專利名稱:穩(wěn)定的白蛋白制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及穩(wěn)定性極其優(yōu)良的白蛋白制劑。進(jìn)而詳細(xì)地是涉及穩(wěn)定性、安全性優(yōu)良的、分餾人體血清白蛋白、基因重組人體血清白蛋白等的白蛋白制劑。
背景技術(shù)：
白蛋白制劑是對于急性低白蛋白血病和難以管理的慢性低白蛋白的疾病，通過其補(bǔ)充來改善病態(tài)的藥劑。具體地是廣泛用于改善出血性及外傷性休克時的循環(huán)血漿量的校正或浮腫、肝硬變、腎病癥候群等各種疾病，是近代醫(yī)療不可缺少的醫(yī)藥品(PeterT.Jr.，The Plasma Proteins，Academic Press，New York，133-81(1975).，Rosenorer VM.，Rothschild MA.，Albumin Structure，F(xiàn)unction and Uses，(1977))。
以往人體血清白蛋白制劑的制造是通過分餾從人體采取的血液，用各種的精制手段精制得到的含白蛋白水溶液而進(jìn)行的。作為精制手段，已知有乙醇分餾法、PEG分餾法、硫銨分餾法、將陰離子交換體和69℃、10小時加熱處理組合的方法(日本發(fā)明專利公開1990-191226號公報)、陰離子交換體處理、陽離子交換體處理和60℃、10小時加熱處理組合的方法(日本發(fā)明專利公開1991-17123號公報、日本發(fā)明專利公開1995-330626號公報)等。另一方面，近年對白蛋白確立了再結(jié)合(基因重組)的大量生產(chǎn)技術(shù)，不用獻(xiàn)血就可在工廠大量生產(chǎn)人白蛋白。(臨床分子醫(yī)學(xué)、1、939(1993))
在白蛋白制劑的制造(特別是分餾人體血清白蛋白的制造)中，為了除去有害而熱不穩(wěn)定的病毒，防止混入蛋白質(zhì)等，例如使用低溫殺菌法(60℃、10小時)等的殺菌方法。對于低溫殺菌法，在人體血清白蛋白中加入N-乙?；彼?、辛酸鈉(BallouGA.，Boyer PD.，Luck JM.，Lum FG.，J.Biol.Chem.，153，589-605(1944)，Scatchard G，Strong LE.，Hughes WL.Jr.，AshWorthJN.，Sparrow AH.，J Clin.Invest.，24，571-679(1945)，Boyer PD.，Lum FG.，Ballou GA.，Luch JM.，Rice RG.，J.Biol.Chem.，162，181-198(1946))，但是，N-乙?；彼岽嬖谟心X內(nèi)疾病等副作用的問題。
因此，要求開發(fā)出不混合存在病毒和夾雜蛋白質(zhì)，沒有副作用的危險性、安全，且經(jīng)過長時間也沒有外觀變化和含量降低，可穩(wěn)定保存的白蛋白制劑。

發(fā)明內(nèi)容
在這樣的背景下，本發(fā)明者們發(fā)現(xiàn)N-乙?；鞍彼峥砂l(fā)揮穩(wěn)定白蛋白的優(yōu)良效果，進(jìn)而，發(fā)現(xiàn)通過與中鏈脂肪酸共存，還具有優(yōu)良的抑制凝聚效果。基于這樣的見解，進(jìn)行各種研究的結(jié)果，完成本發(fā)明。
即，本發(fā)明涉及以下發(fā)明。
(1)穩(wěn)定的白蛋白制劑，其特征是含有中鏈脂肪酸或其鹽和含硫氨基酸或其衍生物；(2)上述1所述的白蛋白制劑，其中，中鏈脂肪酸是碳數(shù)6～12的直鏈狀飽和脂肪酸；(3)上述1所述的白蛋白制劑，其中，含硫氨基酸是具有可以烷基化、也可以二硫鍵化的巰基的氨基酸；(4)上述1所述的白蛋白制劑，其中，含硫氨基酸衍生物是N-?；暮虬被嵫苌?；(5)上述1所述的白蛋白制劑，其中，中鏈脂肪酸或其鹽和含硫氨基酸或其衍生物的總添加量是相對于白蛋白約為1倍到20倍摩爾量；(6)上述1所述的白蛋白制劑，其中，白蛋白是基因重組人體血清白蛋白；(7)白蛋白制劑用穩(wěn)定劑，其是由中鏈脂肪酸或其鹽和含硫氨基酸或其衍生物組成；(8)白蛋白制劑的穩(wěn)定方法，其特征是混合中鏈脂肪酸或其鹽和含硫氨基酸或其衍生物。
