用于急性早幼粒細(xì)胞白血病熒光檢測的納米探針及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種用于急性早幼粒細(xì)胞白血病熒光檢測的納米探針及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]急性早幼粒細(xì)胞白血病(APL)是急性髓細(xì)胞白血病的一種特殊類型,約占成人急性髓細(xì)胞白血病的10%,絕大多數(shù)的APL患者存在典型的t (15; 17) (q22;q21)染色體異位,陽性率約占98%,維A酸受體α基因(RARa)與15號染色體的早幼粒細(xì)胞白血病(PML)基因形成PML-RARa融合基因,該融合基因的下游蛋白分子復(fù)合物為轉(zhuǎn)錄共抑制分子,通過抑制基因轉(zhuǎn)錄從而抑制細(xì)胞的分化與凋亡,這是APL的特異性標(biāo)志和靶向治療的重要分子基礎(chǔ),它不僅能夠幫助APL的診斷,而且可以作為APL治療過程中病情和療效檢測的主要指標(biāo)。所以,PML/RARa融合基因的檢測在APL的診斷和治療過程中發(fā)揮著重要的作用。
[0003]PML/RARa融合基因的檢測一直是細(xì)胞遺傳學(xué)和分子生物學(xué)研宄領(lǐng)域的重點和熱點之一,目前常用的檢測方法主要有:染色體分析、熒光原位雜交(FISH)、流式細(xì)胞術(shù)(FCM)、實時定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)等。盡管染色體分析法可以在結(jié)構(gòu)和數(shù)量上分析單個細(xì)胞染色體的異常,但是卻要花費較長的時間和精力,從而降低了檢測效率。熒光原位雜交是非放射性檢測體系,熒光試劑和探針經(jīng)濟(jì)、安全、穩(wěn)定,而且靈敏度高,但是,不能達(dá)到100%雜交,特別是在應(yīng)用較短的互補DNA探針時效率明顯下降。雖然流式細(xì)胞術(shù)可以高速分析術(shù)上萬個細(xì)胞,但是,僅限于在細(xì)胞水平上識別細(xì)胞的形貌、尺寸以及熒光性質(zhì)等。RT-PCR法具有很高的靈敏度,但常常會出現(xiàn)假陽性和假陰性結(jié)果,此外,該方法難以定量。因此,開發(fā)高靈敏度、高選擇性,背景影響小的可用于PML/RARa融合基因熒光檢測的納米探針具有重要的理論意義及現(xiàn)實的應(yīng)用價值。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0004]本發(fā)明的目的之一在于針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足,提供一種用于急性早幼粒細(xì)胞白血病熒光檢測的納米探針,從而實現(xiàn)對PML/RARa融合基因的檢測。
[0005]本發(fā)明的目的之二在于提供該納米探針的制備方法。
[0006]為實現(xiàn)上述目的,本發(fā)明所提供的技術(shù)方案是:
一種用于急性早幼粒細(xì)胞白血病熒光檢測的納米探針,其特征在于該納米探針由能量給體和能量受體組成,所述的能量給體和能量受體通過JT-JT鍵相互作用結(jié)合在一起;所述的能量給體是一端帶有氨基的探針DNA通過共價鍵鍵合的方式嫁接到表面羧基化后的具有核殼結(jié)構(gòu)的上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米晶上而形成的,所述的能量給體與能量受體的質(zhì)量比為20:1~24:1 ;所述的能量受體為:單壁碳納米角、氧化石墨烯或碳納米管;所述的具有核殼結(jié)構(gòu)的上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米晶的表面羧基化率為:30%~60% ;所述的探針DNA為:5’ -NH2-TCTCAA TGG CTG CCT CCC-3’ ;所述的帶有氨基的探針DNA與所述的上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米晶的摩爾比為:1:2000~1:2500 ο
[0007]上述的具有核殼結(jié)構(gòu)的上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米晶為:NaYF4:Yb,EriNaYF4, NaYF4:Yb, EriNaYF4: Yb, Er、NaYF4: Yb, Er觀&6(^4或 NaYF 4:Yb:Er觀aGdF4:Yb, Er。
[0008]一種制備上述的用于急性早幼粒細(xì)胞白血病熒光檢測的方法,其特征在于該方法的具體步驟為:
a.通過配體交換法將具有核殼結(jié)構(gòu)的上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米晶表面修飾上羧基,得到Cit-UCNPs ;將該Cit-UCNPs經(jīng)N-羥基琥珀酰亞胺和1_(3_ 二甲氨基丙基)_3_乙基碳二亞胺活化,得到活化后的Cit-UCNPs ;
b.將步驟a所得活化后的Cit-UCNPs與探針DNADNA分子按照質(zhì)量比260:1~290:1的比例溶于去離子水中,4°C攪拌10~12小時;經(jīng)分離提純得到能量給體即Cit-UCNPs-ssDNA ;
c.將步驟b所得能量給體與能量受體按照質(zhì)量比為20:1~24:1的比例溶于去離子水中,4°C攪拌1~2小時,最終得到急性早幼粒細(xì)胞白血病熒光檢測的納米探針。
[0009]上述的步驟a的具體方法為:
(1)將具有核殼結(jié)構(gòu)的上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米晶分散在甲苯和氯仿的混合溶劑中,其中,甲苯和氯仿的體積比為1:2~2:3 ;上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米晶與混合溶劑的質(zhì)量體積比為:lmg/mL~3mg/mL ;
(2)惰性氣氛下,將無水檸檬酸鈉溶于二乙二醇中配制成濃度為0.1388M-0.1735M的溶液,在100°C ~120°C下保持30~40min,冷卻;
(3)將步驟(I)所得納米晶溶液慢慢滴加到步驟(2)所得到的溶液中,加熱至130°C,保持40~50min,蒸發(fā)除掉甲苯、氯仿,加熱至180°C,氬氣環(huán)境下,保持1~2小時,冷卻、離心,用乙醇和水洗滌,即制得水溶性的Cit-UCNPs納米晶。
[0010](4)將N-羥基琥珀酰亞胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺按照質(zhì)量比1:1-3:1加入到l~3mL去離子水中,然后加入步驟(3)所得Cit-UCNPs納米晶,4°C攪拌2~4小時,將所得到的混合物離心,用去離子水洗滌3次,得到活化的Cit-UCNPs納米晶;
(5)將步驟(4)得到的Cit-UCNPs納米晶與探針DNA分子按照質(zhì)量比260:1~290:1的比例溶于去離子水中,4°C攪拌10~12小時;將所得到的混合物離心,用去離子水洗3次后得到能量給體即Cit-UCNPs-ssDNA。
[0011]本發(fā)明的優(yōu)點在于:以稀土上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米晶作為能量給體構(gòu)筑納米探針,其激發(fā)光源位于近紅外光區(qū)的980nm,有效避免了高能量光的光損傷及生物背景熒光強的缺點。其次,所合成的納米探針具有良好生物相容性及低的生物毒性,可實現(xiàn)融合基因的檢測。另夕卜,本發(fā)明方法所制備的納米探針粒徑均一、形貌良好、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,且實驗條件溫和,重復(fù)率尚O
【附圖說明】
[0012]圖1 是本發(fā)明實施例1 中 UCNPs(A) ;CS_UCNPs(B);Cit-UCNPs(C) ; Cit-UCNPs-ssDNA (D)的 TEM 圖。
[0013]圖2為本發(fā)明實施例2中納米探針Cit-UCNPs-ssDNA-SWCNHs中加入不同濃度的目標(biāo)DNA后在980nm激發(fā)光照射下的上轉(zhuǎn)換熒光光譜圖。
[0014]圖3為本發(fā)明實施例2中納米探針Cit-UCNPs-ssDNA-GO中加入不同濃度的目標(biāo)DNA后在980nm激發(fā)光照射下的上轉(zhuǎn)換熒光光譜圖。
[0015]圖4是本發(fā)明實施例3中納米探針Cit-UCNPs-ssDNA-SWCNHs加入不同濃度單堿基錯配DNA后在980nm激發(fā)光照射下的上轉(zhuǎn)換熒光光譜圖。
[0016]圖5為本發(fā)明實施例3中納米探針Cit-UCNPs-ssDNA-SWCNHs加入不同濃度非互補DNA后在980nm激發(fā)光照射下的上轉(zhuǎn)換熒光光譜圖。
[0017]圖6為本發(fā)明實施例3中納米探針Cit-UCNPs-ssDNA-GO加入不同濃度單堿基錯配DNA后在980nm激發(fā)光照射下的上轉(zhuǎn)換熒光光譜圖。
[0018]圖7為本發(fā)明實施例3中納米探針Cit-UCNPs-ssDNA-SWCNHs加入不同濃度非互補DNA后在980nm激發(fā)光照射下的上轉(zhuǎn)換熒光光譜圖。
【具體實施方式】
[0019]為使本發(fā)明更加容易理解,下面將結(jié)合附圖和實施例來詳細(xì)說明。這些實施例僅起說明性作用,并不局限于本發(fā)明的應(yīng)用范圍。
[0020]具有核殼結(jié)構(gòu)的上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米晶的制備方法請參見文獻(xiàn):
Li, Z.; Zhang, Y., An efficient and user-friendly method for the synthesisof hexagonal-phase NaYF4:Yb, Er/Tm nanocrystals with controllable shape andupconvers1n fluorescence.Nanotechnology 2008, 19 (34),345606.實施例1:
本實施例提供一例納米探針Cit-UCNPs-ssDNA-SWCNHs的合成,其包括以下步驟:
(1)利用溶劑熱法合成具有核殼結(jié)構(gòu)的上轉(zhuǎn)換納米晶即CS-UCNPs,并分散到環(huán)己烷溶液中,即制得核殼結(jié)構(gòu)的上轉(zhuǎn)換納米晶;
(2)利用配體交換法將核殼結(jié)構(gòu)的上轉(zhuǎn)換納米晶從環(huán)己烷溶液中轉(zhuǎn)移到水相中,得到良好水溶性的上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米晶,此時,納米晶表面含有羧基,即制得Cit-UCNPs ;
(3)將表面含有羧基的上轉(zhuǎn)換納米晶即Cit-UCNPs與一端帶有氨基的探針DNA進(jìn)行反應(yīng),通過共價鍵鍵合的方式結(jié)合在一起,作為能量給體,即制得Cit-UCNPs-ssDNA ;
(4)將Cit-UCNPs-ssDNA與購買的單壁碳納米角通過π-π相互作用結(jié)合在一起,構(gòu)筑含一對能量給體與能量受體,并可有效發(fā)生能量傳遞的納米探針,即制備Cit-UCNPs-ssDNA-SWCNHs 納米探針。
[0021]所述步驟(I)具體包括以下步驟:
(1.1)利用溶劑熱法制備上換納米晶NaYF4: Yb,Er,并分散在環(huán)己烷溶液中;
(1.2)使用上述納米晶,利用溶劑熱法合成具有核殼結(jié)構(gòu)的CS-UCNPs上轉(zhuǎn)換納米晶,其中納米粒子的殼層材料為六方相NaYF4,殼層的厚度約為2.5nm。
[0022]所述步驟(2)具體包括以下步驟:
(2.1)預(yù)備 8~10mgCS-UCNPs、3~5mL 甲苯、3~5mL 氯仿、15~20mL 二乙二醇、0.4-0.6g 無水檸檬酸鈉;
(2.2)將預(yù)備的核殼結(jié)構(gòu)的上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米晶分散在預(yù)備的5mL甲苯和氯仿的混合溶液中,其中,甲苯和氯仿的體積比為1:2~2:3 ;
(2.3)將預(yù)備的無水檸檬酸鈉溶于15mL 二乙二醇中,氬氣環(huán)境下,加熱至110°C,并保持 30~40min,冷卻; (2.4)將步驟(2.2)所得納米晶慢慢滴加到步驟(2.3)所得到的溶液中,加熱至1300C,保持40~50min,蒸發(fā)除掉甲苯、氯仿,加熱至180°C,氬氣環(huán)境下,保持1~2小時,冷卻、離心,用乙醇和水洗滌,即制得Cit-UCNPs納米晶。
[0023]所述步驟(3)具體包括以下步驟:
(3.1)預(yù)備上述步驟(2.4)制備的Cit-UCNPs納米晶3~4mg、3~4mg N-輕基琥泊酰亞胺,即NHS、2~3mg 1- (3- 二甲氛基丙基)_3~乙基碳二亞胺,即EDC、20~30 μ L,100 μ M探針DNA分子、l~3mL去離子水;
(3.2)將預(yù)備的NHS以及EDC按照質(zhì)量比1:1-3:1加入到l~3mL去離子水中,然后加入預(yù)制備的Cit-UCNPs納米晶,4°C攪拌2~4小時,將所得到的混合物離心,用去離子水洗滌3次,得到活化的Cit-UCNPs納米晶;
(3.3)將上述步驟得到的混合物與探針DNA分子按照質(zhì)量比260:1~290:1的比例溶于去離子水中,4°C攪拌10~12小時;將所得到的混合物離心,用去離子水洗3次后得到能量給體即 Cit-UCNPs-ssDNA。
[0024]所述步驟(4)具體包括以下步驟:
(4.1)預(yù)備上