可以線性放大制備，宜于規(guī)模型工業(yè)化生產(chǎn)，有較大的應(yīng)用價值。附圖說明圖1實施例1試劑與進口對照試劑相關(guān)性檢測。圖2實施例2試劑與進口對照試劑相關(guān)性檢測。圖3實施例3試劑與進口對照試劑相關(guān)性檢測。縱坐標(biāo)：對照試劑樣本檢測值(mg/l)橫坐標(biāo)：實施例試劑樣本檢測值(mg/l)圖4進口對照試劑校準(zhǔn)曲線圖5自配試劑(實施例1)校準(zhǔn)曲線圖6自配試劑與進口對照試劑的線性相關(guān)系數(shù)具體實施方式以下實施例所用原料和藥用輔料通過市售得到。以下結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步具體描述，但不僅限于此。實施例1：檢測α1-微球蛋白試劑盒的制備實施例的試劑盒涉及試劑的主要原材料如下：1.抗人α1-微球蛋白抗體(深圳菲鵬生物)2.膠乳微球：采用直徑為68nm和220nm帶羧基基團的聚苯乙烯膠乳顆粒(日本捷時雅)制備試劑r1：50mmmops緩沖液，加入10gpeg6000，1gnan3，1.5gbsa，16gnacl，3g吐溫-20，其余為純化水，總制備量1l，ph值8.0，該試劑為無色或微黃色透明溶液。試劑r2配方：50mmmops緩沖液，含0.35％α1-微球蛋白抗體包被的膠乳微球、1.5％bsa，1.7％nacl，1.3％蔗糖，0.08％nan3，ph值7.7，該試劑為乳白色溶液。制備試劑r2步驟如下：(1)1.75g68nm膠乳微球(小粒徑)，加入10mlph值6.1的mes溶液、2ml新鮮配制的edc溶液(20mg/ml)，純化水補足體積至100ml，充分混勻，20～30℃混合30min；(2)取1.75g220nm膠乳微球(大粒徑)，加入10mlph6.1的mes溶液、1.5ml新鮮配制的edc溶液(20mg/ml)，純化水補足體積至100ml，充分混勻，室溫20～30℃混合30min；(3)將質(zhì)量比(微球：抗體)為12:1的抗人α1-微球蛋白抗體(83.3mg，6.2mg/ml)加入步驟1的體系中進行抗體偶聯(lián)，20～30℃混合1h；(4)將質(zhì)量比(微球：抗體)為35:1的抗人α1-mg抗體(28.6mg，6.2mg/ml)加入步驟2的體系中進行抗體偶聯(lián)，20～30℃混合1h；(5)將步驟3和步驟4中反應(yīng)完全的體系分別經(jīng)14000rpm(allegra64rcentrifuge，beckmancoulter)離心30min，各加入100mlph7.7、50mm的mops緩沖液，超聲破碎儀(jy9r-iidn，寧波新芝生物)重懸；(6)在步驟5重懸后的2個體系中，分別加入10ml20％bsa溶液，20～30℃混合1h；(7)用ph7.7、50mm的mops緩沖液(1.5％bsa，1.7％nacl，1.3％蔗糖，0.08％nan3)，分別稀釋步驟6的兩個體系至微球終濃度為0.35％，分別得到500ml68nm(小粒徑)偶聯(lián)抗人α1-微球蛋白抗體的膠乳微球溶液與500ml220nm(大粒徑)偶聯(lián)抗人α1-微球蛋白抗體的膠乳微球溶液。(8)將500ml68nm偶聯(lián)抗人α1-微球蛋白抗體的膠乳微球溶液與500ml220nm偶聯(lián)抗人α1-微球蛋白抗體的膠乳微球溶液按體積比1:1混合即得1000ml試劑r2。3.α1-微球蛋白校準(zhǔn)品制備：在20mmph7.2的pbs溶液(含0.3％bsa、0.05％nan3)中加入α1-微球蛋白抗原(市售，深圳菲鵬生物)，配制成濃度120mg/l，除菌過濾，校準(zhǔn)品均為無色透明液體。4.α1-微球蛋白的測定檢測工具：au680型全自動生化分析儀。