本發(fā)明制劑中，作為有效成分的白蛋白，可使用分餾人體血清白蛋白和基因重組人體血清白蛋白等。白蛋白制劑通常使用白蛋白含量約5重量/容量％～約25重量/容量％的溶液。作為溶解白蛋白的溶劑，可舉出水(注射用水)、生理食鹽水、作為醫(yī)藥品可給藥的磷酸鹽等的緩沖液等。
添加在本發(fā)明制劑的中鏈脂肪酸，例如可舉出碳數(shù)6～12的脂肪酸、優(yōu)選的是碳數(shù)6～12的直鏈狀飽和脂肪酸。優(yōu)選的具體例子可舉出辛酸、壬酸、癸酸、十一碳烷酸、十二碳烷酸等。作為中鏈脂肪酸的鹽可舉出堿基鹽，例如鈉鹽、鉀鹽等的堿金屬鹽。其中，最優(yōu)選的是辛酸鈉。
作為含硫氨基酸或其衍生物，可舉出具有可烷基化，也可二聚體化(二硫鍵)的巰基(SH基)的氨基酸。含硫氨基酸可舉出在1～3個分子中具有硫原子的氨基酸。其優(yōu)選的具體例子，例如是半胱氨酸、胱氨酸、蛋氨酸等。作為含硫氨基酸的衍生物，可舉出N-酰基體、優(yōu)選的是例如N-甲酰基、N-乙?；-丙?；?、N-丁酰基等的N-(1～6的烷?；?體、更優(yōu)選的是N-乙?；w。其中，最優(yōu)選的是N-乙?；鞍彼帷?br> 在本發(fā)明制劑中，中鏈脂肪酸或其鹽和含硫氨基酸或其衍生物的總添加量，相對于白蛋白，優(yōu)選的是從等摩爾量左右到20倍摩爾量。含硫氨基酸或其衍生物∶中鏈脂肪酸或其鹽的添加摩爾比是0.1～10∶1、優(yōu)選的是0.5～2∶1。中鏈脂肪酸或其鹽及含硫氨基酸或其衍生物，也可分別1種或不少于2種地適宜混合使用。
本發(fā)明制劑，根據(jù)需要也可適量添加在藥理上可容許的著色劑、穩(wěn)定劑、防腐劑、稀釋劑、pH調(diào)節(jié)劑(例如堿性氨基酸、酸性氨基酸、鹽酸、醋酸、蘋果酸、氫氧化鈉等)、滲透壓調(diào)節(jié)劑(例如氯化鈉、氯化鉀、葡糖酸鉀、硫酸鎂、碳酸氫鈉、氯化鈣、葡糖酸鈣、檸檬酸等的電解質(zhì)等)、表面活性劑(例如非離子性表面活性劑等)等。
本發(fā)明制劑的溶液的pH值，根據(jù)需要加入pH調(diào)節(jié)劑，調(diào)整到5～7.5左右、優(yōu)選的是p6.5～7.4左右。本發(fā)明制劑，根據(jù)需要也可含有白蛋白以外的生理活性物質(zhì)。例如，也可加入糖類(例如葡萄糖、果糖等的單糖類、麥芽糖等的二糖類、山梨糖醇、木糖醇等的糖醇類)。
本發(fā)明制劑可用于出血性及外傷性休克時的循環(huán)血漿量的調(diào)節(jié)和浮腫的改善、肝硬化、腎病癥候群等的治療。給藥量，通常作為成人每1次白蛋白，約5g～約12.5g。本發(fā)明制劑的給藥量根據(jù)病態(tài)而不同，也可分成1日1次或2～4次左右給藥。
本發(fā)明制劑幾乎沒有副作用，是低毒性而且安全的，可用自身公知的方法對于人或哺乳動物(例如羊、馬、牛等)皮下或靜脈給藥。
本發(fā)明制劑，可通過將中鏈脂肪酸或其鹽和含硫氨基酸或其衍生物和白蛋白水溶液(作為醫(yī)藥品可給予的磷酸鹽等的緩沖液、注射用水或生理食鹽水等)均勻混合溶解，接著將混合溶液通過制劑處理進(jìn)行制造，例如點滴制劑、注射劑等的適宜非經(jīng)口給藥的劑型。
作為原料使用的中鏈脂肪酸或其鹽和含硫氨基酸或其衍生物及白蛋白，可按照公知方法或自身公知的方法進(jìn)行制造。
作為保存制造的制劑的容器，例如可使用玻璃管瓶或聚丙烯、聚乙烯等的塑料容器。本發(fā)明的白蛋白制劑，可填充到上述容器等中，進(jìn)行密閉、滅菌(60℃/10小時)。
