專利名稱:核酸分子誘發(fā)產(chǎn)生高水平免疫力制備方法和使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
多拷貝CpG核酸分子提高和調(diào)節(jié)機體免疫力的制備方法和使用方法。其方法可以用于預(yù)防和治療各種疾病，包括感染性、免疫性、腫瘤等。
背景技術(shù)：
有多種方法可以預(yù)防各種病原體感染，提高機體免疫力是最主要的手段，一般是以接種疫苗而達到的。接種疫苗是預(yù)防各種病原體感染的有效措施。常見的病原體有病毒、微生物、真核細胞、寄生蟲和環(huán)境因子等有機體和分子。目前已有多種方法用來生產(chǎn)抗傳染性病原體的疫苗，如滅活疫苗，減毒活疫苗、重組疫苗，亞單位疫苗和核酸疫苗等。它們的基本作用原理是相同的，即借助與病原體結(jié)合的靶蛋白激發(fā)免疫反應(yīng)，達到免疫個體不被傳染性病原體感染的目的。當個體與傳染性病原體接觸時，其免疫系統(tǒng)能夠識別病原體蛋白而產(chǎn)生有效的保護反應(yīng)抵抗傳染。目前所用的許多疫苗就是由從病原體中分離出來的非傳染性和低傳染性的蛋白或核酸物質(zhì)所組成。核酸疫苗的優(yōu)點在于可以激活體液免疫反應(yīng)和細胞免疫反應(yīng)，而更有效地激發(fā)保護性和清除性的免疫反應(yīng)，達到防治病原體感染，抗腫瘤，治療自主免疫疾病和清除毒素引起的中毒癥狀等抵抗外來病原體的感染和內(nèi)在病變，同時核酸疫苗制備方便，成本低廉，安全性好從而備受推崇。但是核酸疫苗的缺點是在體內(nèi)激活機體產(chǎn)生完全免疫反應(yīng)的效率較低，許多情況下單獨使用還不能達到保護能力或保護性不穩(wěn)定。補以激活、提高、調(diào)節(jié)核酸疫苗免疫反應(yīng)的佐劑正是解決此問題的關(guān)鍵。
佐劑的類型多種多樣，佐劑按作用方式可分為四種第一，在接種部位形成抗原貯存庫，使抗原緩慢釋放，較長時間使抗原與免疫細胞接觸并激發(fā)對抗原的應(yīng)答；第二，輔助抗原暴露并將能刺激特異性免疫應(yīng)答的抗原表位提呈給免疫細胞；第三，誘導能介導免疫應(yīng)答的細胞因子釋放；第四，生物體的威脅信號。按種類分為溶性鋁鹽類佐劑(Glenny，J.Path.Bacteriol，34，267，1926)、油水乳劑佐劑(如弗氏佐劑)、微生物及其代謝產(chǎn)物佐劑(R.Germanier，ed.，Bacterial Vaccines，Academic Press Inc.New York，1984)、人工合成佐劑(Coughlin et a1.，P.The Journalof Infectious Diseases，1711049-1052，1995)、免疫刺激組合物(ISCOM)佐劑(Coughlin et al.，P.The Journal of Infectious Diseases，1711049-1052，1995)、細胞因子類佐劑(Trinchieri G Immunology 13251-276，1995)、核酸及其類似物佐劑(美國專利6,372,227；Manmohan Singh & Derek O′Hagan.Nature Biotechnology17，1075-1081，1999；Virgil EJC Schijns.Current Opinion in Immunology，12456-463，2000)。