分析方法：兩點終點法；主波長：600nm，副波長：無；樣品量：2.0μl；取實施例1制得的試劑r1：240μl；試劑r2：60μl；校準(zhǔn)模式：多點非線性；反應(yīng)方向：上升；測定溫度：37℃；測試時間：10min2.0μl血清/血漿樣品(從上海新華醫(yī)院獲得)與試劑240μlr1混勻后，于5分鐘時加入試劑60μlr2，立即讀取吸光度a1；于37℃反應(yīng)5分鐘后讀取吸光度a2。反應(yīng)吸光度的計算為a2與a1的校準(zhǔn)差值。參考范圍：血清10～30mg/l5.結(jié)果說明：所配試劑與對照試劑樣本測試比對樣本例數(shù)：50例儀器：奧林巴斯au680從圖1中可見，自配試劑與進口對照試劑相關(guān)性良好。實施例2：檢測α1-微球蛋白試劑盒的制備1.本發(fā)明的試劑盒涉及試劑的主要原材料如下：抗人α1-微球蛋白抗體(深圳菲鵬生物)膠乳微球：采用直徑為95nm和188nm帶羧基基團的聚苯乙烯膠乳顆粒(日本捷時雅)2.本實施例的主要試劑的配制如下：試劑r1：50mmh3bo3緩沖液，加入0.4％peg6000，0.05％nan3，0.3％bsa，0.8％nacl，0.1％吐溫-20，ph值8.5，總制備量1l，該試劑為無色或微黃色透明溶液。試劑r2：50mmh3bo3緩沖液，含0.15％α1-微球蛋白抗體包被的膠乳微球、0.4％bsa，0.5％nacl，0.3％蔗糖，0.05％nan3，ph值8.5，該試劑為乳白色溶液。具體制備步驟如下：(1)1.2g68nm膠乳微球，加入16mlph值6.1的mes溶液、3.2ml新鮮配制的edc溶液(20mg/ml)，純化水補足體積至160ml，充分混勻，20～30℃混合30min；(2)取0.3g220nm膠乳微球，加入4mlph6.1的mes溶液、0.6ml新鮮配制的edc溶液(20mg/ml)，純化水補足體積至40ml，充分混勻，室溫20～30℃混合30min；(3)將質(zhì)量比(微球：抗體)為20:1的抗人α1-微球蛋白抗體(60mg，6.2mg/ml)加入步驟1的體系中，20～30℃混合1h；(4)將質(zhì)量比(微球：抗體)為50:1的抗人α1-mg抗體(6mg，6.2mg/ml)加入步驟2的體系中，20～30℃混合1h；(5)將步驟3和步驟4中反應(yīng)完全的體系分別經(jīng)14000rpm(allegra64rcentrifuge，beckmancoulter)離心50min，各加入160/40mlph8.5、50mm的h3bo3緩沖液，超聲破碎儀(jy9r-iidn，寧波新芝生物)重懸；(6)在步驟5重懸后的體系中，分別加入10ml20％bsa溶液，20～30℃混合1h；(7)用ph8.5、50mm的h3bo3緩沖液(0.4％bsa，0.5％nacl，0.3％蔗糖，0.05％nan3)，分別稀釋步驟6的兩個體系至膠乳微球終濃度為0.15％，分別得到800ml95nm偶聯(lián)抗人α1-微球蛋白抗體的膠乳微球溶液與200ml188nm偶聯(lián)抗人α1-微球蛋白抗體的膠乳微球溶液。(8)將800ml95nm偶聯(lián)抗人α1-微球蛋白抗體的膠乳微球溶液與200ml188nm偶聯(lián)抗人α1-微球蛋白抗體的膠乳微球溶液按體積比8:2混合即得1000ml試劑r2。制備試劑盒：試劑盒裝量如下所述r1：2x60ml/每瓶r2：2x15ml/每瓶校準(zhǔn)品：1ml，120mg/l3.α1-微球蛋白校準(zhǔn)品制備：在20mmph7.2的pbs溶液(含0.3％bsa、0.05％nan3)中加入α1-微球蛋白抗原(市售，深圳菲鵬生物)，配制成濃度120mg/l，除菌過濾，校準(zhǔn)品均為無色透明液體。連續(xù)配制3個批號的試劑盒(r1+r2+校準(zhǔn)品)，配方及步驟一致，4.α1-微球蛋白的測定檢測工具：au680型全自動生化分析儀。