本發(fā)明制劑，顯示了即使進(jìn)行加熱滅菌處理，或者長期保存，外觀變化也少，含量的變化幾乎沒有的優(yōu)良的穩(wěn)定性。



圖1是表示代替實驗例2的未改性聚丙烯酰胺凝膠電泳的圖的代用照片。圖2是表示代替實驗例3的未改性聚丙烯酰胺凝膠電泳的圖的代用照片。圖3是表示實驗例4的HPLC色譜圖。圖4是表示實驗例5的根據(jù)氧化的HSA中的羰基含量圖。
實施發(fā)明的最佳方式以下，用實施例、實驗例具體地說明本發(fā)明，但不受這些的限制。
實施例1將基因重組人體血清白蛋白(以下將人體血清白蛋白簡稱HSA或白蛋白)溶解在生理食鹽水中配制25w/v％HSA生理食鹽水溶液500ml。在其中作為穩(wěn)定化劑添加辛酸鈉1662mg和N-乙?；鞍彼?912.5mg溶解后，在50ml管瓶中各分注HSA生理食鹽水溶液50ml進(jìn)行密封。
實施例2將從血液分餾的HSA溶解在生理食鹽水中，配制25w/v％HSA生理食鹽水溶液500ml。在其中作為穩(wěn)定劑添加辛酸鈉1662mg和N-乙?；鞍彼?912.5mg溶解后，在50ml管瓶中各分注HSA生理食鹽水溶液50ml進(jìn)行密封。
實驗例1(1)供試藥劑的配制按照Chen的方法(Chen RF，J.Biol.Chem.，242，173-181(1967))對基因重組HSA進(jìn)行脫脂。進(jìn)而透析后，進(jìn)行冷凍干燥，用于以下的所有實驗。
在HSA100μM(1/15mM磷酸緩沖液、pH7.4)中添加各種藥劑，配制以下的供試藥劑。
①HSA100μM溶液②HSA100μM+辛酸鈉500μM的溶液③HSA100μM+N-乙?；鞍彼?00μM的溶液④HSA100μM+N-乙酰基蛋氨酸500μM+辛酸鈉500μM的溶液(2)測定方法從這些供試藥劑①～④的差示掃描熱量分析(DSC)測定算出熱轉(zhuǎn)移溫度Tm值及轉(zhuǎn)移焓變化ΔHcal，從熱力學(xué)觀點評價穩(wěn)定化效果。在熱力學(xué)上，熱轉(zhuǎn)移溫度(Tm)上升時，意味著其供試藥劑的穩(wěn)定性增加。另外，若轉(zhuǎn)移焓變化ΔHcal增加時，表示其供試藥劑的穩(wěn)定性增加。
在表1中表示了供試藥劑①～④的熱轉(zhuǎn)移溫度(Tm)及轉(zhuǎn)移焓變化ΔHcal的值。這些值是從HSA溶液的DSC溫度記錄圖中解析出的。
差示掃描熱量測定法(DSC法)DSC是使用MicroCal社制MC-2差示掃描熱量計測定的。將測定條件表示如下。
掃描速度1K/min白蛋白濃度100μM溶劑1/15M磷酸緩沖液(pH7.4)熱變性的可逆性是將初次測定后的白蛋白溶液冷卻后，再加熱確認(rèn)的。其結(jié)果表明，若加熱到85℃以下，白蛋白不引起不可逆的變性，引起可逆的熱轉(zhuǎn)移。得到的溫度記錄圖是使用非線形擬合計算法(Using Origin Tmscientific plotting software)進(jìn)行擬合(fitting)。其結(jié)果，使用得到的過剩熱容量曲線下面積，進(jìn)行如下的解析。
轉(zhuǎn)移焓變化ΔHcal＝∫Cex dTCxe表示過剩熱容量。
(3)結(jié)果如表1表明，添加了各種藥劑的溶液，比不添加HSA溶液都增加熱轉(zhuǎn)移溫度(Tm)。通過添加辛酸鈉，白蛋白的Tm上升約7℃，顯示提高了對于熱的穩(wěn)定性。
另外，即使單獨添加N-乙酰基蛋氨酸，Tm和增加轉(zhuǎn)移焓變化ΔHcal也稍微提高。
添加了辛酸鈉和N-乙酰基蛋氨酸的溶液成為白蛋白更有秩序的立體結(jié)構(gòu)狀態(tài)，是比天然(native)狀態(tài)更穩(wěn)定的狀態(tài)。
表1


