一種急性粒細(xì)胞白血病治療靶標(biāo)及其用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種急性粒細(xì)胞白血病治療靶標(biāo)及其用途。本發(fā)明公開了Shp2蛋白作為急性粒細(xì)胞白血病治療靶標(biāo)在制備治療急性粒細(xì)胞白血病的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)并證實(shí)shp2的抑制能有效遏制急性粒系白血病的發(fā)生發(fā)展，能夠作為重要的臨床治療靶點(diǎn)，可以帶來巨大的社會(huì)經(jīng)濟(jì)利益。
【專利說明】一種急性粒細(xì)胞白血病治療靶標(biāo)及其用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種急性粒細(xì)胞白血病治療靶標(biāo)及其用途。
【背景技術(shù)】
[0002]在我國惡性腫瘤致死率中，白血病在兒童及35歲以下成人中居首位，在男性和女性中分別為第8位。急性粒細(xì)胞白血病是最多見的白血病類型，而且發(fā)病幾率隨年齡增高呈上升趨勢(shì)。隨著我國老齡化程度的加劇，急性粒細(xì)胞白血病將成為危害中老年的重大惡性疾病。目前國內(nèi)外急性粒細(xì)胞白血病的治療仍然主要運(yùn)用化療或者骨髓移植術(shù)。
[0003]在60歲以下的急性粒細(xì)胞白血病病人中，蒽環(huán)類抗生素(與阿糖胞苷聯(lián)合誘導(dǎo)治療能使70%左右的病人進(jìn)入寬緩期，但即使運(yùn)用高劑量阿糖胞苷或者骨髓移植術(shù)，50%的寬緩期病人白血病仍會(huì)復(fù)發(fā)。在60歲以上的老年患者中，同樣的聯(lián)合療法也只能使50%的病人進(jìn)入寬緩期，而其中大部分的患者(85%)在化療后2至3年內(nèi)將會(huì)復(fù)發(fā)。而且隨著年齡增長，很多老年人無法忍受化療藥物所帶來的副作用，不能進(jìn)行高劑量的化療，這些老年患者的生存期只有四個(gè)月左右。也就是說，在目前的治療方案下，60歲以下的患者5年無疾病存活率為35%，60以上老年患者則低為7.25%左右。過去的二十年內(nèi)，鮮有治療急性粒細(xì)胞白血病的新藥問世，通過優(yōu)化化療藥物劑量的臨床試驗(yàn)也都沒有取得很好的結(jié)果。
[0004]目前癌癥治療仍以外科切除、放療和化療為主。放、化療通過抑制細(xì)胞分裂增殖來達(dá)到殺死腫瘤細(xì)胞的目的，沒有特定靶點(diǎn)，因此毒副作用很大。分子靶向藥物作為新一代的腫瘤藥物，能夠特異性阻斷腫瘤細(xì)胞中異常激活的信號(hào)通路或腫瘤血管生成，與傳統(tǒng)放化療相比更高效、副作用更小。因此有效靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)是癌癥研究和治療的重大需求。腫瘤的發(fā)生發(fā)展往往與腫瘤特異表達(dá)的基因有關(guān)，這些腫瘤細(xì)胞高表達(dá)的蛋白，如果是有功能的，可能可以成為治療靶標(biāo)；也可以采用該受體的激動(dòng)劑或拮抗劑，促進(jìn)或抑制受體活性和功能，從而影響腫瘤的生長、增殖和遷移。蛋白的磷酸化和去磷酸化是由磷酸激酶和磷酸酶精確調(diào)控的可逆過程，在骨髓細(xì)胞增殖，分化，凋亡，遷移等一系列生物功能中起著不可或缺的重要作用。聚焦腫瘤組織特異突變或高表達(dá)的磷酸激酶和磷酸酶并以之為治療靶點(diǎn)是一種被人們認(rèn)為有希望并且有效的尋找治療腫瘤新藥物的手段。例如，第一個(gè)上市的靶向藥物伊馬替尼(imatinib，商品名為格列衛(wèi))特異性針對(duì)BCR/ABL靶點(diǎn)，革命性的改變了慢性髓系白血病的治療手段。2013年5月美國食品藥品局又批準(zhǔn)了針對(duì)MEK的靶向藥物trametinib用于黑色素的治療。