細菌DNA中的非甲基化的嘌呤嘌呤鳥嘌呤磷酸胸腺嘧啶嘧啶嘧啶(PurPurCpGPyrPyr)序列，即CpG序列具有強烈的免疫刺激活性，廣泛存在于細菌、病毒和非脊椎動物的基因組中，而在脊椎動物基因組中，CpG含量只有細菌的四分之一，且存在CpG抑制現(xiàn)象，即CpG的高度甲基化和中和性CpG的存在。鑒于CpG序列免疫刺激活性高、副作用小，目前正得到廣泛應(yīng)用。CpG序列作為疫苗佐劑，能夠增強抗原的加工提呈，誘導TH1型免疫應(yīng)答，產(chǎn)生較強的體液免疫和細胞免疫(Davis，HL.Curr Top Microbiol Immunol，2000，247171-181)。
但是上述佐劑各存在一些問題，如，上述佐劑大部分是針對增強抗體水平而設(shè)計的，其佐劑部分有很強的抑制T細胞免疫反應(yīng)的成份(Yip，HC等1999，J.Immunol.1623942)；而單獨的CpG序列作為疫苗佐劑在使用中發(fā)現(xiàn)它提高抗體水平和T細胞活性不是很顯著，所以免疫增強作用不強，從而在實際的疫苗使用中作效果不佳。
孫樹漢等人公開的
一種人乙型肝炎核酸疫苗
(公開號1324661)中使用兩個拷貝CpG結(jié)果，及W.L.J.達勒曼斯等人公開的
疫苗
(公開號1284885)提及的CpG刺激序列為免疫佐劑的結(jié)果。以上兩者均利用簡單拷貝數(shù)的CpG序列為基礎(chǔ)提高免疫反應(yīng)。
在本人研究中發(fā)現(xiàn)，以上兩種方式提高免疫反應(yīng)的效果均不理想。

發(fā)明內(nèi)容
針對上述的這些存在問題。我們有針對性的分析和篩選了能大幅度提高和增強疫苗免疫效果的改良型CpG序列的方案，而且提供了該改良型CpG序列作為疫苗佐劑增強疫苗免疫反應(yīng)的生產(chǎn)方法和使用方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案是通過以下措施來達到的一種增強疫苗免疫的改良型非甲基化CpG序列和組合方式，其含有增強免疫反應(yīng)的多拷貝非甲基化CpG序列與質(zhì)粒DNA載體分子或抗原物質(zhì)非共價結(jié)合使用的組合物激活特異性免疫反應(yīng)；其含有增強免疫反應(yīng)的多拷貝非甲基化CpG序列與核酸疫苗或抗原物質(zhì)共價結(jié)合使用的化合物激活特異性免疫反應(yīng)；或單獨使用其多拷貝非甲基化CpG序列而提高非特異性免疫反應(yīng)。
本發(fā)明的技術(shù)方案是通過以下措施來達到的一種增強疫苗免疫反應(yīng)的改良型非甲基化CpG序列和組合方式，其含有增強免疫反應(yīng)的多拷貝非甲基化CpG序列與質(zhì)粒DNA載體分子或抗原物質(zhì)非共價結(jié)合使用的組合物激活特異性免疫反應(yīng)。
上述多拷貝非甲基化CpG序列是人工合成的或者通過生物體生產(chǎn)而成的脫氧核糖核酸(DNA)。
上述人工合成為在特定引物的引導下的聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)方法或化學合成法。
上述生物體為大腸桿菌。
上述增強核酸疫苗免疫反應(yīng)的組合物通過以下方法得到含有增強免疫反應(yīng)的多拷貝非甲基化CpG序列與質(zhì)粒DNA載體分子或抗原物質(zhì)混合后使用。
上述增強核酸疫苗免疫反應(yīng)的化合物通過以下方法得到含有增強免疫反應(yīng)的多拷貝非甲基化CpG序列通過公知的分子克隆方法克隆于質(zhì)粒DNA載體或抗原物質(zhì)分子中使用。