分析方法：兩點終點法；主波長：600nm，副波長：無；樣品量：2.0ul；實施例1制得的試劑r1：240ul；試劑r2：60ul；校準(zhǔn)模式：多點非線性；反應(yīng)方向：上升；測定溫度：37℃；測試時間：10min血清/血漿樣品(從醫(yī)院獲得)與試劑r1混勻后，于5分鐘時加入試劑r2，立即讀取吸光度a1；于37℃反應(yīng)5分鐘后讀取吸光度a2。反應(yīng)吸光度的計算為a2與a1的校準(zhǔn)差值。參考范圍：血清10～30mg/l5.結(jié)果說明：所配試劑與對照試劑樣本測試比對樣本例數(shù)：50例儀器：奧林巴斯au680從圖2中可見，自配試劑與進口對照試劑相關(guān)性良好實施例3:α1-微球蛋白試劑r2中試放大(切向流過濾)r2試劑由小樣向中試放大過程中，通常包括離心和切向流過濾兩種方法；離心方法簡便易行，但是單次制備量少，批間差難以控制；相比之下，切向流過濾則可較好的解決批間差問題，只要指標(biāo)控制得當(dāng)，便可較穩(wěn)定的大量制備r2試劑。本實施例中所用的原材料及試劑組分詳見實施例1，制備步驟與實施例1保持一致，制備r2試劑總量為4l(68nm偶聯(lián)抗α1-微球蛋白抗體的膠乳微球溶液2l；188nm偶聯(lián)抗α1-微球蛋白抗體的膠乳微球溶液2l；兩種溶液按1：1混合，終體積4l)；制備步驟如下：(1)8.75g68nm膠乳微球，加入50mlph值6.1的mes溶液、200mgedc，純化水補足體積至500ml，充分混勻，20～30℃混合30min；(2)取8.75g220nm膠乳微球，加入50mlph6.1的mes溶液、130mgedc，純化水補足體積至500ml，充分混勻，室溫20～30℃混合30min；(3)將質(zhì)量比(微球：抗體)為12:1的抗人α1-微球蛋白抗體(729mg，6.2mg/ml)加入步驟1的體系中，20～30℃混合1h；(4)將質(zhì)量比(微球：抗體)為35:1的抗人α1-mg抗體(250mg，6.2mg/ml)加入步驟2的體系中，20～30℃混合1h；(5)對上述兩個500ml體系分別進行切向流過濾(krosfloresearchiiitffsystem，spectrum公司)，選擇合適的中空纖維柱(spectrum公司，mpes/500kd/790cm2)，按說明書組裝設(shè)備和中空纖維柱，控制剪切力值為3000，在此條件下過濾4倍于500ml體系的mopsph7.7緩沖液；(6)過濾完成后，加入50ml20％bsa溶液，20～30℃混合1h；(7)用ph7.7、50mm的mops緩沖液(1.5％bsa，1.7％nacl，1.3％蔗糖，0.08％nan3)分別稀釋上述體系至2l(偶聯(lián)抗人α1-微球蛋白抗體的膠乳微球溶液終濃度為0.35％)；(8)2l68nm偶聯(lián)抗人α1-微球蛋白抗體的膠乳微球溶液與2l220nm偶聯(lián)抗人α1-微球蛋白抗體的膠乳微球溶液按體積比1:1混合即得4l試劑r2。5.結(jié)果說明：所配試劑與對照試劑樣本測試比對樣本例數(shù)：50例儀器：奧林巴斯au680從圖3中可見，自配試劑與進口對照試劑相關(guān)性良好。實施例4自配試劑與進口對照試劑校準(zhǔn)曲線比較下表為自配試劑與對照試劑在不同校準(zhǔn)品濃度下的吸光度對比；圖6計算可得，兩者的線性相關(guān)系數(shù)r2＝0.99881，表明兩者校準(zhǔn)曲線的一致性較好校準(zhǔn)品濃度(mg/l)自配試劑吸光度對照試劑吸光度00.0045-0.010157.50.011820.0124150.034510.03775300.091360.09455600.233410.230151200.513280.53075。當(dāng)前第1頁12