本發(fā)明屬于電化學(xué)免疫傳感器構(gòu)建技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種以三重改性的TiO₂納米線陣列為支架的電化學(xué)免疫傳感器的構(gòu)建方法，該電化學(xué)免疫傳感器可用于檢測癌胚抗原。

背景技術(shù)：
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準(zhǔn)確、靈敏地檢測腫瘤標(biāo)志物對癌癥的篩選、診斷和治療都起著至關(guān)重要的作用。癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）是大腸癌組織產(chǎn)生的一種糖蛋白，是一個廣譜性腫瘤標(biāo)志物，它能向人們反映出多種腫瘤的存在，對大腸癌、乳腺癌和肺癌的療效判斷、病情發(fā)展監(jiān)測和愈后健康評估非常重要, 97%的健康成人血清CEA濃度在2.5 ng mI^-1以下。許多免疫分析法，包括熒光免疫分析、電化學(xué)酶免疫分析、化學(xué)發(fā)光免疫分析、酶聯(lián)免疫吸附法等均被廣泛用于檢測腫瘤標(biāo)記物。在眾多免疫分析法中，電化學(xué)免疫分析法具有快速、有效和靈敏等特點(diǎn)。

隨著納米科學(xué)與技術(shù)的飛速發(fā)展，各種各樣的納米材料，包括碳納米材料、石墨烯、二氧化硅、量子點(diǎn)、貴金屬等被廣泛應(yīng)用于免疫傳感器中以提高其分析性能。在眾多納米材料中，TiO₂納米材料由于其優(yōu)良的化學(xué)穩(wěn)定性、優(yōu)異的生物相容性、比表面積大、機(jī)械性能好、合成方法簡便以及環(huán)境友好性等優(yōu)點(diǎn)吸引了廣泛的關(guān)注。尤其是一維TiO₂納米結(jié)構(gòu)，如TiO₂納米管，被廣泛用于光電化學(xué)和電化學(xué)免疫傳感器。Zhi-Da Gao等人用TiO₂納米管陣列為傳感器支架，用辣根過氧化物酶標(biāo)記的信號抗體-Au納米顆粒作信號探針來檢測免疫球蛋白濃度。由于TiO₂納米管的顯著管狀特征——大的表面積和內(nèi)部空間，此免疫傳感器與其他普通平板電極相比，性能得到有效增強(qiáng)。其對兔免疫球蛋白的濃度線性范圍為0.1—10⁵ ng mL^-1，檢測限為0.01 ng mL^-1。

盡管有大量的研究關(guān)注TiO₂納米線陣列的光電化學(xué)性能，但可能由于其導(dǎo)電性較差、比表面積相對較小的缺點(diǎn)，限制了電子轉(zhuǎn)移和生物分子的負(fù)載量，因而很少有人將其用于電化學(xué)傳感器的制備。值得注意的是，據(jù)報(bào)道，化學(xué)摻雜金屬離子作為一種高效的方法可以促進(jìn)TiO₂等半導(dǎo)體納米材料的電荷分離和導(dǎo)電性。例如 Wang等人通過水熱法制備了W摻雜的TiO₂核-殼納米線陣列。在刻蝕/再生長過程中，W元素被摻雜入TiO₂殼內(nèi)以提高其光電性能。而且電化學(xué)阻抗結(jié)果還表明W摻雜后，TiO₂納米線陣列導(dǎo)電性顯著增強(qiáng)。