含有增強免疫反應(yīng)的多拷貝非甲基化CpG序列通過公知的化學共價耦聯(lián)方式與抗原物質(zhì)結(jié)合使用。
一種含有上述增強免疫反應(yīng)的多拷貝非甲基化CpG序列的使用方法，該使用方法是通過注射、噴射、口服、滴鼻、滴眼、滲透、吸收、物理或化學介導的方法使上述疫苗免疫的組合物進入機體。
一種含有上述增強免疫反應(yīng)的多拷貝非甲基化CpG序列的使用方法，該使用方法是上述疫苗免疫的組合物是被其它物質(zhì)包裹或混合后進入機體的。
一種含有上述增強免疫反應(yīng)的多拷貝非甲基化CpG序列的使用方法，該使用方法是上述增強免疫反應(yīng)的多拷貝非甲基化CpG序列與質(zhì)粒DNA載體分子或抗原物質(zhì)混合后，通過注射、噴射、口服、滴鼻、滴眼、滲透、吸收、物理或化學介導的方法使上述疫苗免疫的組合物進入機體。
一種含有上述增強免疫反應(yīng)的多拷貝非甲基化CpG序列的使用方法，該使用方法是上述增強免疫反應(yīng)的多拷貝非甲基化CpG序列通過公知的分子克隆方法克隆于質(zhì)粒DNA載體分子中或抗原物質(zhì)分子中后，通過注射、噴射、口服、滴鼻、滴眼、滲透、吸收、物理或化學介導的方法使上述疫苗免疫的組合物進入機體。
本發(fā)明是利用上述增強免疫反應(yīng)的多拷貝非甲基化CpG序列通過公知的分子克隆方法克隆于質(zhì)粒DNA載體分子中或抗原物質(zhì)分子中接種后激活機體完全免疫反應(yīng)，達到防治病原體感染、抗腫瘤、治療自主免疫疾病和清除蛋白性毒素引起的中毒癥狀等。按照本發(fā)明組合物和化合物進入細胞，激活細胞內(nèi)一系列信號反應(yīng)、抗原提呈和識別而產(chǎn)生完全免疫反應(yīng)。
在本發(fā)明中提到抗原物質(zhì)可以是病源體相關(guān)的物質(zhì)，如全病毒、減毒病毒、滅活的病毒，內(nèi)源性和外源性蛋白質(zhì)、糖類物質(zhì)和核酸物質(zhì)。
本發(fā)明通過此免疫方法誘發(fā)機體的免疫發(fā)反應(yīng)，識別快速增殖細胞的特異性抗原性物質(zhì)，產(chǎn)生專一性的體液免疫反應(yīng)，抵御攜帶抗原性物質(zhì)病源體的感染、清除攜帶有外來抗原性物質(zhì)，達到對機體的保護目的。
本發(fā)明通過此免疫方法誘發(fā)機體的免疫反應(yīng)，識別參與自主免疫反應(yīng)細胞上的特異性靶蛋白，產(chǎn)生專一性的細胞毒性免疫反應(yīng)，清除攜帶有抗原性物質(zhì)的細胞，達到免疫治療疾病的目的。
本發(fā)明通過此免疫方法誘發(fā)機體的免疫反應(yīng)，中和具有抗原決定簇的有害蛋白，達到清除毒素作用的目的。
因此，此免疫方法可以提高由滅活病毒疫苗、減毒疫苗、蛋白疫苗、肽類亞單位疫苗和DNA疫苗等接種方法的免疫反應(yīng)水平，更為安全有效的保護機體抵御病源體感染、抗腫瘤和治療自主免疫疾病。
此免疫方法能夠有效的激發(fā)完全免疫反應(yīng)，又減少或避免使用感染性的物質(zhì)、載體和不安全的遺傳物質(zhì)?？梢钥朔唵挝灰呙缧Ч畹牟蛔?。
本發(fā)明的另一個重要方面是提供一個不需使用感染性制劑就可產(chǎn)生完全免疫反應(yīng)的方法，我們的研究證實把多拷貝的非甲基化的CpG序列的寡聚核苷酸與免疫原性原性差的蛋白質(zhì)抗原混合后接種到機體細胞后，這種蛋白質(zhì)可作為MHC-1型靶抗原在細胞中通過間接的方式(cross presentation)被提呈，而激發(fā)機體的完全免疫反應(yīng)，從而保護機體不受該病源體的侵犯。
