本發(fā)明涉及生物技術領域，具體涉及一種急性髓系白血病(Acute Myelo cytic Leukemia,AML)粒細胞抗原表達量檢測試劑盒。本發(fā)明還涉及急性髓系白血病粒細胞抗原表達量檢測方法。

背景技術：

AML是造血系統(tǒng)的髓系原始細胞克隆性惡性增殖性疾病。它是一個具有高度異質(zhì)性的疾病群，可以由正常髓系細胞分化發(fā)育過程中不同階段的造血祖細胞惡性變轉(zhuǎn)化。1976年首先將AML分為7型，即AML-M1至AML-M7。1991年根據(jù)細胞的免疫標志特點，又增加了AML-M0的診斷。

目前，AML的治療已經(jīng)取得了很大進展，但化療仍難以使患者治愈，多數(shù)患者在2年內(nèi)仍會復發(fā)；由于缺乏對白血病細胞的靶向特異性，加大化療劑量雖然能提高緩解率和無病生存期，但化療毒性和相關死亡率也同時增加，因此血液學專家正積極尋找一些新的特異、安全和高效的治療手段。隨著化療、造血干細胞移植、基因靶向治療以及生物免疫治療等多種治療方法的發(fā)展，A ML患者的完全緩解率及5年無病生存率均較前有所改善，但是仍有大部分患者出現(xiàn)耐藥和復發(fā)，預后不良。

單克隆抗體是有淋巴細胞雜交瘤產(chǎn)生的、只針對復合抗原分子上某一單個抗原決定簇的特異性抗體。因具有分子量小、毒副作用低、靶向性好等優(yōu)點，近年來已成為腫瘤治療用藥的主要方式。在90％AML患者中，髓系白血病細胞表面有一相對特異、穩(wěn)定、高表達的抗原CD33，而在正常造血多能干細胞及非造血細胞上卻不存在這種糖蛋白。因此，CD33成為AML免疫治療最適宜的靶抗原。使用CD33單克隆抗體聯(lián)合化療治療16例復發(fā)、難治性AML患者，獲得較高的完全緩解率，為部分患者行異基因造血干細胞移植提供了契機，可作為伴有CD33高表達復發(fā)或難治性AML患者的一種較為有效的治療方法。

美羅他格(Mylotarg,Gemtuzumab Ozogamicin,GO)是人源化抗CD33單克隆抗體與強效抗腫瘤抗生素——乙酰棘孢霉素偶聯(lián)物，與髓系白血病細胞表面CD33抗原結(jié)合，進入細胞后釋放棘孢霉素，對髓系白血病細胞有明顯殺滅作用，用于治療復發(fā)、難治的CD33⁺AML，獲得良好療效。GO與其它化療藥物聯(lián)合應用治療AML的臨床試驗正在進行中，如地西他濱(DAC)聯(lián)合抗C D33單抗GO治療難治性AML是安全可行的，尤其是對于一般情況差、不能耐受高劑量化療或高劑量挽救化療失敗的患者，不失為一種新的治療選擇。使用該方法對2例難治性AML患者進行治療后，均未出現(xiàn)肝靜脈閉塞病(Hepa tic Veno-Occlusive Disease,HVOD)及其它臟器功能損害表現(xiàn)。

針對髓系白血病細胞表面CD33抗原的檢測，現(xiàn)有技術中表面等離子體共振(Surface Plasmon Resonance,SPR)生物傳感器作為一種新興的生物檢測技術，采用自組裝膜技術，在傳感芯片表面修飾抗CD33單克隆抗體，利用自行構(gòu)建的SPR生物傳感器檢測人骨髓血液中髓系白血病細胞抗原CD33的表達，能夠快速給出定量分析結(jié)果；但是這個方法的缺點也是明顯的，即生物固化膜的不穩(wěn)定性：物質(zhì)分子在芯片表面吸附的不牢固，時間長會脫落，難以形成穩(wěn)定的分子；固定量也難以控制；生物分子在金表面容易喪失活性，尤其是溫度、酸堿度以及離子強度發(fā)生變化時更易失活；固定分子的取向也難以控制。

作為現(xiàn)有技術中另一種檢測方法，酶聯(lián)免疫吸附劑測定(Enzyme Linked Immμnosorbent Assay,ELISA)采用抗原與抗體的特異反應將待測物與酶連接，通過酶與底物產(chǎn)生顏色反應，可進行定量測定。目前已建立了ELISA檢測CD33單克隆抗體的方法，也開發(fā)出相應的商品化試劑盒，可以檢測血清、血漿、組織勻漿液、細胞上清培養(yǎng)液等樣本中的含量。但是ELISA方法僅可檢測液體中可溶性蛋白的含量，即檢測到髓系細胞分泌到血液或骨髓中的CD33抗體的含量而無法直接檢測細胞表面的抗原表達量。因此利用ELISA方法檢測到的CD33的抗體既可來源于AML患者正常的髓系前體細胞也可來源于異常的髓系白血病細胞，因此目前尚未將ELISA方法應用與臨床評估AML患者的治療效果上來。

使用放射性核素標記方法也可測定每個細胞表面某種分子的數(shù)目，具有特異性強且靈敏度高的特點。放射性核素標記方法是將非標記抗原與放射性標記抗原同時競爭結(jié)合物(如抗體)上有限的結(jié)合位點，然后將結(jié)合抗原和未結(jié)合的游離抗原分離，用儀器測定放射性分布，利用標準曲線確定樣本中待測物含量。但缺點是受核素半衰期的限制且需特別防止其放射性污染。目前尚未開發(fā)出用于CD33檢測的放射免疫測定試劑盒。

流式細胞術(Flow Cytometry,FCM)是一種在功能水平上對單細胞或其它生物粒子進行定量分析和分選的檢測手段，它可以高速分析上萬個細胞，并能同時從一個細胞中測得多個參數(shù)，與傳統(tǒng)的熒光鏡檢查相比，具有速度快、精度高、準確性好、靈敏度高、環(huán)境友好、操作簡便等優(yōu)點。流式細胞術可以同時檢測樣本細胞的前向角散射(Forward Scatter,FSC)、側(cè)向角散射(Side Scatter,SSC)及多個熒光通道強度，通過選擇合適的熒光抗體及正確的設門可以準確知道各群細胞的抗體表達情況，但傳統(tǒng)的流式細胞術主要是測定表達目標抗原細胞所占的比例，以及對目標抗原的表達做定性分析，即判斷抗體表達是否為陰性、弱陽性或強陽性，而很少對抗體表達做定量分析。

綜上所述，如何對髓系白血病粒細胞表面CD33抗原表達實現(xiàn)快速、準確的定量分析，成為當前亟待解決的技術問題。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術中髓系白血病粒細胞表面CD33抗原表達定量分析技術的不足，提供了急性髓系白血病粒細胞抗原表達量檢測試劑盒及檢測方法，可快速、準確的實現(xiàn)對髓系白血病粒細胞CD33抗原表達的定量檢測分析，有效的指導CD33單抗藥物對AML的靶向治療。

為了實現(xiàn)上述技術目的，本發(fā)明實施例提供的一種技術方案為：

一種急性髓系白血病粒細胞抗原表達量檢測試劑盒，其試劑包括不同的熒光標記的抗CD45抗體、抗CD15抗體和抗CD33抗體。

優(yōu)選的，所述抗CD45抗體的熒光標記為Percp。

優(yōu)選的，所述抗CD15抗體的熒光標記為FITC。

優(yōu)選的，所述抗CD33抗體的熒光標記為PE。

作為前述試劑盒的優(yōu)選，所述試劑還包括紅細胞裂解液和磷酸緩沖鹽溶液(Phosphate Buffer Saline,PBS)溶液。

本發(fā)明實施例提供的另一種技術方案為：

一種急性髓系白血病粒細胞抗原表達量檢測方法，包括步驟如下：

S1.采集檢測標本：抽取AML患者的外周血或骨髓作為檢測標本；

S2.加入抗體及熒光染色：將所述檢測標本中加入使用不同的熒光標記的抗CD45抗體、抗CD15抗體和抗CD33抗體并混勻；

S3.流式細胞術檢測：對所述檢測標本進行孵育和紅細胞裂解后，使用流式細胞術進行檢測，設門分型得到CD15⁺CD33⁺的靶標細胞熒光強度；

S4.測定標準曲線：使用流式細胞術在所述檢測標本同等條件下測定Qua ntiBRITE PE Beads熒光，獲得Beads(微球)平均熒光強度與抗原表達量的標準曲線；

