本發(fā)明涉及檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，是一種人體血清中重要的小分子生物標(biāo)志物α-酮戊二酸的直接定量檢測(cè)試劑盒。

背景技術(shù)：

α-酮戊二酸(α-Ketoglutaric acid，簡(jiǎn)稱α-KA，CAS：328-50-7)是一種重要的生物化合物，其通常存在的形式是它的陰離子，即α-酮戊二酸鹽(α-ketoglutarate，簡(jiǎn)稱α-KG)。α-酮戊二酸是三羧酸循環(huán)中的一個(gè)關(guān)鍵物質(zhì)，在循環(huán)中的位置位于異檸檬酸之后以及琥珀酰輔酶A之前。氨基酸的氨基通過轉(zhuǎn)氨基作用被結(jié)合到α-酮戊二酸之上，并隨著血液載到肝臟，在肝臟中氨進(jìn)入尿素循環(huán)，所以α-酮戊二酸廣泛存在于人體血清中。已有的研究結(jié)果表明，血液中的α-酮戊二酸濃度變化與眾多疾病密切相關(guān)，例如非酒精性脂肪肝和急性髓細(xì)胞白血病等，因此檢測(cè)血清中α-酮戊二酸的濃度變化具有著重要的臨床診斷意義(Weihai He,et al.,Nature,2004,429,188-193；E Rodriguez-Gallego et al.,Int.J.Obesity.,2015,39,279-287；Perl,A.E.et al.,Blood,2012,121,4917-4924)。

眾所周知，肝硬化是臨床常見的慢性進(jìn)行性肝病，由一種或多種病因長期或反復(fù)作用形成的彌漫性肝損害。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，每年約30萬人因肝硬化死亡，其發(fā)病率高居第4位，僅次于惡性腫瘤、心血管病、腦血管病。肝癌更是一種對(duì)人體危害很大的疾病，也是所有癌癥中死亡率、死亡速度最快的惡性腫瘤之一。我國一直是肝癌的高發(fā)區(qū)，由于初期癥狀不明顯，病情進(jìn)展快，腫瘤惡性程度高，易復(fù)發(fā)而導(dǎo)致肝癌患者預(yù)后差，其五年生存率很低。早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療，仍然是改善腫瘤預(yù)后的最好辦法。

傳統(tǒng)檢測(cè)血清中α-酮戊二酸濃度的方法是色譜聯(lián)用檢測(cè)法和核磁共振法。但由于α-酮戊二酸的分子量較小，難以直接應(yīng)用色譜聯(lián)用檢測(cè)法對(duì)其進(jìn)行定量檢測(cè)，需要對(duì)血清進(jìn)行復(fù)雜的預(yù)處理，比如對(duì)α-酮戊二酸進(jìn)行芳環(huán)加成衍生反應(yīng)預(yù)處理，其操作過程不僅繁瑣、費(fèi)時(shí)，且易產(chǎn)生干擾副產(chǎn)物導(dǎo)致測(cè)試誤差大，靈敏度差。雖然核磁共振方法適合于臨床無創(chuàng)檢測(cè)，但其儀器昂貴，檢測(cè)成本較高，耗費(fèi)時(shí)間較久，難以實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)。目前，已有利用熒光法檢測(cè)水溶液中α-酮戊二酸濃度變化的報(bào)道，但由于其無法直接應(yīng)用于血清中檢測(cè)α-酮戊二酸，且存在特異性差、響應(yīng)速度慢等缺陷，極大地限制了其在體外原位診斷中的應(yīng)用(Pengwei Jin,et al.,Chem.Sci.,2014,5,4012-4016)。同時(shí)，由于α-酮戊二酸在人體中的廣泛存在，市面上已經(jīng)有專門用于定量或半定量檢測(cè)α-酮戊二酸的α-酮戊二酸的試劑盒，例如效果較好的分別是Biovision和Sigma-Aldrich公司的α-酮戊二酸試劑盒。其中Biovision公司的α-酮戊二酸試劑盒的檢測(cè)量程為0.01-10nmol(http://www.amyjet.com/products/K677-100.shtml)。Sigma-Aldrich公司的α-酮戊二酸試劑盒的檢測(cè)靈敏度為0.01-10nmol(http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search？term＝MAK054&interface＝All_ZH&N＝0&mode＝match％20partialmax&lang＝zh&region＝CN&focus＝product)。但是這些試劑盒價(jià)格昂貴，每測(cè)量1次需要花費(fèi)40到60元不等，測(cè)試前需要較為復(fù)雜的預(yù)處理，并且會(huì)存在很多測(cè)試不精確的問題。數(shù)據(jù)表明目前市面上的試劑盒不能直接用于檢測(cè)血清中的α-酮戊二酸，且價(jià)格高昂，成本太高，測(cè)試不精確。

