本發(fā)明涉及炎癥性腸病篩查或輔助診斷技術(shù)領(lǐng)域，同時(shí)也涉及一種用于檢測(cè)PSMA7蛋白濃度的物質(zhì)的新用途。

背景技術(shù)：

炎癥性腸病(inflammatory bowel diseases，IBD)是一組世界范圍內(nèi)的慢性非特異性腸道炎癥性疾病，包括潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)和克羅恩病(Crohn's disease，CD)兩個(gè)獨(dú)立疾病。該類疾病除反復(fù)發(fā)作、遷延難愈、目前尚無特效治療手段外，也可能增加患者罹患結(jié)直腸癌的風(fēng)險(xiǎn)，嚴(yán)重影響患者身心健康。據(jù)報(bào)道，近十余年來，我國(guó)IBD的發(fā)病率呈逐年增加趨勢(shì)，已成為消化系統(tǒng)的常見疾病。

IBD的發(fā)病原因尚未完全闡明，通常認(rèn)為其發(fā)生是與腸道微生物、宿主遺傳易感性、免疫應(yīng)答失衡等多因素有關(guān)的復(fù)雜的過程，其中腸道菌群失調(diào)被認(rèn)為是重要的高危因素。

IBD的正確診斷和鑒別診斷是規(guī)范化治療的基礎(chǔ)。篩查出早期IBD患者，及時(shí)給予個(gè)體化治療，對(duì)于IBD的病情緩解、減少并發(fā)癥、預(yù)防復(fù)發(fā)、提高生活質(zhì)量非常重要。但是，IBD的早期診斷較難。目前IBD仍然依靠排他性的診斷，需要結(jié)合病史、臨床表現(xiàn)、實(shí)驗(yàn)室和影像學(xué)檢查、腸鏡和病理學(xué)發(fā)現(xiàn)進(jìn)行全面分析判斷，其中腸鏡檢查和活檢標(biāo)本的病理學(xué)診斷是最關(guān)鍵步驟。

腸鏡檢查是將腸鏡經(jīng)肛門循腔插至回盲部，從黏膜側(cè)觀察結(jié)腸病變，是目前發(fā)現(xiàn)腸道腫瘤及癌前病變最簡(jiǎn)便、安全、有效的方法。但是，內(nèi)鏡檢查畢竟是一種侵入性檢查方式，可造成患者不適和一些并發(fā)癥；不少患者因畏懼和拒絕這種檢查而錯(cuò)過大腸病變?cè)缙谠\斷和早期治療的最佳時(shí)機(jī)。即使近年來全麻下無痛腸鏡檢查技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用極大地減少了患者的不適感，但這并不改變腸鏡是一種侵入性檢查方法的事實(shí)，給患者的身心帶來一定痛苦，費(fèi)用也較高昂。

參考文獻(xiàn)1：Cleynen,I.,et al.(2011)."Genetic evidence supporting the association of protease and protease inhibitor genes with inflammatory bowel disease:a systematic review."PloS One 6(9):e24106.公開了CYDL蛋白與IBD具有聯(lián)系。CYLD蛋白是一種去泛素化酶，由人體CYLD基因編碼，研究表明IBD病人腸道組織中CYLD基因表達(dá)異常。但該文獻(xiàn)仍然以腸道組織為對(duì)象，在腸道以外，例如口腔中是否能檢測(cè)出異常表達(dá)的CYLD蛋白并不可知。

參考文獻(xiàn)2：Hu,X.T.,et al.,The proteasome subunit PSMA7located on the 20q13amplicon is overexpressed and associated with liver metastasis in colorectal cancer.Oncol Rep,2008.19(2):p.441-6.報(bào)道了PSMA7在結(jié)腸癌組織中高表達(dá)。該研究指出，PSMA7在結(jié)腸癌組織的表達(dá)率遠(yuǎn)高于正常大腸組織。但此研究只能說明腸道組織PSMA7的表達(dá)量不同，口腔樣本(如唾液)中PSMA7的表達(dá)量是否有差異并不知道，所以也不能得出唾液PSMA7與結(jié)腸癌及IBD有關(guān)系。