[0005]Shp2蛋白是由PTPNll基因編碼的非受體蛋白酪氨酸磷酸酶。近期的研究表明，生殖細(xì)胞中PTPNll基因的突變見于50%的奴南式綜合征(Noonan Syndrome)病人中。血液異常的病征如肝脾腫大，幼年型粒單核細(xì)胞白血病(juvenile myelomonocytic leukemia,JMML)在奴南式綜合 征中常見。體細(xì)胞PTPNll基因的突變率在非奴南式綜合征的幼年型粒單核細(xì)胞白血病中高達(dá)35%，在兒童急性粒細(xì)胞白血病中為4%，骨髓增生異常綜合征(myelodysplastic syndrome,MDS)中為10%,在急性淋巴細(xì)胞白血病中占7%。除此之外，PTPNll基因突變也與多種染色體異常(比如llq23，多系白血病基因MLL)相關(guān)。Shp2蛋白結(jié)構(gòu)上由氨基端的兩個(gè)SH2結(jié)構(gòu)域，蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)結(jié)構(gòu)域和羧基端的脯氨酸富集的超二級(jí)結(jié)構(gòu)組成。在無細(xì)胞外刺激的情況下，氨基端SH2結(jié)構(gòu)域與PTP結(jié)構(gòu)域形成分子內(nèi)相互作用，使Shp2蛋白構(gòu)象處于靜息狀態(tài)從而抑制磷酸酶的活性。在外界刺激，譬如生長激素，生長因子等的刺激下，細(xì)胞表面的受體磷酸激酶活化，其胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域自我磷酸化后，Shp2的氨基端SH2結(jié)構(gòu)域與受體磷酸激酶結(jié)合改變了蛋白構(gòu)象，PTP結(jié)構(gòu)域暴露出來，Shp2的磷酸酶活性即被瞬間激活。Shp2氨基端SH2結(jié)構(gòu)域上的突變，遏制了蛋白本身的活性調(diào)控，而使Shp2—直處于激活狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)證明，雖然成年人白血病患者中PTPNll基因突變的比例較低，但PTPNll基因的表達(dá)量以及Shp2蛋白的活性顯著性的高于正常血液細(xì)胞。Shp2在粒細(xì)胞前體細(xì)胞以及幼稚細(xì)胞中活性最高，其酶活隨著細(xì)胞分化而降低。更為重要的是，在急性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞中，Shp2活性與細(xì)胞增殖速度呈正相關(guān)性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種急性粒細(xì)胞白血病治療靶標(biāo)及其用途。
[0007]為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供了 Shp2蛋白作為急性粒細(xì)胞白血病治療靶標(biāo)在制備治療急性粒細(xì)胞白血病的藥物中的應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明還提供了一種用于治療急性粒細(xì)胞白血病的藥物，其特征在于，含有能夠抑制Shp2蛋白表達(dá)的組分。
[0009]本發(fā)明通過一系列的體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)拮抗shp2能夠有效抑制急性粒系白血病細(xì)胞的增值，遏制小鼠體內(nèi)急性粒系白血病的發(fā)生和惡化。基于實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本發(fā)明提出，蛋白磷酸酶Shp2可作 為治療急性粒細(xì)胞白血病的一個(gè)新靶點(diǎn)。
[0010]PTEN是一個(gè)已知的抑癌基因，在造血系統(tǒng)中敲除該基因能誘發(fā)小鼠在5天內(nèi)患良性粒細(xì)胞增殖疾病，并在4到6周內(nèi)惡化成急性粒細(xì)胞白血病。本發(fā)明利用了 PTEN基因敲除小鼠和PTEN基因干擾技術(shù)建立了急性粒細(xì)胞白血病的體內(nèi)與體外模型。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)顯示:用siRNA干擾Shp2的表達(dá)能有效抑制急性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞系K562的體外增殖，抑癌基因PTEN的表達(dá)阻斷后K562細(xì)胞增殖顯著加快，而干擾Shp2基因表達(dá)能使細(xì)胞增殖恢復(fù)到對(duì)照組水平；小鼠體內(nèi)敲除Shp2能使PTEN缺失小鼠的外周血白細(xì)胞，粒細(xì)胞和單核細(xì)胞均恢復(fù)到正常對(duì)照組范圍，外周血中用Grl抗體特異標(biāo)記的粒細(xì)胞也在雙基因敲除小鼠中較PTEN敲除小鼠明顯下降；Shp2敲除有效降低了 PTEN缺失骨髓中Grl+Macl+粒細(xì)胞前體細(xì)胞數(shù)量；通過多抗體標(biāo)記的流式細(xì)胞技術(shù)進(jìn)一步表明敲除Shp2的抑癌作用來源于降低PTEN缺失粒系/單核系祖細(xì)胞(gran微升ocyte/monocyte progenitors, GMPs)的增殖。腫瘤細(xì)胞對(duì)脾臟和肝臟的浸潤在急性粒細(xì)胞白血病患者中頗為常見，這一現(xiàn)象也見于PTEN基因敲除小鼠中，Shp2敲除能部分重建正常的脾臟白髓和紅髓結(jié)構(gòu)，并且抑制粒系腫瘤細(xì)胞對(duì)肝臟的浸潤。
[0011]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是:
[0012]本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)并證實(shí)shp2的抑制能有效遏制急性粒系白血病的發(fā)生發(fā)展，能夠作為重要的臨床治療靶點(diǎn)，可以帶來巨大的社會(huì)經(jīng)濟(jì)利益。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]圖1為抑制腫瘤細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖；[0014]圖2為小鼠外周血的采集和全血分析結(jié)果圖；
[0015]圖3為外周血的流式細(xì)胞染色和檢測(cè)結(jié)果圖；
[0016]圖4為骨髓中粒細(xì)胞前體細(xì)胞的流式細(xì)胞染色和檢測(cè)結(jié)果圖；
[0017]圖5為骨髓中的粒系/單核系祖細(xì)胞的流式細(xì)胞染色和檢測(cè)結(jié)果圖；
[0018]圖6為蘇木精-伊紅染色圖；
[0019]圖7為氯乙酸酯酶染色圖；
[0020]圖中，***表示p〈0.001, **表示p〈0.01, *表示p〈0.05,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示為平均值土 S.E.M。
【具體實(shí)施方式】
[0021 ] 下面結(jié)合實(shí)施例來具體說明本發(fā)明。
[0022]實(shí)施例1:抑制腫瘤細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)
[0023]實(shí)驗(yàn)材料:K562細(xì)胞系(從美國ATCC牛物牛物標(biāo)準(zhǔn)品咨源中心購買)，血球計(jì)數(shù)板,lonza nucleofecto電轉(zhuǎn)染試劑盒(從Lonza公司購買),siShp2寡聚核苷酸(從Qiagen公司購買)、siPTEN寡聚核苷酸(從Qiagen公司購買)及對(duì)照寡聚核苷酸(從Qiagen公司購買)。
[0024]實(shí)驗(yàn)步驟:
[0025]I)將siShp2寡聚核苷酸和siPTEN寡聚核苷酸分別溶于無RNA酶的去離子水，至終濃度為20nM。
[0026]2)按lonza nucleofecto電轉(zhuǎn)染試劑盒的使用說明，將siShp2寡聚核苷酸、siPTEN寡聚核苷酸電轉(zhuǎn)至培養(yǎng)的K562細(xì)胞系細(xì)胞，每個(gè)反應(yīng)孔的細(xì)胞數(shù)量為IO6個(gè)，加入20nM寡聚核苷酸18ul。
[0027]3)電轉(zhuǎn)后，細(xì)胞放置細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，每24小時(shí)計(jì)數(shù)一次，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，繪制細(xì)胞生長曲線，檢測(cè)細(xì)胞的增殖情況。