因此，亟需發(fā)展一種具有簡(jiǎn)單快速高效原位直接檢測(cè)人體血清中α-酮戊二酸濃度的試劑盒，期望其能應(yīng)用于相關(guān)疾病(如肝硬化、肝癌)的臨床診斷中，為早期、快速診斷提供可靠的重要依據(jù)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種人體血清中α-酮戊二酸的直接定量檢測(cè)試劑盒，旨在克服現(xiàn)有技術(shù)中如無法直接測(cè)量、檢測(cè)方法繁瑣、成本高昂等不足，從而極大地拓展其在臨床診斷中的應(yīng)用。應(yīng)用本發(fā)明中的試劑盒對(duì)人體血清標(biāo)本(73例)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明相比于正常人，肝硬化和肝癌病患血液中α-酮戊二酸的濃度數(shù)值顯著偏高，因此在肝硬化和肝癌的臨床診斷中，準(zhǔn)確測(cè)量人體血液中的α-酮戊二酸濃度變化可以作為早期臨床診斷的重要依據(jù)。

本發(fā)明的第一方面，提供一種人體血清中α-酮戊二酸的直接定量檢測(cè)試劑盒，包括：血清分裝管、hepes緩沖液、還原性輔酶、酶穩(wěn)定劑、熒光染料和α-KG標(biāo)準(zhǔn)物。

其中，所述的hepes緩沖液pH值為7.0，含量為50μmol/L。

所述的還原性輔酶包含還原型輔酶Q10、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸中的一種或者幾種，含量為5μmol/L。

所述的酶穩(wěn)定劑包含海藻糖、甘露醇、甘油、維生素C、牛血清蛋白中的一種或者幾種，含量為0.5g/L。

所述的熒光染料用于對(duì)血清中α-酮戊二酸進(jìn)行熒光檢測(cè)，含量為5μmol/L，購自泰坦試劑公司。

所述的α-KG標(biāo)準(zhǔn)物含量為50μmol/L，購自泰坦試劑公司。

所述的血清分裝管，其體積大小為1.5mL，購自美國Axygen公司。

本發(fā)明的第二方面，提供一種應(yīng)用上述的試劑盒對(duì)血清中α-酮戊二酸的檢測(cè)方法，包括如下步驟：

A)從零下20℃冰箱內(nèi)取出檢測(cè)試劑盒，同時(shí)準(zhǔn)備待測(cè)人體血清；

B)將上述血清分裝管、hepes緩沖液、還原性輔酶，酶穩(wěn)定劑、熒光染料、α-酮戊二酸標(biāo)準(zhǔn)物和人體血清依次加入到黑色半定量96孔板中，置于酶標(biāo)儀中檢測(cè)熒光強(qiáng)度變化；

C)根據(jù)酶標(biāo)儀讀取的熒光變化值，利用α-酮戊二酸的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法，標(biāo)定出血清中α-KG的濃度。

通過α-酮戊二酸試劑盒成功地檢測(cè)出正常人、肝硬化和肝癌病人血清中α-KG的濃度變化，表明該試劑盒在肝硬化和肝癌的臨床診斷上具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值，對(duì)于肝病的早期檢測(cè)和治療效果的評(píng)價(jià)具有重要意義。

本發(fā)明的第三方面，提供上述的試劑盒在制備人體血清中α-酮戊二酸的直接定量檢測(cè)裝置中的應(yīng)用。

本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于：

1、本發(fā)明方法中使用的檢測(cè)試劑盒可以直接定量檢測(cè)血清中α-酮戊二酸，是其他市面上或者實(shí)驗(yàn)室中檢測(cè)方法不具備的。

2、本發(fā)明的方法所采用的熒光測(cè)試儀器是酶標(biāo)儀，具有非常高的靈敏度和檢測(cè)限，屬于操作簡(jiǎn)單、快速、高通量的檢測(cè)方法。

3、本發(fā)明屬于體外原位檢測(cè)，且具有快速、高效、簡(jiǎn)便等特征，其可操作性和安全性有保障。

4、人體血清標(biāo)本(73例)的檢測(cè)結(jié)果表明，利用本發(fā)明試劑盒檢測(cè)出正常人、肝硬化和肝癌病人三者之間的α-酮戊二酸濃度存在顯著差異，其中肝硬化和肝癌病患者血清中α-酮戊二酸濃度明顯高于正常人群。