所以，尋找敏感的、簡(jiǎn)單易行的IBD篩查方法，對(duì)于早期發(fā)現(xiàn)IBD具有重要意義?？谇幌啾扔谀c道，具有易接觸、方便檢測(cè)的巨大優(yōu)勢(shì)。但目前尚未報(bào)道過一種通過口腔唾液蛋白酶體蛋白來安全、快速、有效、簡(jiǎn)單易行地篩查或者診斷IBD的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

當(dāng)前早期診斷IBD的方法太繁復(fù)，腸鏡檢查也具有侵入性，給患者身心造成一定負(fù)擔(dān)。本發(fā)明的目的是提供一種簡(jiǎn)便易行的篩查和輔助診斷方法，對(duì)疑似IBD就診患者進(jìn)行初篩，免去所有就診患者均需先進(jìn)行腸鏡檢查的麻煩和對(duì)患者的不良影響。本發(fā)明涉及一種用于檢測(cè)PSMA7蛋白濃度的物質(zhì)的新用途，該新用途具體涉及用于檢測(cè)PSMA7蛋白濃度的物質(zhì)在制備篩查或輔助診斷炎癥性腸病IBD產(chǎn)品中的應(yīng)用。其中炎癥性腸病IBD具體包括潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)和/或克羅恩病(Crohn's disease，CD)。所述篩查或輔助診斷炎癥性腸病的產(chǎn)品以人唾液為待測(cè)樣本，該P(yáng)SMA7蛋白為口腔唾液蛋白酶體蛋白PSMA7。所述用于檢測(cè)PSMA7蛋白濃度的物質(zhì)為PSMA7蛋白抗體。所述蛋白酶體蛋白PSMA7參與組成20S蛋白酶體核心復(fù)合體，其編碼基因定位于20q13.33染色體。

所述篩查或輔助診斷炎癥性腸病相關(guān)產(chǎn)品可為用于篩查或診斷炎癥性腸病的各種試劑或試劑盒。即本發(fā)明還涉及一種用于篩查或輔助診斷炎癥性腸病的試劑盒，其特征在于試劑盒包括用于檢測(cè)PSMA7蛋白濃度的物質(zhì)。炎癥性腸病具體包括潰瘍性結(jié)腸炎和/或克羅恩病。該試劑盒所針對(duì)的檢測(cè)樣本可以為人唾液樣本。其還可以包括陰性對(duì)照樣本，以及陽(yáng)性對(duì)照樣本，所述陽(yáng)性對(duì)照樣本為炎癥性腸病患者樣本。進(jìn)一步所述陰性對(duì)照樣本為健康人的唾液樣本，所述陽(yáng)性對(duì)照樣本可以為炎癥性腸病患者的唾液樣本。具體地，試劑盒還可以包括用于處理唾液樣本的唾液預(yù)處理單元、PSMA7標(biāo)準(zhǔn)品、PSMA7抗體及β-actin抗體。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述用于檢測(cè)PSMA7蛋白濃度的物質(zhì)為anti-PSMA7,cat.no.ab133505,來自Abcam公司，英國(guó)劍橋；內(nèi)參為anti-actin-β，上述anti-actin-β為來自Abcam公司的cat.no.ab6275，英國(guó)劍橋。當(dāng)然，也可以為其它類型的抗體或者其他可用于檢測(cè)PSMA7蛋白濃度的物質(zhì)。

本發(fā)明還涉及一種篩查或輔助診斷炎癥性腸病的方法，其包括通過檢測(cè)PSMA7蛋白在樣本中的濃度來篩查或輔助診斷炎癥性腸病。其中炎癥性腸病具體包括潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩病。進(jìn)一步，該方法以人唾液為待測(cè)樣本，該P(yáng)SMA7蛋白為口腔唾液蛋白酶體蛋白PSMA7。

該方法具體可以包括如下步驟：(1)、提取唾液；(2)、樣本預(yù)處理；(3)、檢測(cè)口腔唾液蛋白酶體蛋白PSMA7；(4)、數(shù)據(jù)處理，篩查或輔助診斷炎癥性腸病。