本發(fā)明針對性的致病病源體有病毒、原核細胞、真核細胞。真核細胞病源體包括單細胞致病病源體和多細胞寄生蟲類。
本發(fā)明為保護機體抵抗病毒性病源體感染提供了一種有效的方法。病毒性病源體包括呼吸道病毒(感冒和呼吸道合體病毒)、瘡疹病毒(德國麻疹、水痘、牛痘、天花、帶狀瘡疹等)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)病毒、免疫系統(tǒng)病毒(愛滋病毒)、生殖系統(tǒng)病毒(尖銳濕疣)和一切可能的致病性病毒。



圖1口蹄疫病毒VP1表達質(zhì)粒pcD-VP1的構(gòu)建及鑒定口蹄疫病毒RNA樣品在Poly A引物及RNA反轉(zhuǎn)錄酶的化下VP1合成cDNA和并在Vp1 5’和3’引物存在下進行PCR擴增。將PCR產(chǎn)物克隆于pcDNA3的KpnI和XbaI位點。經(jīng)轉(zhuǎn)化、小提和酶切后，在瓊脂糖凝膠電泳后進行鑒定。從圖中可看出600bp大小VP1條帶。條帶1DL1500 Marker，條帶2-3.pcD-VP1經(jīng)限制性內(nèi)切酶KpnI and Xba I酶切鑒定。
圖2pcD-VP1CpG的構(gòu)建圖及鑒定為鑒定所構(gòu)建的真核表達質(zhì)粒pcD-VP1CpG是否正確，將重組質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切后鑒定，瓊脂糖凝膠電泳后進行觀察拍照。圖中分析說明在重組質(zhì)粒pcD-VP1真核表達質(zhì)粒中已連接有多拷貝的CpG。條帶1λ-EcoT14 I marker；條帶2pcD-VP1CPG經(jīng)內(nèi)切酶HindIII酶切；條帶3pcD-VP1CPG經(jīng)內(nèi)切酶SspIand NruI雙酶切；條帶4pcDNA3經(jīng)內(nèi)切酶SspI and NruI雙酶切；條帶5pcDNA3經(jīng)內(nèi)切酶HindIII酶切；條帶6DL2000marker。
圖3RT-PCR鑒定真核表達質(zhì)粒為鑒定所構(gòu)建的真核表達質(zhì)粒是否能在真核細胞中進行表達，pcD-VP1CpG經(jīng)脂質(zhì)體lipofactamine方法處理后轉(zhuǎn)染Hela細胞。其表達的mRNA含量由VP1序列的專一性引物存在下進行RT-PCR方法擴增，將產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后得出600bp大小VP1條帶(條帶4)；而未轉(zhuǎn)染的Hela細胞(條帶2)和對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的Hela細胞(條帶3)均未擴增出VP1條帶，條帶2是marker。
圖4比較多拷貝非甲基化CpG序列與2拷貝非甲基化CpG序列產(chǎn)生特異性抗體水平變化pcD-VP1和pcD-VP1CpG重組質(zhì)粒免疫小鼠后抗體水平的變化。在免疫后第14、28、42、和56天收集免疫后血清，用ELISA對其進行鑒定測出抗體滴度。從圖中可以看出pcD-VP1CpG接種實驗組小鼠的IgG抗體滴度均顯著高于pcDNA3。其抗體滴度可以達到1∶28000，并且隨著時間的增加而提高。
圖5比較多拷貝非甲基化CpG序列與2拷貝非甲基化CpG序列產(chǎn)生特異性T細胞擴增的變化
pcD-VP1和pcD-VP1CpG重組質(zhì)粒免疫小鼠后T細胞增殖變化見表。免疫后的實驗組小鼠脾臟的淋巴細胞對口蹄疫抗原的刺激均有明顯的反應(yīng)性。pcD-VP1CpG免疫組的擴增值明顯高于pcD-VP1免疫組，差異極顯著(P＜0.001)。而陰性對照組和非相關(guān)抗原刺激組無變化。其中1、2和3為無刺激的陰性對照；4、5、6是ConA刺激的陽性對照；7、8、9是由146S抗原刺激；10、11、12為BSA刺激的陰性對照。
具體實施方式
借助以下實施例對本發(fā)明作進一步描述下面這些實施例是示范性的，而不是限制性的，可根據(jù)上述本發(fā)明的技術(shù)方案和實際情況，來確定具體的實施方式。材料與方法菌株與質(zhì)粒大腸桿菌DH5α和HB101及質(zhì)粒pcDNA3為Invitrogen公司產(chǎn)品，口蹄疫VP1 cDNA克隆已在王賓等人公開的
增強核酸疫苗免疫的組合物和生產(chǎn)方法及應(yīng)用方法
(公開號1391954)中提到。146S的抗原的制備的方法如文獻(32)所述。簡述為，由購得的蘭州獸醫(yī)所生產(chǎn)口蹄疫牛O型滅活苗，將滅活苗除去乳劑，保存在4℃。用Bradford法進行蛋白定量。實驗動物6-8周齡的BALB/C小鼠，雌性，重18-20g，購自北京實驗動物中心。主要試劑各種限制性內(nèi)切酶，DNA修飾酶均購自Takara公司，羊抗鼠IgG-HRP、牛血清白蛋白(BSA)、十二烷基黃酸鈉(SDS)、ELISA板、刀豆蛋白A(ConA)均購自華美公司，MTT(Sigma公司)。表達載體pcD-VP1和pcD-VP1CpG的構(gòu)建和鑒定用限制性內(nèi)切酶KpnI和XbaI將T載體上含口蹄疫VP1的片段切下，然后，將VP1克隆到用同樣限制性內(nèi)切酶KpnI和XbaI酶切的pcDNA3質(zhì)粒上，構(gòu)建成重組質(zhì)粒pcD-VP1。以限制性內(nèi)切酶酶切鑒定轉(zhuǎn)化子。
為將多拷貝CpG序列克隆到pcD-VP1，設(shè)計了一對CpG的PCR引物如下上游引物aaAgA TCT GAT TGG ACG TTA GTG ACG TTA GTG下游引物aaAGA TCT AAC GTC ACT AAC GTC ACT AAC其中上游引物和下游引物均含BglII位點，產(chǎn)物預(yù)計大小150bp。PCR的反應(yīng)體系為50μl，擴增參數(shù)為94℃1min、60℃30s、72℃30s min，30個循環(huán)后72℃延伸10min，將擴增產(chǎn)物在2％瓊脂糖凝膠電泳分析并純化后，并將擴增產(chǎn)物CpG和pcD-VP1分別用BglII酶切，然后以擴增產(chǎn)物CpG比pcD-VP1為20倍莫爾濃度混合在T4連接酶作用下，連接得到多拷貝的重組質(zhì)粒pcD-VP1CpG，并轉(zhuǎn)化至感受態(tài)DH5α，挑取陽性克隆酶切鑒定，見圖2。pcD-VP1CpG重組質(zhì)粒在真核細胞中的瞬時表達復蘇的Hela細胞用RPMI1640-20％FBS培養(yǎng)液培養(yǎng)，經(jīng)過幾次傳代后，將細胞濃度調(diào)整為4×105/ml，將純化好的質(zhì)粒pcD-VP1CpG用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法(Invitrogen公司產(chǎn)品操作指南)，轉(zhuǎn)染Hela細胞，37℃，5％CO2，95％空氣濕度培養(yǎng)4h，更換培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)32h。然后收獲細胞，用RNA提取試劑盒(上海生工公司)按說明書步驟提取細胞的總RNA。用常規(guī)的RT-PCR法和VP1特異性引物進行擴增，條件94℃30S，55℃30S，72℃50S，30個循環(huán)，產(chǎn)物進行1.5％的瓊脂糖凝膠電泳，見圖3。pcD-VP1和pcD-VP1CpG疫苗的制備及免疫對帶有pcD-VP1和pcD-VP1CpG質(zhì)粒菌株進行大量制備，方法見文獻(薩姆布魯克J，弗里奇EF，曼尼阿蒂斯T。分子克隆實驗指南。第2版，金冬雁，侯云德等譯校。北京，科學出版社，1995)，在260及280nm下測其光密度，其比值為1.9，按1OD＝50μg DNA ml計算質(zhì)粒含量同時用電泳定量作對照。
選取6-8周健康的雌性BALB/C 30只，分為pcDNA3、pcD-VP1和pcD-VP1CpG三組進行免疫，每組10只。質(zhì)粒用0.9％的生理鹽水調(diào)整其濃度為1μg/μl。每次免疫前24小時注射0.25％普魯卡因于后腿股四頭肌，每只小鼠各50μl。然后再注射質(zhì)粒50μl。間隔2和4周再各免疫1次。免疫前及初次免疫后1、2、4、6、8、周由眼眶靜脈采血分離血清。采用ELISA法檢測血清抗口蹄疫的效價。采用間接ELISA法檢測抗體用0.05mol/L pH9.6碳酸鹽緩沖液稀釋146S抗原(1μg/ml)，包被聚苯乙烯反應(yīng)板孔，100μl/孔，4℃過夜。用0.01mol/LpH7.4PBS-Tween洗三次后，3％BSA封閉1h，同上洗滌，加入不同稀釋度的待測血清，100μl/孔，37℃，孵育1h后洗滌三次后，加辣根過氧化物酶標記的IgG-HRP 1∶10000倍稀釋，100μl/孔，43℃40min后洗滌，加底物(TMB-H2O2)溶液，37℃避光顯色10min，用2mol/LH2SO4終止反應(yīng)，在酶聯(lián)檢測儀中測吸光度450nm值。T細胞增殖試驗在小鼠初始免疫后第2周，從pcD-VP1和pcD-VP1CpG免疫的小鼠中各取2只小鼠制備脾細胞懸液。分別用146S抗原，陽性對照Con A和陰性對照和BSA非相關(guān)抗原在RPMI-1640培養(yǎng)液激活T細胞，設(shè)三個重復孔。以MTT法測定細胞的增殖強度，在酶聯(lián)檢測儀中測吸光度570nm值，MTT法參照文獻(朱立平，陳學清2000，免疫學常用實驗方法。北京，人民軍醫(yī)出版社；邊興艷1998，國外醫(yī)學臨床生物化學與檢驗學分冊，1983-85)。
權(quán)利要求
1.一種增強免疫反應(yīng)的改良型非甲基化CpG序列，其特征是含有增強免疫反應(yīng)的多拷貝非甲基化CpG序列。
2.如權(quán)利要求
1所述的多拷貝非甲基化CpG序列，其特征是包括十個以上非甲基化的CpG的重復序列。
3.如權(quán)利要求
1所述的多拷貝非甲基化CpG序列，其特征是人工合成的或者通過生物體生產(chǎn)而成的非甲基化的脫氧核糖核酸。
4.如權(quán)利要求
3所述的人工合成生產(chǎn)的多拷貝非甲基化CpG序列，其特征在于在特定引物的引導下的聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)方法的體外合成法和公知的化學合成法。
5.如權(quán)利要求
3所述的通過生物體生產(chǎn)的多拷貝非甲基化CpG序列，其特征在于上述生物體為大腸桿菌。