石墨烯在不同領(lǐng)域的成功應(yīng)用激發(fā)起了制備類似納米材料的研究興趣。據(jù)報(bào)道，MoS₂包含一個Mo金屬層和兩個S層，Mo金屬層通過范德華力夾在兩個S層之間。由于其獨(dú)特的幾何結(jié)構(gòu)，MoS₂成為典型的石墨烯類似物之一。重要的是，MoS₂具有與石墨烯近似的優(yōu)良性能，如優(yōu)異的電子性能、特殊的光學(xué)特性、優(yōu)良的機(jī)械性能以及表面易修飾特點(diǎn)。盡管MoS₂在很多領(lǐng)域如晶體管、燃料電池、儲能等都得到了廣泛應(yīng)用，但其在電化學(xué)傳感器方面的應(yīng)用還很有限。Vasilescu等人制備了一種由MoS₂和石墨烯量子點(diǎn)構(gòu)成的納米材料用于負(fù)載酶分子。碳基絲網(wǎng)印刷電極的導(dǎo)電性在修飾MoS₂-石墨烯量子點(diǎn)后大大增強(qiáng)，同時也為漆酶提供了一個生物相容性支架。該漆酶生物傳感器對咖啡酸在濃度范圍0.38-100 uM內(nèi)有很好的響應(yīng)，其檢測限為0.32μM，靈敏度為17.92 nA uM^-1。

BS³是一種雙氨基交聯(lián)劑，具有水溶性、非裂解性、膜不滲透性等特點(diǎn)，它含有一個末端氨基反應(yīng)基團(tuán)（Sulfo-NHS酯基），可與任何含有伯胺基團(tuán)的分子反應(yīng)。因此，其廣泛應(yīng)用于生物分子的交聯(lián)。

本發(fā)明通過兩步水熱反應(yīng)制備了三重修飾的TiO₂納米線陣列。具體來說，第一步水熱反應(yīng)制備出TiO₂納米線陣列；第二步實(shí)現(xiàn)了同時“刻蝕、摻雜和沉積”，MoS₂片沉積在刻蝕/摻雜過的TiO₂納米線陣列表面。然后將殼聚糖溶液滴加在改性后的TiO₂納米線陣列表面，以BS³為氨基交聯(lián)劑將捕獲抗體Ab1共價結(jié)合在其表面。水熱法還被用于制備圓柱形TiO₂納米柱，BS³也被用于結(jié)合HRP和信號抗體以制備示蹤標(biāo)記物。三重改性后的TiO₂納米線陣列的多項(xiàng)性能得到顯著提高，并被用作一種新型免疫傳感器平臺支架。其優(yōu)點(diǎn)包括：首先，刻蝕加上Mo摻雜有助于促進(jìn)電子轉(zhuǎn)移，增強(qiáng)導(dǎo)電性；另外，二維薄層MoS₂片的沉積不僅能增強(qiáng)導(dǎo)電性，而且能增強(qiáng)電極比表面積，有助于吸附更多的生物分子。因而本發(fā)明所制備的新型免疫傳感器支架具有優(yōu)良的導(dǎo)電性，大的比表面積，有助于提高檢測范圍與靈敏度，目前還未見有相關(guān)報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
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本發(fā)明目的在于研制一種以三重改性的TiO₂納米線陣列為支架的電化學(xué)免疫傳感器的構(gòu)建方法，該電化學(xué)免疫傳感器能夠快速地測定癌胚抗原，且靈敏度較高、線性范圍較大、檢測限較低。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種以三重改性的TiO₂納米線陣列為支架的電化學(xué)免疫傳感器的構(gòu)建方法，其包括如下步驟：

①三重改性的TiO₂納米線陣列的制備：

TiO₂納米線陣列的制備：將13 mL 濃HCl用15 mL 去離子水稀釋，室溫下攪拌5 min，加入300μL鈦酸丁酯后，繼續(xù)攪拌15 min以得到澄清溶液；將所得澄清溶液與干凈的FTO基片一起轉(zhuǎn)移至反應(yīng)釜內(nèi)，在150℃下反應(yīng)12 h；冷卻至室溫，取出FTO基片，用去離子水洗滌并在N₂流下烘干，F(xiàn)TO基片上均勻覆蓋一層白色薄膜，即為TiO₂納米線陣列；