具體地，其中步驟(1)為使患者清晨空腹靜息狀態(tài)下，先用清水漱口五分鐘，往無菌離心管中吐出約2ml唾液。

步驟(2)具體為唾液在10000g/min離心后提取上清，保存于-80℃待用。

步驟(3)具體為shotgun質(zhì)譜分析：從病人及健康對(duì)照組唾液中提取唾液蛋白進(jìn)行shotgun質(zhì)譜分析；蛋白通過10％SDS-PAGE分離，其中SDS-聚丙烯酰胺凝膠，即使用濃度為10％的SDS-聚丙烯酰胺凝膠分離膠，每個(gè)樣本凝膠泳道切5-6塊，通過甲醇溶解，裝入LTQ Orbitrap Velos機(jī)器分析；通過LC-MS/MS質(zhì)譜得到蛋白質(zhì)ID和蛋白質(zhì)原始峰度值。

步驟(4)具體為定量PSMA7表達(dá)，在unique peptide>2，score>10，且PSM值相比健康人有顯著差異或統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，即說明蛋白質(zhì)表達(dá)量越高，可以高度懷疑IBD。其中，PSM值為Peptide-to-spectrum matches，即顯示蛋白質(zhì)確定的肽序列總數(shù)(肽譜匹配)，Unique peptides是顯示蛋白質(zhì)組的唯一的肽序列的數(shù)目，Score顯示蛋白質(zhì)得分，這是個(gè)別肽的分?jǐn)?shù)的總和。

此外，步驟(3)也可以采用western blotting方法，試劑包括anti-actin-β、anti-PSMA7。

實(shí)驗(yàn)證明，口腔唾液中的PSMA7蛋白可以作為炎癥性腸病IBD的標(biāo)志物，使用檢測(cè)PSMA7蛋白濃度的物質(zhì)對(duì)炎癥性腸病進(jìn)行篩查或者輔助診斷，其結(jié)果準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)便，使用安全，具有很大的應(yīng)用價(jià)值。通過對(duì)口腔唾液樣本進(jìn)行檢測(cè)，能夠簡(jiǎn)單方便的采集樣本，減少患者在采樣過程中產(chǎn)生的痛苦，降低采樣過程中產(chǎn)生的成本，極大地緩解患者的抵觸情緒，有利于對(duì)IBD患者的早期篩查。

附圖說明

圖1，A.健康對(duì)照組與IBD組患者唾液蛋白質(zhì)組成。

圖2，基于shotgun蛋白結(jié)果從生物過程A，細(xì)胞組成B及分子功能C三方面進(jìn)行63個(gè)差異性蛋白質(zhì)的GO分析。一些高峰度值條目如急性炎癥反應(yīng)，蛋白酶體復(fù)合物，內(nèi)肽酶活性等與炎癥性腸病相關(guān)。

圖3，A.Western blotting檢測(cè)唾液PSMA7在健康組，CD組及UC組表達(dá)量。PSMA7僅表達(dá)在CD組及UC組患者唾液中。B.檢測(cè)CD活動(dòng)組，CD緩解組，UC活動(dòng)組，UC緩解組中PSMA7表達(dá)量。結(jié)果顯示PSMA7表達(dá)量在緩解期患者中大幅度降低。

具體實(shí)施方式

實(shí)驗(yàn)材料：口腔唾液樣本來自：37UC，11例CD，10例健康對(duì)照。UC和CD為根據(jù)患者病史、臨床表現(xiàn)、實(shí)驗(yàn)室和影像學(xué)檢查、以及腸鏡和活檢標(biāo)本的病理學(xué)發(fā)現(xiàn)進(jìn)行全面分析判斷的確診患者。對(duì)照組來自年齡、性別匹配的健康志愿者。所有樣本均來自北京大學(xué)人民醫(yī)院消化內(nèi)科。這項(xiàng)研究由北京大學(xué)生物醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。所有參與者均提供書面知情同意書。

實(shí)驗(yàn)方法：

1)、提取唾液：使患者清晨空腹靜息狀態(tài)下，先用清水漱口五分鐘，往無菌離心管中吐出約2ml唾液。唾液樣本隨即保存在冰盒中運(yùn)送回北京大學(xué)口腔醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室。