[0028]實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，干擾Shp2的表達(dá)能有效抑制急性粒系白血病細(xì)胞系K562的體外增殖。干擾PTEN基因表達(dá)能提高K562的細(xì)胞增殖，而同時(shí)干擾PTEN和Shp2的表達(dá)能使K562增殖速度恢復(fù)到對(duì)照組水平。
[0029]實(shí)施例2:小鼠外周血的采集和全血分析
[0030]實(shí)驗(yàn)材料:野生型BL6/C57小鼠、pten敲除型小鼠、shp2敲除型小鼠、shp2和pten雙基因敲除小鼠，每種小鼠各5只。其中，野生型BL6/C57小鼠和pten敲除型小鼠購買自美國jackson lab公司，shp2敲除型小鼠為自行構(gòu)建,詳細(xì)構(gòu)建方法記載在文獻(xiàn)Proc NatlAcad Sci U S A.2004November9 ； 101 (45):16064-16069 中。shp2 和 pten 雙基因敲除小鼠是由pten敲除型小鼠和shp2敲除型小鼠雜交獲得。
[0031]實(shí)驗(yàn)方法:
[0032]1)從小鼠眼窩處采血200微升，收集至含EDTA抗凝劑的采血管中。
[0033]2) 4小時(shí)內(nèi)用Hemavet動(dòng)物外周血分析儀分析外周血全血指標(biāo)。
[0034]3)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。
[0035]實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，小鼠體內(nèi)敲除Shp2能使PTEN基因缺失小鼠自發(fā)急性粒系白血病動(dòng)物模型中的外周血白細(xì)胞(WBC)，粒細(xì)胞(GRA)、淋巴細(xì)胞(LYM)和單核細(xì)胞(MON)均恢復(fù)到正常對(duì)照組范圍。
[0036]實(shí)施例3:外周血的流式細(xì)胞染色和檢測(cè)
[0037]實(shí)驗(yàn)材料:野生型BL6/C57小鼠、shp2敲除型小鼠、pten敲除型小鼠、shp2和pten雙基因敲除小鼠，，每種小鼠各5只，各小鼠的來源與實(shí)施例2相同。流式細(xì)胞染色的抗體:FITC 偶聯(lián)的 Grl (RB6-8C5)抗體(購自 eBioscience)。紅細(xì)胞裂解液(1.5M NH4Cl, IOOmMNaHCO3, IOmM EDTA 二鈉，ρΗ7.4)。染色液(含2%小牛血清的PBS溶液)。
[0038]實(shí)驗(yàn)方法:
[0039]I)從小鼠眼窩處采血200微升，收集至含EDTA抗凝劑的采血管中。
[0040]2) 5倍體積的紅細(xì)胞裂解液懸浮外周血，室溫放置10分鐘裂解紅細(xì)胞，添加5倍體積的生理鹽水，以3000轉(zhuǎn)/分的速度離心10分鐘后棄上清。
[0041]3)用染色液懸浮細(xì)胞至濃度107/ml，加入抗體至終濃度為2ug/ml，在4°C冰箱中避光孵育30分鐘。
[0042]4)洗滌細(xì)胞兩次。用500微升PBS緩沖液(pH=7.4)重懸細(xì)胞后上機(jī)檢測(cè)。
[0043]實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示，表明小鼠體內(nèi)敲除Shp2能使PTEN缺失小鼠自發(fā)急性粒系白血病動(dòng)物模型中的外周血中用Grl抗體特異標(biāo)記的惡性增殖的粒細(xì)胞數(shù)量明顯下降。
[0044]實(shí)施例4:骨髓中粒細(xì)胞前體細(xì)胞的流式細(xì)胞染色和檢測(cè)
[0045]實(shí)驗(yàn)材料:野生型BL6/C57小鼠、shp2敲除型小鼠、pten敲除型小鼠、shp2和Pten雙基因敲除小鼠，每種小鼠各5只，各小鼠的來源與實(shí)施例2相同。流式細(xì)胞染色的抗體有=FITC偶聯(lián)的Grl (RB6-8C5)抗體，PE偶聯(lián)的Macl (M1/70)抗體(以上抗體都是從eBioscience 訂購的)。紅細(xì)胞裂解液(1.5M NH4Cl, IOOmM NaHCO3, IOmM EDTA二鈉，ρΗ7.4)。染色液(含2%小牛血清的PBS溶液)。8微米細(xì)胞篩(從BD公司購買)