TiO₂納米線陣列的同時“刻蝕、摻雜和沉積”：將30 mL超純水、0.01 M 鹽酸羥胺、 0.005 M 九水硫化鈉、0.002 M二水鉬酸鈉、50μL聚乙二醇與上述制備得到的TiO₂納米線陣列一起置于反應(yīng)釜內(nèi)，250℃下反應(yīng)24 h，冷卻至室溫，取出FTO基片，用去離子水洗滌并在N₂流下烘干；觀察到所得TiO₂納米線陣列上覆蓋有一層黑色沉積物，即為MoS₂納米片，該FTO基片記為改性的FTO電極；

②信號抗體標(biāo)記物的制備：

TiO₂納米柱的制備：將1.8 mL四氯化鈦緩慢加入到含19 mL超純水的燒杯中，冰水浴0-5℃下攪拌10 min獲得白色懸浮液；再加入1.8 mL氯仿，繼續(xù)攪拌10 min，然后轉(zhuǎn)入反應(yīng)釜內(nèi)，160℃反應(yīng)12h，冷卻至室溫，離心收集白色沉淀并洗滌至中性，然后60℃真空干燥12 h，即得TiO₂納米柱，室溫下儲存?zhèn)溆茫?/p>

TiO₂納米柱的氨基化：將100 mg TiO₂納米柱置于含20 mL乙醇、1 mL 28%氨水和4 mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷的混合液中，室溫下攪拌12h以防止TiO₂納米柱沉降，然后離心分離，棄去上清液，所得白色沉淀物洗滌、干燥后，室溫下儲存?zhèn)溆?，記為NH₂-TiO₂納米柱；

辣根過氧化物酶︱氨基化TiO₂納米柱︱信號抗體Ab2生物共軛體的制備：將2 mg BS³溶解在1 mL PBS緩沖液中獲得溶液A，然后將3 mg NH₂-TiO₂納米柱分散于溶液A中，攪拌下加入300μL 2 mg·mL^-1的辣根過氧化物酶水溶液并在室溫下孵育30 min；然后加入20μL含0.5 mg·mL^-1信號抗體Ab2的PBS緩沖液，4℃下攪拌8 h，離心分離，所得沉淀物用PBS緩沖液洗滌并用含2%牛血清蛋白的PBS緩沖液在室溫下封閉30 min，最后用PBS緩沖液洗滌后，分散于1.0 mL含0.1% 牛血清蛋白的PBS緩沖液中，備用，記為HRP︱NH₂- TiO₂納米柱︱Ab2；

②免疫傳感器的構(gòu)建：

首先，將30μL 0.3 wt% 的殼聚糖醋酸溶液滴加在改性的FTO電極表面，室溫下自然晾干，然后滴加30μL含2 mg·mL^-1 BS³的PBS緩沖液并在室溫下孵育1 h，然后再滴加30μL 0.38 mg·mL^-1 的捕獲抗體Ab1，室溫下孵育1 h，再在4℃、100%濕度飽和環(huán)境下孵育12h后，分別用洗滌緩沖液和PBS緩沖液洗滌，再用20μL封閉緩沖液孵育30 min，最后分別用洗滌緩沖液和PBS緩沖液洗滌3 min，4℃下儲存?zhèn)溆谩?/p>

具體的，步驟③中，所述洗滌緩沖液為：含0.05 %（w/v）Tween 20的PBS緩沖液（0.05 M，pH 7.0）；所述封閉緩沖液為：含5 %（w/v）牛血清蛋白（BSA）的PBS緩沖液（0.05 M，pH 7.0）。

和現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明方法的有益效果：

通過水熱法制備了TiO₂納米線陣列，然后采用同時“刻蝕、摻雜和沉積”技術(shù)對其進(jìn)行三重改性，在此改性過程中，Mo元素被成功摻雜入TiO₂納米線陣列，能有效提高電子傳遞速率；同時，二維薄層MoS₂片被成功沉積于電極表面，不僅能增強(qiáng)導(dǎo)電性，還極大地提高了電極比表面積，有助于負(fù)載更多量的生物分子，從而提高該傳感器的靈敏度。