2)、樣本預(yù)處理：唾液在10000g/min離心后提取上清，保存于-80℃待用。

3)、shotgun質(zhì)譜分析：從病人及健康對(duì)照組唾液中提取唾液蛋白進(jìn)行shotgun質(zhì)譜分析。蛋白通過10％SDS-PAGE分離，其中SDS-聚丙烯酰胺凝膠，即使用濃度為10％的SDS-聚丙烯酰胺凝膠分離膠，每個(gè)樣本凝膠泳道切5-6塊，通過甲醇溶解，裝入LTQ Orbitrap Velos機(jī)器分析。通過LC-MS/MS質(zhì)譜得到蛋白質(zhì)ID和蛋白質(zhì)原始峰度值。

4)、數(shù)據(jù)處理：在Uniprot website搜尋從LC-MS/MS得到的原始數(shù)據(jù)并進(jìn)行分析。Gene ontology(GO)分析在DAVID網(wǎng)站進(jìn)行。Image J軟件主要用于分析三組樣本western blotting結(jié)果差異。

5)、western blotting驗(yàn)證蛋白：western blotting用于驗(yàn)證IBD患者和健康人唾液差異蛋白PSMA7的表達(dá)(anti-actin-β，cat.no.ab6275；anti-PSMA7,cat.no.ab133505,來自Abcam公司，英國(guó)劍橋)。一抗稀釋濃度1:1000，二抗稀釋濃度1:15000。

實(shí)驗(yàn)材料：Invitrogen唾液預(yù)處理試劑盒試劑A，PSMA7標(biāo)準(zhǔn)品，abcam公司PSMA7抗體及β-actin抗體。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

1)、唾液蛋白在IBD患者及健康對(duì)照中的表達(dá)

如圖1所示，IBD患者及健康人唾液中的蛋白質(zhì)表達(dá)不同。本研究在健康人唾液中檢測(cè)出了1408種蛋白，而在IBD患者中檢測(cè)出超過2000種蛋白。在健康人的1408種蛋白中，分別有399及392種蛋白質(zhì)表達(dá)在CD和UC患者中，279種蛋白表達(dá)在三者中。原始peptide-to-spectrum matches(PSM值，顯示蛋白質(zhì)確定的肽序列總數(shù)(肽譜匹配))從系統(tǒng)數(shù)據(jù)庫(kù)自動(dòng)生成的，可以為三組蛋白的對(duì)比提供有用數(shù)據(jù)，并顯示某些蛋白質(zhì)的富集。通過以下標(biāo)準(zhǔn)篩選蛋白質(zhì)：unique peptides>2以及score>10，其中，Unique peptides是顯示蛋白質(zhì)組的唯一的肽序列的數(shù)目，Score顯示蛋白質(zhì)得分，這是個(gè)別肽的分?jǐn)?shù)的總和。通過此種篩選方法，我們鑒定出8種僅表達(dá)在IBD(UC和CD)中的蛋白以及他們的基因。此外，CD及UC組中分別含有26及29種特異性蛋白。接下來，在DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)中從生物過程，分子功能及細(xì)胞組成三個(gè)方面進(jìn)行GO分析僅在IBD患者中表達(dá)的63個(gè)基因。如圖2所示，大部分富極度高的GO條目與急性炎癥反應(yīng)，蛋白酶體復(fù)合體，蛋白酶體及免疫反應(yīng)相關(guān)。具體來說，圖2為基因分析(Geno ontology)圖，包含三個(gè)部分：圖2A顯示生物過程(biological process)，生物學(xué)過程系指由一個(gè)或多個(gè)分子功能有序組合而產(chǎn)生的系列事件；圖2B顯示細(xì)胞組分(cellular component)，細(xì)胞的每個(gè)部分和細(xì)胞外環(huán)境；圖2C顯示分子功能(molecular function)，可以描述為分子水平的活性(activity)，如催化(catalytic)或結(jié)合(binding)活性。圖2A，2B，2C左側(cè)縱坐標(biāo)為生物過程的各個(gè)條目，上方橫坐標(biāo)為富極度，若一個(gè)條目富極度越高，說明我們篩選的基因落于這個(gè)條目中的越多，可能性越大。通過GO分析，一些高富極度的條目，如酶的活性(endopeptidase activity)，急性炎癥反應(yīng)(acute inflammatory response)以及膜攻擊復(fù)合物(membrane attack complex)，均與炎癥及蛋白酶體相關(guān)。這些條目中豐富的基因鑒別與我們的假設(shè)相符合。急性炎癥反應(yīng)的高豐富度分?jǐn)?shù)在IBD中有所表現(xiàn)。篩選基因應(yīng)符合以下條件：與高豐富度條目相關(guān)的基因在UC和CD中表達(dá)有所差異，同時(shí)這些基因在健康人中表達(dá)幾乎為零。因此，我們選擇了PSMA7。

2)、GO分析IBD患者唾液蛋白

通過GO分析，一些高富極度的條目，如酶的活性，急性炎癥反應(yīng)以及膜攻擊復(fù)合物，均與炎癥及蛋白酶體相關(guān)。這些條目中豐富的基因鑒別與我們的假設(shè)相符合。急性炎癥反應(yīng)的高豐富度分?jǐn)?shù)在IBD中有所表現(xiàn)。篩選基因應(yīng)符合以下條件：與高豐富度條目相關(guān)的基因在UC和CD中表達(dá)有所差異，同時(shí)這些基因在健康人中表達(dá)幾乎為零。因此，我們選擇了proteasome subunit alpha type7(PSMA7,NCBI GENE ID:5688)作為目標(biāo)蛋白，其屬于蛋白酶活性的富集條目。因?yàn)镻SMA7在CD患者中PSM值為28，UC患者中為44，而在健康人中PSM值為0，符合我們的篩選條件。腸道分泌的PSMA7通過載體運(yùn)輸至口腔，作為蛋白酶體蛋白，可以降解其他蛋白質(zhì)。另外，PSMA7與腸道炎癥相關(guān)，并且與腸道癌癥轉(zhuǎn)移相關(guān)。

3)、western blotting驗(yàn)證特異性蛋白

western blotting驗(yàn)證個(gè)體樣本中PSMA7的表達(dá)，其結(jié)果在圖3A中顯示。PSMA7表達(dá)水平在CD及UC組中顯著提高，而在健康對(duì)照中表達(dá)幾乎為零，與我們之前的結(jié)果向照應(yīng)。另外，通過western blotting對(duì)不同階段的患者唾液也進(jìn)行驗(yàn)證(圖3B)。結(jié)果顯示緩解期UC和CD患者唾液中PSMA7表達(dá)量與活動(dòng)期相比大大降低。

具體診斷步驟

1)、提取唾液：使患者清晨空腹靜息狀態(tài)下，先用清水漱口五分鐘，往無菌離心管中吐出約2ml唾液。如不馬上進(jìn)行下面操作步驟，唾液樣本可隨即保存在冰盒中待用。

2)、樣本預(yù)處理：唾液在10000g/min離心后提取上清，保存于-80℃待用。

3)、shotgun質(zhì)譜分析：從病人及健康對(duì)照組唾液中提取唾液蛋白進(jìn)行shotgun質(zhì)譜分析。蛋白通過10％SDS-PAGE分離，其中SDS-聚丙烯酰胺凝膠，即使用濃度為10％的SDS-聚丙烯酰胺凝膠分離膠，每個(gè)樣本凝膠泳道切5-6塊，通過甲醇溶解，裝入LTQ Orbitrap Velos機(jī)器分析。通過LC-MS/MS質(zhì)譜得到蛋白質(zhì)ID和蛋白質(zhì)原始峰度值。

4)、數(shù)據(jù)處理：定量PSMA7表達(dá)，在unique peptide>2，score>10，且PSM值相比健康人有顯著差異或統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，即可以高度懷疑IBD。

5)、步驟3)也可以采用western blotting方法，試劑包括anti-actin-β，cat.no.ab6275、anti-PSMA7，cat.no.ab133505，來自Abcam公司，英國(guó)劍橋，一抗稀釋濃度1:1000,二抗稀釋濃度1:15000。

綜上所述，本發(fā)明技術(shù)方案能夠帶來有益的技術(shù)效果。本發(fā)明為早期篩查和輔助診斷IBD提供了一種準(zhǔn)確性高、方便簡(jiǎn)潔、非侵入性、低成本的方法。通過檢測(cè)患者唾液中PSMA7表達(dá)量，消化科首次就診患者可先通過該方法進(jìn)行篩查，結(jié)果為陽(yáng)性者再進(jìn)一步接受腸鏡檢查。這在患者心理上、身體上、經(jīng)濟(jì)上更容易被接受。具有很大的應(yīng)用價(jià)值。