本發(fā)明涉及口蹄疫合成肽疫苗檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種油佐劑疫苗的競(jìng)爭(zhēng)ELISA定性定量檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

口蹄疫合成肽疫苗是一種通過(guò)人工方法按天然蛋白質(zhì)的氨基酸順序合成的保護(hù)性短肽?，F(xiàn)有定量測(cè)定方法通常有Lowry法、BCA法、HPLC等方法?，F(xiàn)有的定量方法中主要是針對(duì)純化后的抗原，若用于疫苗破乳后抗原檢測(cè)，由于疫苗水相成分較復(fù)雜，待檢樣品通常需要耗費(fèi)大量時(shí)間純化后才能達(dá)到檢測(cè)目的，且很多常規(guī)方法檢測(cè)靈敏度有限，無(wú)法達(dá)到檢測(cè)要求。

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)一起快速、方便、特異、可定量等優(yōu)點(diǎn)，在很多領(lǐng)域中得到廣泛應(yīng)用。常規(guī)的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA中，抗原與有限濃度的抗體同時(shí)加入到固相吸附有抗原的ELISA板子中進(jìn)行反應(yīng)，抗體與游離的抗原、固相化的抗原結(jié)合率概率為50％，得到的結(jié)果繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率較低，這使得檢測(cè)靈敏度較低。不能很好的反應(yīng)口蹄疫合成肽疫苗中有效抗原含量。

目前，對(duì)于口蹄疫合成肽抗原成品、半成品和疫苗抗原含量定量檢測(cè)沒(méi)有通用準(zhǔn)確的方法。為了尋找更加快速，有效，方便的的檢測(cè)方式，本發(fā)明人通過(guò)大量實(shí)驗(yàn)在常規(guī)間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA的基礎(chǔ)上進(jìn)行了改進(jìn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，本發(fā)明提供了一種油佐劑疫苗的競(jìng)爭(zhēng)ELISA定性定量檢測(cè)方法，為一種抗原定量檢測(cè)方法。通過(guò)對(duì)間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法的改進(jìn)，先將抗原與有限濃度的抗體先在稀釋板中反應(yīng)，抗體與抗原先完全中和。在隨后與固相化吸附有抗原的ELISA板中進(jìn)行反應(yīng)，造成固相化抗原、待測(cè)抗原與抗體結(jié)合的機(jī)會(huì)不均等。最終，得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率會(huì)大于常規(guī)間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA，從而大大提高檢測(cè)靈敏度。

本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

本發(fā)明提供了一種油佐劑疫苗的競(jìng)爭(zhēng)ELISA定性定量檢測(cè)方法，包括以下步驟：

抗原包被：將0.5μg/mL-5μg/mL人工合成的口蹄疫抗原固相化吸附到ELISA板子上；

稀釋抗體：將已知效價(jià)的抗體進(jìn)行稀釋，抗體稀釋后效價(jià)為1:250000-1:1100000；

抗原稀釋：在血清稀釋板上，用稀釋液將待檢抗原稀釋，標(biāo)準(zhǔn)抗原進(jìn)行不同比例稀釋形成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)抗原稀釋液；

抗原標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制及待檢抗原的定量檢測(cè)：將稀釋好的待檢抗原和不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)抗原稀釋液分別與稀釋好的抗體在稀釋板中進(jìn)行完全反應(yīng)，然后將各完全反應(yīng)后的反應(yīng)液分別加入到固相化抗原的ELISA板子中繼續(xù)反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，各加入酶標(biāo)記物、底物依次反應(yīng)，再各加入終止液終止，測(cè)定OD值，采用不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)抗原的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)抗原的OD值為縱坐標(biāo)繪制抗原標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后將待檢抗原的OD值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線中算出待測(cè)對(duì)應(yīng)抗原濃度，再乘以稀釋倍數(shù)即為待測(cè)樣品中抗原實(shí)際含量。

優(yōu)選地，所述待檢抗原最低檢測(cè)限度為1ng/mL-1.5ng/mL。

優(yōu)選地，抗原標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制及待檢抗原的定量檢測(cè)步驟中，所述完全反應(yīng)的時(shí)間大于等于60min，反應(yīng)溫度為37℃。該反應(yīng)時(shí)間可盡可能的保證反應(yīng)完全。

優(yōu)選地，抗原標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制及待檢抗原的定量檢測(cè)步驟中，所述各完全反應(yīng)后的反應(yīng)液分別加入到固相化抗原的ELISA板子中繼續(xù)反應(yīng)大于等于30min，反應(yīng)溫度為37℃。該反應(yīng)時(shí)間若小于30min，會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)不徹底，最終OD值偏低，影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。

優(yōu)選地，抗原標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制及待檢抗原的定量檢測(cè)步驟中，所述酶標(biāo)記物為SPA-HRP，或者為羊抗豬生物素-IgG和親和素-HRP。

更優(yōu)選地，所述酶標(biāo)記物為羊抗豬生物素-IgG和親和素-HRP。采用羊抗豬生物素-IgG和親和素-HRP作為酶標(biāo)記物，由于生物素親和素之間高親和力的牢固結(jié)合及多級(jí)放大效應(yīng)，可使抗原的檢測(cè)限更低。

優(yōu)選地，所述稀釋后酶標(biāo)記物的用量為100μL，稀釋比例為1:5000-1:10000。

優(yōu)選地，所述底物為：TMB溶液。

優(yōu)選地，所述終止液為2mol/L的H₂SO₄溶液。

優(yōu)選地，所述待檢抗原為：口蹄疫合成肽疫苗經(jīng)破乳后的水相抗原合成肽抗原成品或半成品中的一種。

本發(fā)明的原理是：將抗原與有限濃度的抗體先在稀釋板中反應(yīng)，待抗原抗體反應(yīng)完全后，將反應(yīng)液加入到固相吸附有抗原的ELISA板子中進(jìn)行反應(yīng)，之后加入酶標(biāo)記物進(jìn)行反應(yīng)，最后與底物顯色進(jìn)行檢測(cè)。最終的檢測(cè)結(jié)果表現(xiàn)為抗原濃度越高，顯色后檢測(cè)的OD值越低，成反比關(guān)系。將標(biāo)準(zhǔn)抗原進(jìn)行不同比例稀釋進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，檢測(cè)樣品與標(biāo)準(zhǔn)曲線關(guān)聯(lián)從而達(dá)到定量的要求。

現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的有益效果：

1)本方法先將抗原與有限濃度的抗體先在稀釋板中反應(yīng)，抗體與待檢抗原先完全中和，達(dá)到完全抑制的目的。在隨后固相化吸附有抗原的ELISA板中，固相化抗原與抗體結(jié)合隨之減少，使得固相化抗原、待測(cè)抗原與抗體結(jié)合機(jī)會(huì)不均等。因此，得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率會(huì)大于常規(guī)間接競(jìng)爭(zhēng)法，從而大大提高檢測(cè)靈敏度。

2)競(jìng)爭(zhēng)抑制ELISA對(duì)試劑的要求非常少，不管是單抗還是多抗都可以用于實(shí)驗(yàn)，更重要的是不管被檢對(duì)象是大分子物質(zhì)還是多肽、小分子藥物、小分子激素等只有一個(gè)表位的分子不能使用夾心ELISA的都可以使用競(jìng)爭(zhēng)ELISA進(jìn)行檢測(cè)。

3)由于抗原抗體反應(yīng)具有較高特異性，當(dāng)抗原材料中的干擾物質(zhì)不易去除，或不易得到足夠的純化抗原時(shí)，可用競(jìng)爭(zhēng)法達(dá)到檢測(cè)目的。同時(shí)反應(yīng)抗體稀釋后濃度較低，降低了非特異反應(yīng)和交叉反應(yīng)的干擾。

4)本方法可對(duì)合成肽抗原成品、半成品和合成肽疫苗抗原有效含量的定量檢測(cè)，檢測(cè)范圍廣。同時(shí)疫苗破乳后，水相成分較復(fù)雜，該方法簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便，破乳后水相樣品無(wú)需進(jìn)行純化處理即可達(dá)到定量檢測(cè)目的，相比較其他檢測(cè)方法花費(fèi)時(shí)間較短。

5)本發(fā)明采用間接法，利用很少量的酶可誘導(dǎo)大量的催化反應(yīng)，產(chǎn)生可供觀察的顯色現(xiàn)象，使得抗原能在較低濃度下進(jìn)行定量，靈敏度較高，且重復(fù)性好。

附圖說(shuō)明

通過(guò)閱讀參照以下附圖對(duì)非限制性實(shí)施例所作的詳細(xì)描述，本發(fā)明的其它特征、目的和優(yōu)點(diǎn)將會(huì)變得更明顯：

圖1為實(shí)施例1的抗原標(biāo)準(zhǔn)曲線；

圖2為實(shí)施例2的抗原標(biāo)準(zhǔn)曲線；

圖3為對(duì)比例1的抗原標(biāo)準(zhǔn)曲線。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。以下實(shí)施例將有助于本領(lǐng)域的技術(shù)人員進(jìn)一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)。這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

實(shí)施例1

本實(shí)施例提供了一種油佐劑疫苗的競(jìng)爭(zhēng)ELISA定性定量檢測(cè)方法，具體采用以下步驟：

1.抗原包被：將3μg/mL人工合成口蹄疫抗原，每孔100μL，固相化到ELISA板子上；

2.稀釋抗體：將已知效價(jià)的抗體進(jìn)行一定比例稀釋，稀釋后抗體效價(jià)為1:250000；

3.待檢抗原(所述待檢抗原為合成肽抗原成品，待檢抗原采用HPLC方法測(cè)得其抗原濃度為39.25μg/mL)與標(biāo)準(zhǔn)抗原稀釋：在血清稀釋板上，用稀釋液將待檢抗原按1:100稀釋，標(biāo)準(zhǔn)抗原分別按稀釋后濃度為1000ng/mL、500ng/mL、200ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、10ng/mL、5ng/mL進(jìn)行稀釋；

4.抗原抗體反應(yīng)：在稀釋板中，將100μL稀釋好的待檢抗原和標(biāo)準(zhǔn)抗原中分別加入等量稀釋好的抗體并混勻，于37℃下孵育60min；

5.孵育結(jié)束后，將血清稀釋板中的各反應(yīng)液分別吸取100μL到固相化有抗原的ELISA板中，于37℃下孵育30min；

6.孵育結(jié)束后，以PBST為洗液，洗板5次并拍干板中液體，向ELISA板中加入100μL1:10000稀釋好的SPA-HRP，于37℃下孵育30min；

7.孵育結(jié)束后，以PBST為洗液，洗板5次并拍干板中液體，向ELISA板中加入100μLTMB溶液，于37℃下避光顯色15min；

8.顯色結(jié)束后，向ELISA板中加入100μL 2mol/LH₂SO₄溶液終止反應(yīng)，并于450nm波長(zhǎng)下測(cè)定OD值；

9.根據(jù)測(cè)定的OD值，將各標(biāo)準(zhǔn)抗原濃度以10為底對(duì)數(shù)作為橫坐標(biāo)，各標(biāo)準(zhǔn)抗原測(cè)得的OD450為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y＝-0.3609x+1.4572，如圖1所示；將待檢抗原的OD值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線中算出待測(cè)對(duì)應(yīng)抗原濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品中抗原實(shí)際含量。本實(shí)施例中，測(cè)得待檢抗原的OD值為0.525，計(jì)算得樣品中抗原的實(shí)際含量為38.02μg/mL。該計(jì)算結(jié)果與采用HPLC方法測(cè)得的結(jié)果基本一致。

實(shí)施例2

本實(shí)施例提供了一種油佐劑疫苗的競(jìng)爭(zhēng)ELISA定性定量檢測(cè)方法，具體采用以下步驟：

1.抗原包被：將3μg/mL人工合成口蹄疫抗原，每孔100μL，固相化到ELISA板子上；

2.稀釋抗體：將已知效價(jià)的抗體進(jìn)行一定比例稀釋，稀釋后抗體效價(jià)為1:1100000；

3.待檢抗原(所述待檢抗原為疫苗破乳后的水相樣品，破乳效率為89.2％，經(jīng)純化后，采用HPLC方法測(cè)得其抗原濃度為148.83ng/mL)與標(biāo)準(zhǔn)抗原稀釋：在血清稀釋板上，將待檢抗原用稀釋液按1:100稀釋，已知標(biāo)準(zhǔn)抗原進(jìn)行稀釋，稀釋濃度分別為1000ng/mL、500ng/mL、200ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、1ng/mL；

4.抗原抗體反應(yīng)：在稀釋板中，將100μL稀釋好的待檢抗原和標(biāo)準(zhǔn)抗原中加入等量稀釋好的抗體并混勻，于37℃下孵育60min；

5.孵育結(jié)束后，將血清稀釋板中的反應(yīng)液吸取100μL到固相化有抗原的ELISA板中，于37℃下孵育30min；

6.孵育結(jié)束后，以PBST為洗液，洗板5次并拍干板中液體，向ELISA板中加入100μL1:10000稀釋好的羊抗豬生物素-IgG，于37℃下孵育30min；

7.孵育結(jié)束后，以PBST為洗液，洗板5次并拍干板中液體，向ELISA板中加入100μL1:5000稀釋好的親和素-HRP，于37℃下孵育30min；

8.孵育結(jié)束后，以PBST為洗液，洗板5次并拍干板中液體，向ELISA板中加入100μLTMB溶液，于37℃下避光顯色15min；

9.顯色結(jié)束后，向ELISA板中加入100μL 2mol/LH₂SO₄溶液終止反應(yīng)，并于450nm波長(zhǎng)下測(cè)定OD值；

10.根據(jù)測(cè)定的OD值，以標(biāo)準(zhǔn)抗原濃度以10為底對(duì)數(shù)作為橫坐標(biāo)，OD450為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y＝-0.4021x+1.5186，如圖2所示；將待檢抗原的OD值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線中算出待測(cè)對(duì)應(yīng)抗原濃度，抗原實(shí)際含量＝[(對(duì)應(yīng)抗原濃度×稀釋倍數(shù))/破乳效率]/2即為樣品中抗原實(shí)際含量。本實(shí)施例中，測(cè)得待檢抗原的OD值為1.350，計(jì)算得樣品中抗原的實(shí)際含量為147.43ng/mL。該計(jì)算結(jié)果與采用HPLC方法測(cè)得的結(jié)果基本一致。

注：由于疫苗破乳后，油相與水相分離，水相中實(shí)際抗原濃度增大1倍，計(jì)算疫苗實(shí)際抗原濃度需除以2。

采用本實(shí)施例方法對(duì)該樣品的10個(gè)平行樣進(jìn)行同時(shí)測(cè)定，其結(jié)果的波動(dòng)范圍在±0.80內(nèi)，說(shuō)明其重復(fù)性良好。

對(duì)比例1

本對(duì)比例提供了一種油佐劑疫苗的競(jìng)爭(zhēng)ELISA定性定量檢測(cè)方法，包括以下步驟：

1.抗原包被：將3μg/mL人工合成口蹄疫抗原，每孔100μL，固相化到ELISA板子上；

2.稀釋抗體：將已知效價(jià)的抗體進(jìn)行一定比例稀釋，稀釋后抗體效價(jià)為1:250000；

3.待檢抗原(所述待檢抗原為合成肽抗原成品，待檢抗原采用HPLC方法測(cè)得其抗原濃度為39.25μg/mL)與標(biāo)準(zhǔn)抗原稀釋：在血清稀釋板上，用稀釋液將待檢抗原按1:100稀釋，已已知標(biāo)準(zhǔn)抗原進(jìn)行稀釋，稀釋濃度分別為1000ng/mL、500ng/mL、200ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、10ng/mL、5ng/mL；所述待檢抗原與實(shí)施例1的待檢抗原為相同樣品；

4.抗原抗體反應(yīng)：將稀釋好的待檢抗原和標(biāo)準(zhǔn)抗原中加入等量稀釋好的抗體并混勻，取100μL加入到固相化有抗原的ELISA板中，于37℃下孵育60min；

5.孵育結(jié)束后，以PBST為洗液，洗板5次并拍干板中液體，向ELISA板中加入100μL 1:10000稀釋好的SPA-HRP，于37℃下孵育30min；

6.孵育結(jié)束后，以PBST為洗液，洗板5次并拍干板中液體，向ELISA板中加入100μL底物溶液，于37℃下避光顯色15min；

7.顯色結(jié)束后，向ELISA板中加入100μL 2mol/LH₂SO₄溶液終止反應(yīng)，并于450nm波長(zhǎng)下測(cè)定OD值；

8.根據(jù)測(cè)定的OD值，以標(biāo)準(zhǔn)抗原濃度以10為底對(duì)數(shù)作為橫坐標(biāo)，OD450為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y＝-0.2787+1.3962，如圖3所示；將待檢抗原的OD值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線中算出待測(cè)對(duì)應(yīng)抗原濃度，再乘以稀釋倍數(shù)即為樣品中抗原實(shí)際含量。本實(shí)施例中，測(cè)得待檢抗原的OD值為0.659，計(jì)算得樣品中抗原的實(shí)際含量為44.67μg/mL。該計(jì)算結(jié)果與采用HPLC方法測(cè)得的結(jié)果相差了5.42μg/mL。因此，對(duì)比實(shí)施例1和對(duì)比例1的結(jié)果可知，采用本發(fā)明的方法測(cè)定的結(jié)果更準(zhǔn)確。

本發(fā)明具體應(yīng)用途徑很多，以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式。應(yīng)當(dāng)指出，以上實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而并不用于限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)，這些改進(jìn)也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。