實驗例2(1)供試藥劑的配制配制HSA的24μM磷酸緩沖溶液(67mM pH7.4)，向其中添加各種藥劑以便配制成24、72、120μM的濃度的供試藥劑①～④，研究添加藥劑的濃度對于穩(wěn)定化效果的影響。
①HSA24μM②HSA24μM+辛酸鈉③HSA24μM+N-乙?；鞍彼幄蹾SA24μM+N-乙酰基蛋氨酸+辛酸鈉(2)測定方法通過NATIVE-PAGE評價60℃/30分鐘的加熱滅菌的熱穩(wěn)定性。
NATIVE-PAGENATIVE-PAGE使用7.5％(w/V)聚丙烯酰胺凝膠，按照Davis法進(jìn)行。對于蛋白質(zhì)的染色使用庫瑪基普利利安特藍(lán)-R-250。作為分子量標(biāo)記使用下述的蛋白質(zhì)。
使用α-甲狀腺球蛋白(M.W.669000)、鐵蛋白(M.W.443000)、乳酸脫氫酶(M.W.139850)、牛血清白蛋白(M.W.66267)、胰蛋白酶抑制劑(M.W.20110)。
(3)結(jié)果將NATIVE-PAGE的結(jié)果表示在圖1中。在60℃下加熱處理30分鐘后，供試藥劑①(不添加藥劑)確認(rèn)大量的凝聚物。另一方面，對于供試藥劑②(含有辛酸鈉)、供試藥劑③(含有N-乙酰基蛋氨酸)或者供試藥劑④(含有辛酸鈉和N-乙?；鞍彼?，確認(rèn)凝聚物被抑制的效果。另外，這些對于濃度的依存性，從泳動圖形表明，在加入與白蛋白等摩爾的藥劑時，幾乎沒有看到凝聚物抑制效果，但在加入3倍量(72μM)時，看到明顯的凝聚物被抑制效果，進(jìn)而對于加入5倍量(120μM)時，看到顯著的凝聚物被抑制的效果。
實驗例3使用辛酸鈉以外的中鏈脂肪酸，對于熱的凝聚物抑制效果進(jìn)行研究(圖2電泳)。測定試樣使用對于HAS24μM磷酸緩沖溶液(67mM pH7.4)添加5倍量(120μM)的各種脂肪酸的。
其結(jié)果，對于比辛酸鈉碳鏈短的己酸(C6)、庚酸(C7)，稍微看到凝聚物抑制效果，對于具有不低于辛酸鈉的碳鏈的脂肪酸，可看到顯著的抑制效果。
實驗例4(1)供試藥劑的配制配制HSA的24μM磷酸緩沖溶液(67mM pH7.4)，以120μM的濃度添加各種藥劑的供試藥劑，并按如下進(jìn)行配制，對于供試藥劑5ml添加2，2’-偶氮雙(2-脒基丙烷)二鹽酸鹽(以下，稱為AAPH)(1級、和光純藥制)，使其最終濃度成為10μM。
①HSA②HSA+辛酸鈉③HSA+辛酸鈉+N-乙?；鞍彼?2)HSA的巰基型和非巰基型的存在比率的測定用高速液體色譜法(以下稱HPLC)測定HSA的巰基型和非巰基型的存在比率(巰基分率)。
用于巰基分率測定的HPLC是使用在具有梯度洗脫(gradient)裝置的島津LC-4A連接島津SPD-2ASUV檢測器及島津C-R2AX數(shù)據(jù)處理裝置的，試樣的洗脫是使用從(A)0.05M三醋酸緩沖液(pH7.0)到(B)含有0.5M醋酸鈉的0.05M三醋酸緩沖液(pH7.0)的30分鐘間的直線梯度法，流速是0.5ml/min。用UV280nm在室溫下進(jìn)行試樣的檢測。
(3)結(jié)果將供試藥劑①的HSA的HPLC色譜表示在圖3中。在供試藥劑①中看到巰基型的減少和非巰基型的增大。
HSA的巰基型和非巰基型的存在率的變化，即使添加辛酸鈉也看不到變化?？墒?，對于供試藥劑③(并用辛酸鈉和N-乙?；鞍彼?，這些存在率的變化明顯地被抑制，確認(rèn)抗氧化效果。因此，表明沒有副作用的N-乙?；鞍彼嶙鳛榉€(wěn)定化劑是適宜的。
實驗例5對于HSA加入過剩量的氧化劑2，2’-偶氮雙(2-脒基丙烷)二鹽酸鹽(AAPH)，氧化HSA。進(jìn)行一定時間氧化后，測定HSA羰基含量。從氧化時間和穩(wěn)定劑的種類的關(guān)系對各種穩(wěn)化劑的抗氧化作用進(jìn)行評價(圖4)。
表示氧化程度的羰基含量是按照Climent等的方法(記載在Climent I.，Thai L.，Levine RL.，Anal.Biochem.，182，226(1989))進(jìn)行測定。是以羰基顯色試劑Fluoresceinamine的各蛋白質(zhì)的修飾量表示。
在N-乙酰基蛋氨酸中，與不添加的供試藥劑比較，觀察到羰基含量的明顯地減少，明顯得到了抗氧化作用。
實驗例6使用生理食鹽水將基因重組HSA配制25w/v％的500ml溶液，作為穩(wěn)定化劑添加辛酸鈉1662mg和N-乙?；鞍彼?912.5mg的供試藥劑，在管瓶內(nèi)密封50ml。另外，使用生理食鹽水將另外的不含穩(wěn)定劑的基因重組HSA配制成25w/v％的濃度，在管瓶內(nèi)密封50ml。
在60℃30分鐘的滅菌條件下將這些試樣進(jìn)行加熱處理后，對于異物的發(fā)生進(jìn)行目視確認(rèn)。其結(jié)果，未添加添加劑的試樣，明顯地看到由于熱引起的白蛋白凝聚物生成，但添加穩(wěn)化劑的試樣完全沒有看到異物。
產(chǎn)業(yè)上的可利用性本發(fā)明的穩(wěn)定化的白蛋白制劑，沒有副作用的危險性，安全且可長期穩(wěn)定地保存。對于單獨使用中鏈脂肪酸或其鹽，雖然可看到對于熱穩(wěn)定性的效果，但白蛋白的抗氧化作用小，另外，對于僅添加含硫氨基酸或其衍生物，沒有看到對于白蛋白的熱穩(wěn)定性的效果。因此，通過添加中鏈脂肪酸或其鹽及含硫氨基酸或其衍生物的兩方面，可得到相乘地優(yōu)良的白蛋白穩(wěn)定效果。
權(quán)利要求
1.一種穩(wěn)定的白蛋白制劑，其特征是含有中鏈脂肪酸或其鹽和含硫氨基酸或其衍生物。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的白蛋白制劑，其中，中鏈脂肪酸是碳數(shù)6～12的直鏈狀飽和脂肪酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的白蛋白制劑，其中，含硫氨基酸是具有可以烷基化、也可以二硫鍵化的巰基的氨基酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的白蛋白制劑，其中，含硫氨基酸衍生物是N-?；暮虬被嵫苌?。
5.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的白蛋白制劑，其中，中鏈脂肪酸或其鹽和含硫氨基酸或其衍生物的總添加量是相對于白蛋白，為1倍到20倍摩爾量。
6.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的白蛋白制劑，其中，白蛋白是基因重組人體血清白蛋白。
7.一種白蛋白制劑用穩(wěn)定劑，其是由中鏈脂肪酸或其鹽和含硫氨基酸或其衍生物組成的。
8.一種白蛋白制劑的穩(wěn)定方法，其特征是混合中鏈脂肪酸或其鹽和含硫氨基酸或其衍生物。
專利摘要
本發(fā)明提供一種穩(wěn)定的白蛋白制劑，其中不含有病毒和夾雜蛋白質(zhì)，沒有副作用的危險性，安全，而且長時間內(nèi)沒有外觀變化和含量的下降。其穩(wěn)定的白蛋白制劑是通過將中鏈脂肪酸或其鹽和含硫氨基酸或其衍生物和白蛋白水溶液(作為醫(yī)藥品可給藥的磷酸鹽等的緩沖液、注射用水或生理食鹽水等)均勻混合溶解，接著將混合溶液制作成如點滴制劑、注射劑等的適于非經(jīng)口的劑型而制造，另外，涉及白蛋白制劑的穩(wěn)定方法。
文檔編號A61K38/00GKCN1330370SQ03804779
公開日2007年8月8日 申請日期2003年2月28日
發(fā)明者小田切優(yōu)樹, 甲斐俊哉, 佐藤誠 申請人:尼普洛株式會社導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan