地榆總皂苷治療炎癥性腸病的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明為地榆總皂苷治療炎癥性腸病。本發(fā)明涉及地榆總皂苷對炎癥性腸病的治療作用，屬于藥學領(lǐng)域。本發(fā)明提供了地榆總皂苷對顯著逆轉(zhuǎn)TNBS引起的結(jié)腸損傷；并通過實驗證明，地榆皂苷可以明顯緩解TNBS誘導大鼠發(fā)生結(jié)腸炎后體重減輕現(xiàn)象，明顯減輕TNBS誘導的大鼠結(jié)腸炎病理改變程度，炎細胞浸潤減少，黏膜上皮變性減少。TNBS造成大鼠體內(nèi)嚴重的炎癥反應(yīng)，導致大鼠血清中TNF?α、IL?1β、IL?6促炎因子表達升高，地榆皂苷可以逆轉(zhuǎn)大鼠血清中炎癥因子升高的現(xiàn)象。TNBS同時導致大鼠結(jié)腸氧自由基系統(tǒng)中MPO、MDA表達升高，SOD表達下降，因此地榆皂苷可以逆轉(zhuǎn)大鼠結(jié)腸氧自由基系統(tǒng)紊亂的現(xiàn)象。本發(fā)明還提供了地榆皂苷對LPS刺激的RAW 264.7巨噬細胞中炎癥因子的炎癥因子的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，地榆皂苷可顯著地下調(diào)TNF?α，IL?6和IL?1β的表達，從而發(fā)揮抗炎作用。地榆總皂苷可用于炎癥性腸病的治療。
【專利說明】
地愉總皂昔治療炎癥性腸病
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及地愉總皂巧對炎癥性腸病的治療作用，增加地愉總皂巧的適應(yīng)癥，促 進地愉總皂巧的開發(fā)，屬于藥物領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 地愉在我國資源豐富、種類繁多，并且已經(jīng)有較為純熟的人工栽培技術(shù)可W進行 大面積繁殖。地愉中含有較質(zhì)及多酪類、Ξ祗及其巧類、黃酬及其巧類等多種化學成分，具 有止血、抗炎消腫、抗腫瘤，抗氧化W及抗過敏等藥理作用W-W。地愉皂巧及其巧元成分W Ξ祗皂巧類化合物為主，其結(jié)構(gòu)類型主要有烏蘇燒型、齊墳果燒型、達瑪燒型和羽扇豆燒 型，其中烏蘇燒(ursane)型和齊墳果燒(oleanane)型最為常見。地愉皂巧生物利用度低、通 透性差、在體內(nèi)很難達到有效濃度;然而，地愉皂巧具有明確的止血、抗炎消腫、抗腫瘤，抗 氧化W及抗過敏等藥理作用。運種PK與PD不相關(guān)的現(xiàn)象提示我們，地愉皂巧可能是通過一 種間接機制發(fā)揮作用。
[0003] 炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease, IBD)是一種原因不明的慢性非特異 性炎癥性腸病，IBD在發(fā)達國家發(fā)病率高于發(fā)展中國家，但近年來隨著我國經(jīng)濟水平的提 高、人群飲食習慣和生活習慣的改變，I抓在我國發(fā)病率有逐年升高的趨勢。由于發(fā)病機制 尚不明確，臨床上常表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)作而治愈難度大。飲食及其他因素可W影響免疫力低下 的易感者，使其對腸道細菌免疫反應(yīng)的抵抗能力降低，從而喪失對正常菌群的耐受性，最后 導致疾病的發(fā)生。人體腸道中有大量菌群，廣譜抗生素能預(yù)防I抓發(fā)生，說明I抓發(fā)病與菌群 有關(guān)。在IBD的發(fā)病機制中，免疫因素有著十分重要的作用。在IBD患者的結(jié)腸黏膜中均可檢 測到大量的漿細胞，淋己細胞，中性粒細胞和巨隧細胞，運些免疫細胞可釋放多種細胞因 子，例如IL-li3，IL-6和TNFs等屬于促炎癥細胞因子，會導致炎癥的發(fā)生與發(fā)展。I抓病變過 程有腸腔內(nèi)壓增高、交感神經(jīng)活動增強、內(nèi)源性縮血管物質(zhì)活性遞質(zhì)等現(xiàn)象，使腸血流量降 低，或暫時性缺血后出現(xiàn)再灌流現(xiàn)象，能引起供氧還原不完全，導致大量氧自由基形成，損 傷腸粘膜。
[0004] 因此，從藥代動力學-藥效學角度系統(tǒng)地考察地愉皂巧對炎癥性腸病的治療作用 的可行性與可能性，促進地愉皂巧的二次開發(fā)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 有鑒于此，本發(fā)明的目的在于從藥代動力學-藥效學角度系統(tǒng)地考察地愉皂巧對 炎癥性腸病的治療作用的可行性與可能性，促進地愉皂巧的二次開發(fā)。
[0006] 在藥代物質(zhì)基礎(chǔ)研究過程中，首先基于高分辨、高靈敏度、高分析速度的LC-Q- T0F/MS技術(shù)對地愉提取物中皂巧類成分進行鑒定，構(gòu)建炎癥性腸病大鼠模型，考察地愉皂 巧在正常及炎癥性腸病模型大鼠體外代謝差異，尋找影響地愉皂巧在正常和模型大鼠體內(nèi) 外代謝差異的主要因素。構(gòu)建炎癥性腸病大鼠模型，考察地愉皂巧在正常及炎癥性腸病模 型大鼠體外代謝差異，在此過程中，利用Ξ硝基苯橫酸構(gòu)建炎癥性腸病模型。分別考察地愉 皂巧在正常大鼠和炎癥性腸病大鼠模型血漿、尿、糞、腸道菌群等樣本中的藥源性成分譜的 差異，尋找影響地愉皂巧治療結(jié)腸炎的藥代-藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。
[0007] 在地愉皂巧對炎癥性腸病的治療作用的藥理活性研究過程中，建立LPS誘導的小 鼠 RAW264.7巨隧細胞的體外炎癥模型，通過酶聯(lián)免疫法檢測不同濃度地愉皂巧對腫瘤壞死 因子-a(TNF-a)，白細胞介素-6(化-6)及白細胞介素-liKlkie)的影響。體內(nèi)實驗部分運用 Ξ硝基苯橫酸構(gòu)建大鼠體內(nèi)潰瘍性結(jié)腸炎模型，分成對照組、模型組、低劑量組(lOmg/kg)、 中劑量組(25mg/kg)、高劑量組(50mg/kg)及陽性藥組(250mg/kg)。造模后給藥治療7天后， 比較不同組體質(zhì)量變化情況，測定血清中IL-Ιβ、IL-6和TNF-a的表達;取結(jié)腸潰瘍明顯處進 行病理分析，常規(guī)HE染色，評價各組樣品炎癥程度；同時取結(jié)腸組織勻漿后測定其髓過氧化 物酶(MP0)、丙二醒(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)在結(jié)腸中的表達。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，地愉皂巧劑量 依賴性地逆轉(zhuǎn)由TNBS引起的TNF-a(P<〇.〇l)和化-1β(Ρ<〇.〇1)表達的上調(diào)，化-6(P< 0.01)在50yg/mL濃度下與模型組有顯著性差異。體內(nèi)實驗表明，地愉皂巧明顯減輕TNBS誘 導的大鼠結(jié)腸炎病理改變程度;模型組大鼠體重顯著低于對照組(P<〇.001)，低劑量組、中 劑量組、高劑量組與陽性藥組可顯著升高造模后大鼠體重;造模后大鼠血清中IL-6表達升 高(P<0.05)，與模型組相比，地愉皂巧低劑量、高劑量及陽性藥組可顯著降低由TNBS誘導 的結(jié)腸炎癥反應(yīng);造模后大鼠血清中IL-Ιβ表達升高(P<0.05)，與模型組相比，地愉皂巧低 劑量、中劑量及陽性藥組可顯著下調(diào)由血清中IL-Ιβ的表達;造模后大鼠血清中TNF-a表達 升高，與對照組相比有顯著性差異(P<〇.01)，地愉皂巧治療組的TNF-a表達有一定下調(diào)的 趨勢。
[0008] 通過W上研究，從藥代動力學-藥效學角度系統(tǒng)地考察地愉皂巧對炎癥性腸病的 治療作用的可行性與可能性，促進地愉皂巧的二次開發(fā)。
【附圖說明】：
[0009] 圖1:地愉總皂巧對RAW264.7細胞活性的影響。
[0010] 圖2:地愉皂巧對LPS誘導的RAW264.7細胞細胞因子表達的影響（A)TNF-a(B)化-1β (C)比-6。
[0011] 圖3:地愉皂巧對造模大鼠體質(zhì)量影響。
[0012] 圖4:TNBS造模后大鼠結(jié)腸組織病變結(jié)果及其地愉總皂巧的治療作用（Α)對照組 (B)模型組(C)治療組(D)陽性藥組。
[001 ：3 ] 圖5:地愉皂巧對大鼠結(jié)腸組織中各指標表達的影響(A)MP0 (B) SOD (C)MDA。
[0014] 圖6:地愉皂巧對大鼠血清中細胞因子的影響(A)比-6(B)IL-lf3(C)TNF-a。
【具體實施方式】
[0015] 下面結(jié)合附圖和實施例，對本發(fā)明進行進一步的說明。
[0016] 實施例1地愉提取物中皂巧類成分的定性分析
[0017] 第一步:地愉皂巧的碎裂方式分析:皂巧類成分會發(fā)生脫糖基反應(yīng)，162化表示脫 去己糖（glucose，Glc-)，132Da表示脫去戊糖(arabinose，Ara-)。分析碎片信息發(fā)現(xiàn)，在地 愉皂巧I和II二級碎片質(zhì)譜圖中，453.33、471.34和585.38具有較高的強度。因此，我們選擇 特征碎片離子m/z 453.33、471.34、585.38與中性丟失m/z 132、162作為皂巧類成分特征信 息，建立適用于地愉皂巧快速鑒定的特征碎片離子診斷技術(shù)及中性丟失技術(shù)。
[0018] 第二步:通過特征離子診斷技術(shù)及中性丟失技術(shù)，首次全面且快速地鑒定出皂巧 類成分24種，相關(guān)結(jié)果(保留時間，分子式，準確分子量，質(zhì)量偏差，碎片離子)列于表1。鑒定 出的皂巧類化合物構(gòu)型如圖1-4所示。其中烏蘇燒型皂巧類成分有18種，齊墳果燒型皂巧類 成分有1種，其它類型皂巧類成分有5種。
[0019] 表1地愉提取物中皂巧類成分相關(guān)信息
[0020]
[0021]
[0022] 實施例2地愉皂巧在正常及炎癥性腸病模型大鼠體外代謝物鑒定
[0023] 步驟一 ：TNBS灌腸造腸炎模型的制備：將TNBS溶解于無水乙醇溶液（1:1)中，配制 成濃度為lOOmg/kg溶液。腹腔注射7 %水合氯醒麻醉大鼠后，。用注射器吸取配置好的TNBS 溶液，用凡±林充分潤滑導管末端后灌腸，導管末端距大鼠的肛口約5cm，將注射器內(nèi)的 TNBS緩慢推入結(jié)腸后，倒置大鼠 Imin。對照組小鼠給予同等劑量的生理鹽水。
[0024] 步驟二:腸道菌群制備:大鼠股動脈放血處死，取出回盲瓣，暴露其內(nèi)容物，稱量腸 道內(nèi)容物質(zhì)量。Ig內(nèi)容物加入3mL樣品保存液(20 %甘油加1.8 %氯化鋼），吹打均勻后分裝 到1.5mL無菌EP管中，保存在-80°C備用。
[0025] 步驟Ξ:藥物與腸道菌群體外共溫解：在無菌操作臺中用PY培養(yǎng)基將菌液稀釋5 倍，稀釋后的菌液在搖床中37°C，200巧m溫解12h后，在無菌操作臺中取90化菌液和10化地 愉皂巧溶液混合，置于2.化溫解盒中，迅速放入?yún)捬醮趽u床中37°C，200巧m分別溫解比。 溫解結(jié)束時用ImL冰正下醇終止反應(yīng)并進行提取(η = 5)。10, OOOg離屯、lOmin，取上清0.8血， 置45 °C真空離屯、濃縮裝置中揮干，200化乙臘溶解殘渣，40，OOOg離屯、lOmin，扣L進樣分析。 研究結(jié)果見表2和表3。
[0026] 表2正常組腸道菌群中地愉皂巧代謝物成分
[0027]
[002引
[0029]表3模型組腸道菌群中地愉皂巧代謝物成分
[0030]
[0031 ]實施例3地愉皂巧在正常及炎癥性腸病模型大鼠體內(nèi)代謝研究
[0032] 步驟一：實驗動物及分組:健康雄性SD大鼠 24只，分為正常組與模型組。模型組肛 口給予TNBS(100mg/kg)7天后，兩組灌胃給W地愉皂巧(50mg/kg)。
[0033] 步驟二:生物樣品收集:給藥前采空白血漿樣品，灌胃給藥后化股動脈放血處死， 分別取模型組和對照組血漿于加入了肝素鋼的軟管中。灌胃給藥，分別放入代謝籠中，收集 給藥前及給藥后0~2地、24~4她、48~72h、72~96h的尿液和糞便。
[0034] 步驟Ξ:生物樣品處理:分別取對照組與模型組大鼠血漿20化1中，加入ImL正下醇 振蕩2min，10，OOOg離屯、lOmin，取上清0.8mL，置45 °C真空離屯、濃縮裝置中揮干，200化乙臘 溶解殘渣，40，OOOg離屯、lOmin，扣L進樣。另取20化L尿液，加入1血正下醇振蕩2min，10，OOOg 離屯、lOmin，取上清0.8mL，置45°C真空離屯、濃縮裝置中揮干，200化乙臘溶解殘渣，40,000g 離屯、lOmin，扣L進樣。糞便樣品稱重后，按5mL/g的比例加入超純水研磨成混懸液。取20化1 糞混懸液，加入ImL正下醇振蕩2min，10,000g離屯、lOmin，取上清0.8mL，置45°C真空離屯、濃 縮裝置中揮干，200yL乙臘溶解殘渣，40, OOOg離屯、lOmin，5yL進樣。分析結(jié)果見表4~6。
[0035] 表4地愉皂巧在模型大鼠血漿中代謝物成分
[0036]
[0037] 表5地愉皂巧在模型組大鼠尿液中的代謝物信息
[00；3 引
[0039]表6地愉皂巧在模型組大鼠糞便中的代謝物信息
[0040]
[0041]
[0042] 實施例4地愉皂巧治療炎癥性腸病藥效作用研究
[0043] 步驟一:采用MTT法檢測細胞活性，用地愉總皂巧(濃度分別為10、25、50和10化g/ mL)處理RAW 264.7單核巨隧細胞后，在10、25、5〇4旨/1^濃度下地愉皂巧細胞不會出現(xiàn)明顯 的細胞毒性反應(yīng)(圖1)，lOOyg/mL濃度下地愉皂巧有細胞毒性(P<0.01)。
[0044] 步驟二：LPS刺激顯著上調(diào)了RAW 264.7細胞中TNF-a(P<〇. 001)、IL-6(P<0.001) 和IL-Ιβ(P<0.001)的表達。與LPS組相比，地愉皂巧劑量依賴性地下調(diào)了由WS刺激所引起 的TNF-a，比-1β和IL-6的表達升高。愉皂巧低濃度(P<0.01)、中濃度(P<0.01)和高濃度(P <0.01)能顯著下調(diào)LPS誘導的RAW264.7巨隧細胞的TNF-a分泌量。地愉皂巧低濃度(P< 0.01)、中濃度(P<0.01)和高濃度(P<0.01)能顯著下調(diào)LPS誘導的RAW264.7巨隧細胞的 比-1β表達。地愉皂巧高濃度(P<0.01)能顯著降低LPS誘導的RAW264.7巨隧細胞的化-6表 達，見圖2。
[0045] 步驟Ξ:對照組大鼠活潑，體重增長，大便正常，呈干顆粒狀。模型組大鼠自主活動 減少，體重增長與對照組相比有顯著性差異(P<〇.001)。不同劑量地愉皂巧治療組不同程 度減輕大鼠體重下降趨勢，低劑量組(P<0.05)、中劑量組(P<0.05)、高劑量組(P<0.05) 及陽性藥組(P<〇.01)與模型組相比有差異。地愉中劑量組及陽性藥組與對照組無統(tǒng)計學 差異。表明地愉皂巧可W緩解TNBS引起的大鼠體重減輕現(xiàn)象(見圖3)。
[0046] 步驟四：地愉皂巧對結(jié)腸組織病理形態(tài)的影響見圖4。
[0047] 正常組:結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)清楚，可見黏膜層、黏膜下層、肌層和外膜，黏膜上皮細胞無 變性、壞死和脫落，固有層見較多大腸腺，間質(zhì)未見充血、水腫，無炎細胞浸潤。
[004引模型組：全部結(jié)腸組織見組織病理學改變。各例黏膜上皮細胞基本完整，未見變 性、壞死和缺失。黏膜層及黏膜下層重度炎細胞浸潤，一側(cè)區(qū)域腸壁嚴重變窄，腸腺大量缺 失。
[0049] 治療組:各例黏膜上皮細胞基本完整，未見變性、壞死和缺失。黏膜層及黏膜下層 中度炎細胞浸潤，固有層大量腸腺呈囊性擴張，細胞被擠壓變扁，部分區(qū)域黏膜下層纖維結(jié) 締組織輕度增生
[0050] 陽性藥組:全部例腸組織查見組織病理學改變。黏膜層及黏膜下層輕微炎細胞浸 潤，黏膜下層疏松水腫，部分區(qū)域腸腺缺失。
[0化1 ] 步驟五:地愉皂巧對大鼠結(jié)腸組織中指標的影響包括：對MPO、SOD、MDA含量的影 響，結(jié)果如圖5所示。潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸組織中MPO表達明顯升高(P<0.05)，各劑量治 療組中大鼠結(jié)腸組織MPO表達不同程度降低，低劑量組(P<0.05)、中劑量組(P<0.01)、高 劑量組(P<〇.05)及陽性藥組(P<0.01)與模型組相比有統(tǒng)計學顯著性差異。造模后大鼠結(jié) 腸組織中SOD表達降低(P<0.05)，表明機體清除自由基能力下降。給予地愉皂巧治療后， SOD表達有恢復(fù)到正常水平的趨勢。造模后大鼠 MDA表達量明顯增多（P<0.05) dMDA是過氧 化反應(yīng)的產(chǎn)物，具有細胞毒性。它與脂質(zhì)作用并發(fā)生過氧化反應(yīng)，會導致蛋白質(zhì)、核酸等生 命大分子的交聯(lián)聚合。地愉皂巧治療后MDA有恢復(fù)到正常的趨勢。
【主權(quán)項】
1. 地榆皂苷提取物中含有復(fù)雜的皂苷類成分，主要為烏蘇烷型和齊墩果烷型皂苷，其 中含量較高的成分為地榆皂苷I和地榆皂苷II。2. 如權(quán)利要求1所述的地榆皂苷提取物，其特征在于:在大鼠體內(nèi)外發(fā)生I相，II相和脫 糖基代謝。3. 如權(quán)利要求1所述的地榆皂苷提取物，其特征在于:對炎癥性腸病的治療作用。
【文檔編號】A61K31/7048GK105920137SQ201610397150
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年6月2日
【發(fā)明人】梁艷, 王廣基, 肖競成, 李昔諾, 付涵煦, 邵宇皓, 李昊豐
【申請人】中國藥科大學