利用本發(fā)明的試劑盒可快速高效地檢測(cè)到肝硬化和肝癌病人血清中的α-酮戊二酸濃度，為檢測(cè)篩選早期肝硬化和肝癌患者提供了技術(shù)保證。同時(shí)相比于傳統(tǒng)的色譜聯(lián)用檢測(cè)法、核磁共振法等，本發(fā)明中采用的試劑盒成本低廉，操作簡(jiǎn)單，具有快速高通量特征；且用于檢測(cè)血清中α-酮戊二酸的試劑盒具有特異選擇性和較高的穩(wěn)定性，而相對(duì)于生物檢測(cè)法，其在操作可重復(fù)性上有明顯的改進(jìn)。

應(yīng)用本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒無需對(duì)血清樣本進(jìn)行任何預(yù)處理，可以直接、快速、高效地檢測(cè)血清中α-酮戊二酸的濃度，檢測(cè)限為0.1μM。本發(fā)明方法所提供的直接檢測(cè)血清中α-酮戊二酸試劑盒，具有操作簡(jiǎn)便、成本低廉、特異性好、直接檢測(cè)、可重復(fù)性好等多個(gè)優(yōu)點(diǎn)。特別是應(yīng)用本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒對(duì)總共73例人體血清樣本檢測(cè)顯示，正常人和肝硬化、肝癌患者血清中α-酮戊二酸的濃度存在著顯著差異，表明該試劑盒可以作為診斷肝硬化、肝癌的有效工具，對(duì)于肝病的早期檢測(cè)和治療效果的評(píng)價(jià)具有重要意義和廣闊的應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1為正常人、肝硬化和肝癌病人血清中α-KA的濃度分布(n代表樣本個(gè)數(shù))。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明提供的具體實(shí)施方式作詳細(xì)說明。

實(shí)施例1

1、血清樣品的采集與處理

肝硬化和肝癌病人清晨抽取靜脈血5mL，不抗凝，放入0℃冰箱中保存60min，取出后在5000rpm離心15分鐘，取上清液分裝于1.5mL的與血清分裝管中。

2、α-酮戊二酸試劑盒對(duì)人體血清中α-酮戊二酸的檢測(cè)

a)參數(shù)設(shè)置。將黑色96孔板放入載板臺(tái)中，直接設(shè)置Read→測(cè)試方式Fluorescence intensity→檢測(cè)方法終點(diǎn)/動(dòng)力學(xué)檢測(cè)→光學(xué)器件類型Filters→Ok→出現(xiàn)新的參數(shù)見面，即根據(jù)α-酮戊二酸探針的性質(zhì)選擇激發(fā)波長530nm、發(fā)射波長590nm和增益值為50。設(shè)置完畢后開始檢測(cè)。

b)檢測(cè)血清中α-酮戊二酸濃度。依次將血清樣品、試劑盒溶液解凍后等注入孔中，置于載板臺(tái)檢測(cè)。將血清樣品注入50微升于每個(gè)孔中，hepes緩沖液、還原性輔酶、酶穩(wěn)定劑在每個(gè)孔中均注入5微升，熒光染料注入10微升于每個(gè)孔中，再依次注入α-酮戊二酸標(biāo)準(zhǔn)物0、5、10、15、20、25微升。平行測(cè)試三組數(shù)據(jù)，保存數(shù)據(jù)并繪制工作曲線，計(jì)算得出血清中α-酮戊二酸的濃度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。

圖1顯示正常人血清中α-酮戊二酸的濃度在2.5-5×10^-6摩爾/升范圍內(nèi)，肝硬化患者血清中α-酮戊二酸的濃度在8-32×10^-6摩爾/升范圍內(nèi)，肝癌患者血清中α-酮戊二酸的濃度在12-58×10^-6摩爾/升范圍內(nèi)，三者之間α-酮戊二酸濃度的顯著區(qū)別表明了α-酮戊二酸試劑盒可以在血清中原位檢測(cè)α-酮戊二酸的濃度，在肝硬化和肝癌的臨床診斷上具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值，表明了本發(fā)明所提供的試劑盒具有檢測(cè)速度快捷、操作簡(jiǎn)單、花費(fèi)時(shí)間少、不需要大型儀器、血清需求少、有臨床應(yīng)用價(jià)值和可以直接在血清中定量檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，這是其他檢測(cè)α-酮戊二酸手段所不具備或者只具備其一的優(yōu)勢(shì)。

以上已對(duì)本發(fā)明創(chuàng)造的較佳實(shí)施例進(jìn)行了具體說明，但本發(fā)明創(chuàng)造并不限于所述實(shí)施例，熟悉本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不違背本發(fā)明創(chuàng)造精神的前提下還可做出種種的等同的變型或替換，這些等同的變型或替換均包含在本申請(qǐng)權(quán)利要求所限定的范圍內(nèi)。