[0046]實(shí)驗(yàn)方法:
[0047]I)斷頭處死小鼠，取出大腿脛骨和腓骨，碾缽碾碎，生理鹽水沖洗出骨髓細(xì)胞，反復(fù)吹打后，用8微米細(xì)胞篩過濾，制作單細(xì)胞懸液，離心棄上清。
[0048]2)紅細(xì)胞裂解液懸浮骨髓細(xì)胞，室溫放置10分鐘裂解紅細(xì)胞，添加5倍體積的生理鹽水，離心棄上清。
[0049]3)用染色液懸浮細(xì)胞至濃度107/ml，加入兩種抗體至每種抗體的終濃度為2ug/ml，于4°C冰箱中避光孵育30分鐘。
[0050]4)洗滌細(xì)胞兩次。用500微升PBS緩沖液(pH=7.4)重懸細(xì)胞后上機(jī)檢測(cè)。
[0051]實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，表明小鼠體內(nèi)敲除Shp2能使PTEN缺失小鼠自發(fā)急性粒系白血病動(dòng)物模型中的骨髓中惡性增值的Grl+Macl+粒細(xì)胞前體細(xì)胞數(shù)量顯著降低。
[0052]實(shí)施例5:骨髓中的粒系/單核系祖細(xì)胞的流式細(xì)胞染色和檢測(cè)
[0053]實(shí)驗(yàn)材料:野生型BL6/C57小鼠、shp2敲除型小鼠、pten敲除型小鼠、shp2和pten雙基因敲除小鼠，每種小鼠各5只，各小鼠的來源與實(shí)施例2相同。流式細(xì)胞染色的抗體有:lineage抗體包括生物素標(biāo)記的抗鼠CD3(145_2C11)、CD45R/B220 (RA3-6B2)、CDllb (Ml/70)、TER-119、Ly-6G (RB6-8C5)、CD4 (L3T4)、CD8 (CD8b, Ly_3)，鏈霉親合素偶聯(lián)的 APC-efluo780 (eBioscience);其他抗體包括抗鼠 FcgR-PE (93)，c-Kit-PE_CY5 (2B8)，Scal-FITC，CD34-APC (以上抗體都是從eBioscience訂購的)。紅細(xì)胞裂解液(1.5M NH4Cl,IOOmM NaHCO3, IOmM EDTA 二鈉，ρΗ7.4)。染色液(含 2% 小牛血清的 PBS 溶液)。[0054]實(shí)驗(yàn)方法:
[0055]I)斷頭處死小鼠，取出大腿脛骨和腓骨，碾缽碾碎，生理鹽水沖洗出骨髓細(xì)胞，反復(fù)吹打后，用8微米細(xì)胞篩過濾，制作單細(xì)胞懸液，離心棄上清。
[0056]2)紅細(xì)胞裂解液懸浮骨髓細(xì)胞，室溫放置10分鐘裂解紅細(xì)胞，添加5倍體積的生理鹽水，離心棄上清。
[0057]3)用染色液懸浮細(xì)胞至濃度107/ml,力卩入lineage、FcgR-PE(93),c-Kit-PE-CY5(2B8), Scal-FITC，CD34-APC)抗體至每種抗體的終濃度為 2ug/ml，在 4°C冰箱中避光孵育30分鐘。
[0058]4)洗滌細(xì)胞兩次。用500微升PBS緩沖液(pH=7.4)重懸細(xì)胞后上機(jī)檢測(cè)。
[0059]5)每管/孔加入100微升稀釋好的鏈霉親合素偶聯(lián)的APC-efluo780(用染色液(含2%小牛血清的PBS(pH=7.4)溶液稀釋成2微克/微升)后，在4°C冰箱中避光孵育30分鐘。洗滌細(xì)胞兩次。之后用500微升PBS緩沖液(pH=7.4)重懸細(xì)胞，并上機(jī)檢測(cè)。
[0060]實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示，表明小鼠體內(nèi)敲除Shp2能使PTEN缺失小鼠自發(fā)急性粒系白血病動(dòng)物模型骨髓中顯著升高的粒系/單核系祖細(xì)胞(Lin—Sca-rKit+FcgRhira34+骨髓細(xì)胞亞群)恢復(fù)到正常對(duì)照組水平。
[0061]實(shí)施例6 蘇木精-伊紅染色(hematoxylin-eosin staining)
[0062]實(shí)驗(yàn)材料:野 生型BL6/C57小鼠、pten敲除型小鼠、shp2敲除型小鼠、shp2和pten雙基因敲除小鼠，每種小鼠各5只，各小鼠的來源與實(shí)施例2相同。
[0063]實(shí)驗(yàn)方法:
[0064](I)斷頭處死小鼠，剖開腹腔，取出脾臟，生理鹽水沖洗，并將其修切成小塊組織；
[0065](2)將組織用4% PFA固定液固定12小時(shí)，用PBS緩沖液洗三次，每次10分鐘；
[0066](3)用石蠟包埋組織；
[0067](4)將包埋后的組織上切片機(jī)切片，用蒸餾水將切片貼于干凈無油的玻片上，在酒精燈上略烤，使切片展平，將貼好的切片于室溫老化3天。
[0068](5)將切片在二甲苯中脫蠟5分鐘，移入二甲苯和純酒精(I: I)混合液中5分鐘，依次移入100%、95%、85%和70%酒精，各級(jí)酒精分別為5分鐘。最后經(jīng)蒸餾水轉(zhuǎn)入染液。
[0069](5)用蘇木精染液染色10分鐘。水洗玻片上的多余染液，1%鹽酸酒精分化液(70%酒精配制)分色片刻。鏡檢控制，直至細(xì)胞核及核內(nèi)染色質(zhì)清晰為止，約數(shù)10秒鐘。流水沖洗15分鐘(或者在碳酸鋰飽和液中短時(shí)間堿化或藍(lán)化，即細(xì)胞核呈藍(lán)色)。蒸餾水短洗。
[0070](6) 0.5%伊紅染液染色5分鐘，若著色困難，可在每100毫升染液中加入2滴冰醋酸，使易著色且不易脫色。
[0071](7)依次經(jīng)70%、85%、95%、100%酒精脫水，各級(jí)酒精脫水2分鐘。
[0072](8)用二甲苯透明(二次)，共約10分鐘。
[0073](9)封片:擦去切片周圍多余的二甲苯，切勿干涸，迅速滴加適量中性樹膠，再加蓋玻片封固。
[0074](10)鏡下觀察拍照。
[0075]實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示，表明PTEN基因敲除小鼠腫瘤細(xì)胞對(duì)脾臟浸潤并破壞正常的脾臟結(jié)構(gòu)。小鼠體內(nèi)敲除Shp2能使PTEN缺失小鼠自發(fā)急性粒系白血病動(dòng)物模型中的脾臟組織學(xué)結(jié)構(gòu)部分恢復(fù)了正常的白髓和紅髓結(jié)構(gòu)。
[0076]實(shí)施例7:氯乙酸酯酶染色(chloroacetate esterase)圖
[0077]實(shí)驗(yàn)材料:野生型BL6/C57小鼠、shp2敲除型小鼠、pten敲除型小鼠、shp2和pten雙基因敲除小鼠，每種小鼠各5只。氯乙酸酯酶染色試劑盒(Sigma公司，Naphthol AS-DChloroacetate (Specific Esterase) Kit,貨號(hào) 91C)。
[0078]實(shí)驗(yàn)方法:
[0079]I)斷頭處死小鼠，剖開腹腔，取出肝臟，生理鹽水沖洗，將其修切成小塊；
[0080]2)將組織用4% PFA固定液固定12小時(shí)，用PBS緩沖液洗三次，每次10分鐘；
[0081]3)按照實(shí)施例6中步驟(3)-(5)的方法用石蠟包埋、切片、脫蠟；
[0082]4)依據(jù)氯乙酸酯酶染色試劑盒的實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行氯乙酸酯酶染色。
[0083]5)按照實(shí)施例6中步驟(7)-(9)中的方法脫水、透明、封片。
[0084]6)鏡下觀察拍照。
[0085]實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7所示，表明PTEN基因敲除小鼠腫瘤細(xì)胞對(duì)肝臟的浸潤，小鼠體內(nèi)敲除Shp2抑制了 PTEN缺失小鼠自發(fā)急性粒系白血病動(dòng)物模型中的粒系腫瘤細(xì)胞對(duì)肝臟的浸潤。
【權(quán)利要求】
1.Shp2蛋白作為急性粒細(xì)胞白血病治療靶標(biāo)在制備治療急性粒細(xì)胞白血病的藥物中的應(yīng)用。
2.一種用于治療急性粒細(xì)胞白血病的藥物，其特征在于，含有能夠抑制Shp2蛋白表達(dá)的組分。
【文檔編號(hào)】A61K45/00GK103893762SQ201410078403
【公開日】2014年7月2日 申請(qǐng)日期:2014年3月5日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月5日
【發(fā)明者】朱鶴 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院