附圖說明：

圖1為TiO₂納米線陣列、TiO₂納米柱的SEM圖和TEM圖，其中A和B分別為純TiO₂納米線陣列的SEM平面圖和截面圖；C和D分別為不同放大倍數(shù)的三重改性后的TiO₂納米線陣列SEM平面圖；E和F分別為TiO₂納米柱的SEM圖和TEM圖；

圖2為不同材料的XRD圖譜，其中a為FTO基片; b為純TiO₂納米線陣列；c為在王水中浸泡24 h后除去表面MoS₂后的只刻蝕/摻雜的TiO₂納米線陣列；d為三重改性后的TiO₂納米線陣列；

圖3為奈奎斯特圖，其中a為裸FTO基片；b為三重改性后的TiO₂納米線陣列；c為三重改性后的TiO₂納米線陣列︱殼聚糖︱BS³︱Ab1；d為三重改性后的TiO₂納米線陣列︱殼聚糖︱BS³︱Ab1︱BSA；e為三重改性后的TiO₂納米線陣列︱殼聚糖︱BS³︱Ab1︱BSA︱CEA︱標(biāo)記的Ab2；f為純TiO₂納米線陣列修飾的FTO基片；

圖4為測試溶液的pH值對本發(fā)明免疫傳感器電流響應(yīng)的影響；

圖5為CEA在電極表面培育時間對免疫傳感器電流響應(yīng)的影響；

圖6為捕獲抗體Ab1濃度的優(yōu)化；

圖7為不同干擾物對CEA測定的干擾；

圖8為還原電流隨CEA濃度增加的變化曲線。

具體實(shí)施方式：

以下結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步地詳細(xì)介紹，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此。

下述實(shí)施例中，所用到的BS³購自西格瑪奧德里奇有限公司，捕獲抗體Ab1、信號抗體Ab2均購自成都雙流正龍生化制品研究室。

實(shí)施例1：

一種以三重改性的TiO₂納米線陣列為支架的電化學(xué)免疫傳感器的構(gòu)建方法，其包括如下步驟：

①三重改性的TiO₂納米線陣列的制備：

TiO₂納米線陣列的制備：

合成前，先將幾片F(xiàn)TO基片依次用丙酮、乙醇和超純水洗滌，在N₂流下烘干備用。將13 mL 濃HCl (37 wt %)用15 mL去離子水稀釋，室溫下攪拌5 min。然后加入300μL鈦酸丁酯，繼續(xù)攪拌15 min以得到澄清溶液。將所得澄清溶液與上述洗滌干凈的FTO基片一起轉(zhuǎn)移至50 mL聚四氟乙烯內(nèi)襯的高壓反應(yīng)釜內(nèi)，在150℃下反應(yīng)12 h。冷卻至室溫，取出FTO基片，用去離子水洗滌并在N₂流下烘干。FTO基片上均勻覆蓋有一層白色薄膜，后被多種方法證明即為TiO₂納米線陣列。

TiO₂納米線陣列的同時“刻蝕、摻雜和沉積”：將30 mL超純水、0.01 M 鹽酸羥胺、0.005 M九水硫化鈉、0.002 M二水鉬酸鈉、50μL聚乙二醇與上述所制備得到的TiO₂納米線陣列一起置于50 mL聚四氟乙烯內(nèi)襯的高壓反應(yīng)釜內(nèi)，250℃下反應(yīng)24 h，冷卻至室溫，取出FTO基片，用去離子水洗滌并在N₂流下烘干。觀察到所得TiO₂納米線陣列上覆蓋有一層黑色沉積物，后被多種方法證明即為MoS₂納米片，該FTO基片記為改性的FTO電極。

②信號抗體Ab2標(biāo)記物的制備：

TiO₂納米柱的制備：將1.8 mL 四氯化鈦緩慢加入到含19 mL超純水的燒杯中，冰水浴0-5℃下強(qiáng)力攪拌10 min獲得白色懸浮液；再加入1.8 mL 氯仿，繼續(xù)攪拌10 min，然后轉(zhuǎn)入聚四氟乙烯內(nèi)襯的高壓反應(yīng)釜內(nèi)，160℃ 反應(yīng)12 h。冷卻至室溫，離心收集白色沉淀，分別用去離子水和無水乙醇洗滌至中性，然后60℃真空干燥12 h，即得TiO₂納米柱，室溫下儲存?zhèn)溆谩?/p>

TiO₂納米柱的氨基化：將100 mg TiO₂納米柱置于含20 mL乙醇、1 mL 28%氨水和4 mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷的混合液中，室溫下攪拌過夜（12h）以防止TiO₂納米柱沉降。然后離心分離，棄去上清液，所得白色沉淀物洗滌、干燥后，室溫下儲存?zhèn)溆?，記為NH₂-TiO₂納米柱。

辣根過氧化物酶︱氨基化TiO₂納米柱︱信號抗體Ab2生物共軛體的制備：將2 mg BS³溶解在1 mL的磷酸鹽（PBS，0.02 M）緩沖液中獲得溶液A，然后將3 mg NH₂-TiO₂納米柱分散于溶液A中，攪拌下加入300μL 2 mg·mL^-1的辣根過氧化物酶水溶液并在室溫下孵育30 min。然后加入20μL含0.5 mg·mL^-1信號抗體Ab2的PBS緩沖液，4℃下攪拌8 h，離心分離，所得沉淀物用PBS緩沖液洗滌并用含2%牛血清蛋白的PBS緩沖液在室溫下封閉30 min。最后用PBS緩沖液洗滌后，分散于1.0 mL含0.1%牛血清蛋白的PBS緩沖液中，備用，記為HRP︱NH₂- TiO₂納米柱︱Ab2。

③免疫傳感器的構(gòu)建：

首先，將30μL 0.3 wt% 的殼聚糖醋酸溶液滴加在改性的FTO電極表面，室溫下自然晾干，然后滴加30μL含2 mg·mL^-1 BS³的PBS緩沖液并在室溫下孵育1 h，然后再滴加30μL 0.38 mg·mL^-1 的捕獲抗體Ab1，室溫下孵育1 h，再在4℃、100%濕度飽和環(huán)境下孵育過夜（12h）后，分別用洗滌緩沖液和PBS緩沖液洗滌，再用20μL封閉緩沖液孵育30 min，最后分別用洗滌緩沖液和PBS緩沖液洗滌3 min，4℃下儲存?zhèn)溆谩?/p>

步驟③中，所述洗滌緩沖液為：含0.05 %（w/v）Tween 20的PBS緩沖液（0.05 M，pH 7.0）；所述封閉緩沖液為：含5 %（w/v）牛血清蛋白（BSA）的PBS緩沖液（0.05 M，pH 7.0）。

④測試過程：

為進(jìn)行免疫反應(yīng)和電化學(xué)測試，上述制備所得的電化學(xué)免疫傳感器先用30μL不同濃度的CEA稀釋液或血清樣品在室溫下孵育50 min，然后分別用洗滌緩沖液和PBS緩沖液洗滌1.5 min。再用30μL步驟②所得產(chǎn)物HRP︱NH₂-TiO₂納米柱︱Ab2在室溫下孵育60 min，并分別用洗滌緩沖液和PBS緩沖液洗滌3 min。隨后，將該電化學(xué)免疫傳感器、參比電極、對電極置于含5 mL PBS緩沖液的電化學(xué)電池中，接著將氫醌（終濃度2 mM）和過氧化氫（終濃度1 mM）注入此電池中，在加入過氧化氫前后分別在-0.2 V下進(jìn)行時間-電流曲線掃描，以定量測定CEA。

SEM和TEM均用于表征TiO₂納米線陣列和TiO₂納米柱的形貌。如圖1所示，純TiO₂納米線陣列的SEM平面圖（A）和SEM截面圖（B）均表明水熱反應(yīng)后，F(xiàn)TO表面的白色薄膜是致密、垂直排列的納米線陣列，它們擁有矩形橫截面，其平均直徑和長度分別約為150-180 nm和1.5-2μm。同時“刻蝕、摻雜、沉積”改性后，TiO₂納米線陣列表面覆蓋了一層黑色沉積物，如SEM圖（C），（D）所示，它們呈蜂窩型層狀結(jié)構(gòu)，其表面積很大，有助于進(jìn)一步負(fù)載大量的生物分子。SEM和TEM圖還用于表征所制備的TiO₂納米柱，如SEM圖（E），TEM圖（F）所示，所有TiO₂納米柱為圓柱形結(jié)構(gòu)，其平均直徑約為20 nm, 平均長度約為180 nm，這有助于生物分子的負(fù)載。

為表征TiO₂納米線陣列改性前后的晶型結(jié)構(gòu)及組成，圖2展示了它們的XRD圖。圖2 a展示了FTO基片的衍射峰并用星號標(biāo)記以方便比較。圖2 b為純TiO₂納米線陣列的XRD圖，其中在36.1°和 62.7°處的兩個特征衍射峰分別對應(yīng)四方金紅石型TiO₂的 (101) 和 (002) 晶面。三重改性后，如圖2 d所示, TiO₂納米線陣列表面沉積的MoS₂在14.5°、33.8° 和 59.5°處出現(xiàn)了三個明顯的特征衍射峰，分別對應(yīng)MoS₂的 (002)、(100) 和 (110) 晶面。在王水中浸泡除去表面MoS₂后，該刻蝕/摻雜的TiO₂納米線陣列的XRD圖譜（圖2 c）與純TiO₂納米線陣列（圖2 b）有相似的衍射峰。與純TiO₂納米線陣列相比，所有衍射峰無明顯偏移。

電化學(xué)阻抗（EIS）法監(jiān)測免疫傳感器的組裝過程：

作為評估動力學(xué)過程和修飾電極界面性能的有效工具，電化學(xué)阻抗被用來監(jiān)測本發(fā)明實(shí)施例1所制備用以檢測CEA的電化學(xué)免疫傳感器的組裝過程。

阻抗實(shí)驗(yàn)是在含有0.1 M KCl電解質(zhì)的5 mM K₃[Fe︱CN)₆]︱K₄[Fe(CN)₆]溶液中進(jìn)行, 所施加直流電壓為0.230 V，上面疊加5 mV的交流電壓。阻抗實(shí)驗(yàn)都是在100 KHz～100 mHz頻率范圍內(nèi)記錄奈奎斯特圖。圖3中的所有奈奎斯特圖在高頻區(qū)均包含一個半圓，它對應(yīng)電子轉(zhuǎn)移阻力（R_et）；在低頻區(qū)呈現(xiàn)出一個直線部分，它對應(yīng)擴(kuò)散控制過程。半圓直徑與修飾電極表面的鐵氰化鉀電子傳遞系數(shù)成反比，這為我們判斷材料導(dǎo)電性提供了一個視覺判斷標(biāo)準(zhǔn)。如圖3所示，裸FTO電極（曲線a）呈現(xiàn)出一個很小的半圓，代表表面電阻很小，屬于擴(kuò)散控制過程。與此相反，純TiO₂納米線陣列（曲線f）半徑最大，表明TiO₂導(dǎo)電性較差。但是，同時“刻蝕、摻雜、沉積”改性后，TiO₂納米線陣列（曲線b）明顯減小，表明同時Mo-摻雜和MoS₂沉積大大增強(qiáng)了TiO₂納米線陣列的導(dǎo)電性。在曲線c-e中，三重改性TiO₂納米線陣列電極依次被修飾上Ab1、BSA、和標(biāo)記信號抗體Ab2，從圖中可以看出，伴隨著逐步修飾過程，半圓直徑逐漸增加，這主要是由于蛋白質(zhì)的低導(dǎo)電性和位阻效應(yīng)，阻礙了電化學(xué)探針向電極表面的電子傳遞，同時也表明了各種材料被層層組裝于電極表面。

電化學(xué)免疫傳感器檢測條件的優(yōu)化:

測試溶液的pH值是影響酶傳感器性能的一個重要因素，因?yàn)閺?qiáng)酸和強(qiáng)堿環(huán)境均會破壞生物分子的活性。溶液pH對免疫傳感器電流響應(yīng)的影響如圖4所示。電流響應(yīng)值在pH 5.0-7.0范圍內(nèi)隨著pH值的增加而快速增加，當(dāng)pH超過7.0后，開始減小。因此，含0.10 M KCl的0.05 M PBS（pH 7.0）緩沖液被選作檢測液用于檢測AFP。

CEA在免疫傳感器表面的培育時間是影響免疫傳感器分析性能的另一個重要因素。在室溫下，CEA免疫傳感器的電流響應(yīng)值隨AFP培育時間的增加而顯著增加，超過50 min后基本達(dá)到一個恒定值（如圖5所示），這表明AFP與電極表面的捕獲抗體Ab1的結(jié)合達(dá)到飽和。因此，將50 min選作此夾心型免疫分析的培育時間。

電極表面的捕獲抗體Ab1濃度也進(jìn)行了優(yōu)化，如圖6所示，剛開始CEA免疫傳感器的電流響應(yīng)值隨Ab1濃度的增加而顯著增加，當(dāng)Ab1濃度超過0.38 mg mL^-1后，電流響應(yīng)值基本不變，甚至還略有減小，說明0.38 mg mL^-1為Ab1濃度飽和值，超過后無法負(fù)載于電極表面，因此0.38 mg mL^-1選定為捕獲抗體Ab1的最佳濃度值。

定量檢測CEA:

基于特異性夾心型免疫反應(yīng)和H₂O₂為媒介的HRP催化反應(yīng)，如下兩反應(yīng)式所示：

苯醌 + 2H⁺ + 2e^? → 氫醌。

該CEA免疫傳感器在優(yōu)化條件下被用于定量檢測CEA，如圖7所示，加入H₂O₂后，該傳感器電流迅速達(dá)到穩(wěn)定，還原峰電流隨CEA濃度的增加而增加。校準(zhǔn)曲線（圖7中的插圖）顯示峰電流與分析物濃度之間有良好的線性關(guān)系，線性范圍為0.001 ng/mL 至 150 ng/mL，相關(guān)系數(shù)為0.996(n=4).在信噪比為3的條件下，CEA的檢測限低至0.5 pg/mL，這比很多報(bào)道的免疫傳感器均低。

重現(xiàn)性、選擇性、穩(wěn)定性測試：

為了探究此免疫傳感器的準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性，本發(fā)明在相同條件下分別制備4根電極，在相同條件下進(jìn)行分析測試，所得結(jié)果相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為 5.6 %，表明此免疫傳感器具有良好的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性。

為評估該免疫傳感器的特異性，本發(fā)明引入了幾種可能的干擾物，包括α-甲胎蛋白（AFP）, 前列腺癌蛋白抗原（PSA），腫瘤抗原125（CA125），免疫球蛋白G（IgG）和牛血清蛋白（BSA）。此免疫傳感器分別用含有上述其中一種干擾物（100 ng·mL^-1）的1 ng·mL^-1 CEA孵育。如圖8所示，其中A為純CEA不含干擾物，B，C，D，E，F(xiàn)分別為CEA與AFP，PSA，CA125，IgG，BSA的混合物。沒有干擾物相比，由干擾物引起的電流變化小于5.2 %，這表明此免疫傳感器具有良好的選擇性。

此外，此免疫傳感器的穩(wěn)定性也通過測量它們在4℃條件下儲存2周前后的電流響應(yīng)進(jìn)行了評估。結(jié)果表明，2周后90.7 %的電流響應(yīng)得以保留，這表明此免疫傳感器具有良好的穩(wěn)定性。