S5.計算抗原表達量：將所述靶標細胞熒光強度值代入標準曲線換算得到所述檢測標本中髓系白血病粒細胞表面CD33平均抗原表達量。

優(yōu)選的，執(zhí)行步驟S2前，對所述檢測標本進行白細胞計數(shù)，將所述檢測標本的細胞濃度調(diào)至3×10⁷/mL。

優(yōu)選的，步驟S4測定所述標準曲線時，使用流式細胞儀檢測QuantiBRIT E PE Beads熒光強度，以前向角/側(cè)向角設門，以前向角設閾值得到Beads；根據(jù)PE熒光強度在將Beads分群，并得到每群Beads的熒光強度均值；根據(jù)Beads提供的分子量和得到的所述每群Beads的熒光強度均值擬合得到所述標準曲線。

優(yōu)選的，步驟S2中加入所述檢測標本的不同的熒光標記的抗體為：CD45Percp、CD15FITC和CD33PE。

優(yōu)選的，對所述檢測標本進行設門分型時，在CD45Percp-SSC圖中設門得到CD45陽性的粒細胞，進一步在CD45Percp-CD15FITC圖中設門得到C D45⁺CD15⁺的非干/祖細胞的粒細胞，進一步在CD15FITC-CD33PE圖中設門得到所述CD15⁺CD33⁺的靶標細胞。

本發(fā)明的技術方案將所述試劑盒應用于所述檢測方法，使用流式細胞術檢測AML患者外周血及骨髓中的粒細胞(非干/祖細胞)的CD33抗原表達量，與傳統(tǒng)的流式細胞術主要測定表達目標抗原細胞比例和進行定性分析相比，其有益效果在于：可快速、準確的實現(xiàn)對髓系白血病粒細胞CD33抗原表達的定量檢測分析，檢測結(jié)果可用于評估AML單克隆抗體療法的療效，有效的指導CD33單抗藥物對AML的靶向治療。

附圖說明

圖1所示為本發(fā)明實施例AML細胞抗原表達量檢測方法的流程圖；

圖2所示為本發(fā)明實施例中QuantiBRITE PE Beads的微球PE熒光強度的Count-PE直方圖；

圖3所示為本發(fā)明實施例中測定獲得微球平均熒光強度和抗原表達量對數(shù)值的標準曲線；

圖4所示為本發(fā)明實施例使用BD FACSDIVA軟件分析數(shù)據(jù)樣本管獲得的AML細胞分型結(jié)果。

具體實施方式

以下結(jié)合附圖通過實施例對本發(fā)明做進一步說明，以便更好地理解本發(fā)明。

本發(fā)明的技術方案將所述試劑盒應用于所述檢測方法，使用流式細胞術檢測AML患者外周血及骨髓中的粒細胞(非干/祖細胞)的CD33抗原表達量。

本發(fā)明一種急性髓系白血病粒細胞抗原表達量檢測試劑盒的實施例，其試劑包括不同的熒光標記的抗CD45抗體、抗CD15抗體和抗CD33抗體。

作為一種優(yōu)選的實施方式，前述試劑盒中，抗CD45抗體的熒光標記為P ercp，抗CD15抗體的熒光標記為FITC，抗CD33抗體的熒光標記為PE；試劑還可包括紅細胞裂解液和PBS。

本發(fā)明一種急性髓系白血病粒細胞抗原表達量檢測方法的實施例，如圖1所示，包括步驟如下：

S1.采集檢測標本：抽取AML患者的外周血或骨髓，患者的外周血或骨髓作為檢測標本；

S2.加入抗體及熒光染色：將檢測標本中加入使用不同的熒光標記的抗CD45抗體、抗CD15抗體和抗CD33抗體并混勻；

S3.流式細胞術檢測：對檢測標本進行孵育和紅細胞裂解后，使用流式細胞術進行檢測，設門分型得到CD15⁺CD33⁺靶標細胞的熒光強度；

S4.測定標準曲線：使用流式細胞術在檢測標本同等條件下測定QuantiB RITE PE Beads熒光，獲得Beads平均熒光強度與抗原表達量的標準曲線；

S5.計算抗原表達量：將靶標細胞熒光強度值代入標準曲線換算得到檢測標本中髓系白血病粒細胞表面CD33平均抗原表達量。

具體的檢測技術方案如下：熒光標記的抗體使用CD45Percp/CD15FITC/CD33PE；

試劑用量及添加標準，標本與抗體的添加比例為：細胞濃度調(diào)至3×10⁷個/mL，向流式管中加70μL標本；單次檢測(test)中，試劑按照試劑說明添加CD45Percp 10μL/test、CD15FITC 20μL/test、CD33PE 20μL/test，確保抗體充足；

使用美國BD公司(Becton,Dickinson and Company)的QuantiBRITE PE Beads，同時根據(jù)QuantiBRITE PE Beads中不同Beads群的平均熒光強度及Beads上的分子量繪制標準曲線。將檢測標本中粒細胞的CD33的平均熒光強度帶入標準曲線，計算出粒細胞上CD33的平均抗原表達量。

作為一種優(yōu)選的實施方式，具體操作流程為：

步驟S1中，抽取AML患者的外周血作為檢測標本，對檢測標本進行白細胞計數(shù)，將細胞濃度調(diào)至3×10⁷/mL；

步驟S2中，取一支專用的流式管，向流式管中加入CD45-Percp 10μL、CD15FITC 20μL、CD33PE 10μL；向流式管內(nèi)加入檢測標本70μL，低速渦旋混勻；

步驟S3中，將混勻檢測標本室溫避光孵育20min；向流式管內(nèi)加入紅細胞裂解液1mL，低速渦旋混勻，室溫避光裂解紅細胞10min；裂解結(jié)束后立即以1500r/min離心5min，離心結(jié)束后棄上清，然后向管內(nèi)加入1mL PBS，低速渦旋混勻，以1500r/min離心5min；離心結(jié)束后棄上清；向管內(nèi)加入0.5mL的PBS重懸細胞，低速渦旋混勻，24h內(nèi)使用流式細胞儀上機檢測；在檢測時，調(diào)節(jié)好個通道電壓，收集P1門內(nèi)細胞100萬；

步驟S4中，取一支PE Beads，加入500μL緩沖液(0.3％甲醛溶液)，與前述檢測標本同樣條件使用流式細胞儀上機檢測；應用BD FACSDIVA軟件分析數(shù)據(jù)，在SSC-FSC散點圖中設門得到Beads，繪制如圖2所示的Count-PE的直方圖中，根據(jù)PE熒光強度的不同將Beads分為Low、MedLow、MedHigh和High四個群，得到每群Beads的熒光強度的均值；以Beads提供的分子量的對數(shù)值為橫坐標與測定獲得的Beads熒光強度均值的對數(shù)值為縱坐標，擬合得到如圖3的Beads熒光強度和抗原表達量的標準曲線；

步驟S5中，應用BD FACSDIVA軟件分析檢測標本的流式管，如圖4所示：

在CD45Percp-SSC圖中設門得到CD45陽性且SSC較大的粒細胞，CD45Percp-CD15FITC圖中設門的到CD45⁺CD15⁺的粒細胞(非干/祖細胞)，在CD15FITC-CD33PE圖中得到CD15⁺CD33⁺的靶標細胞，讀取靶標細胞的熒光強度的均值，取對數(shù)代入Beads熒光強度和抗原表達量的標準曲線，得到CD33抗原表達量的對數(shù)值，從而得到粒細胞(非干/祖細胞)上的CD33平均抗原表達量。

在本發(fā)明中，上標“+”代表陽性，即表示該抗原在細胞表面有表達。

若未特別指明，以上各實施例中所用技術手段為本技術領域技術人員的常規(guī)手段，所用原料均為可取得的市售產(chǎn)品。

應理解，上述實施例只為說明本發(fā)明的技術構(gòu)思及特點，其目的在于供本領域技術人員了解本發(fā)明的內(nèi)容并據(jù)以實施，并非具體實施方式的窮舉，并不能以此限制本發(fā)明的保護范圍。凡根據(jù)本發(fā)明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術方案的宗旨和范圍，其均應涵蓋在本發(fā)明的保護范圍當中。