6.如權(quán)利要求
1或2或3或4或5所述的多拷貝非甲基化CpG序列，其特征在于該序列通過以下方法達到增強免疫反應(yīng)通過與質(zhì)粒DNA分子或抗原物質(zhì)非共價結(jié)合使用的組合物進入機體后激活特異性免疫反應(yīng)。
7.如權(quán)利要求
1或2或3或4或5所述的多拷貝非甲基化CpG序列，其特征在于該序列通過以下方法達到增強免疫反應(yīng)通過與質(zhì)粒DNA載體分子或抗原物質(zhì)共價結(jié)合使用的化合物進入機體后激活特異性免疫反應(yīng)。
8.如權(quán)利要求
7所述的多拷貝非甲基化CpG序列與質(zhì)粒DNA載體分子共價結(jié)合的化合物，其特征在于該化合物通過以下方法得到含有增強免疫反應(yīng)的多拷貝非甲基化CpG序列通過公知的分子克隆方法克隆于質(zhì)粒DNA載體中使用。
9.如權(quán)利要求
7所述的與抗原物質(zhì)共價結(jié)合使用的化合物，其特征在于該組合物通過以下方法得到含有增強免疫反應(yīng)的多拷貝非甲基化CpG序列通過公知的化學共價耦聯(lián)方式與抗原物質(zhì)結(jié)合使用。
10.如權(quán)利要求
6或7或8所述的質(zhì)粒DNA載體是攜帶外源基因的DNA載體或是DNA疫苗。
11.如權(quán)利要求
6或7或9所述的抗原物質(zhì)可以是病源體相關(guān)的物質(zhì)，如全病毒、減毒病毒、滅活的病毒，內(nèi)源性和外源性蛋白質(zhì)、糖類物質(zhì)和核酸物質(zhì)。
12.如權(quán)利要求
1或6或7或8或9所述的多拷貝非甲基化CpG序列的組合物和化合物的使用方法，其特征在于通過注射、噴射、口服、滴鼻、滴眼、滲透、吸收、物理或化學介導的方法使上述增強免疫的組合物和化合物進入機體。
13.如權(quán)利要求
1或6或7或8或9所述的多拷貝非甲基化CpG序列的組合物和化合物的使用方法，其特征在于上述增強核酸疫苗免疫的組合物和化合物是被其它物質(zhì)包裹或混合后進入機體。
專利摘要
本發(fā)明公開了一種增強疫苗免疫的改良型非甲基化嘌呤嘌呤鳥嘌呤磷酸胸腺嘧啶嘧啶嘧啶(PurPurCpGPyrPyr)為核心序列制備方法和使用方式，其中含有增強免疫反應(yīng)的多拷貝非甲基化PurPurCpGPyrPyr序列與質(zhì)粒DNA載體分子或抗原物質(zhì)非共價結(jié)合使用的組合物激活特異性免疫反應(yīng)；或其含有增強免疫反應(yīng)的多拷貝非甲基化PurPurCpGPyrPyr序列與核酸疫苗或抗原物質(zhì)共價結(jié)合使用的化合物激活特異性免疫反應(yīng)；或單獨使用其多拷貝非甲基化PurPurCpGPyrPyr序列而提高非特異性免疫反應(yīng)。以上這些物質(zhì)導入機體，可以產(chǎn)生專一性或非專一性免疫反應(yīng)，從而增強免疫力、調(diào)節(jié)機體免疫力的方法。其免疫反應(yīng)的強度遠遠超過了抗原單獨使用所產(chǎn)生的效果。所產(chǎn)生的免疫反應(yīng)可中和、清除、消滅外源物、病源體、被侵染的細胞的作用，從而達到預(yù)防、治療雙重作用。
文檔編號C12N15/63GKCN1458282SQ03137717
公開日2003年11月26日 申請日期2003年6月20日
發(fā)明者王賓, 俞慶齡 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan