述步驟(3.3)制備的 Cit-UCNPs-ssDNA 納米晶 2~5mg，0.lmg/mL SffCNHs3~7mL，去離子水l~3mL ；
(4.2)將預備的Cit-UCNPs-ssDNA納米晶與單壁納米角按照質(zhì)量比為20:1~24:1的比例溶于l~3mL去離子水中，4°C攪拌1~2小時，最終得到急性早幼粒細胞白血病熒光檢測的Cit-UCNPs-ssDNA-SWCNHs 納米探針。
[0025]實施例2:
本實施例提供納米探針 Cit-UCNPs-ssDNA-SWCNHs 或者 Cit-UCNPs-ssDNA-GO 檢測 PML/RAR α融合基因片段即目標DNA的光譜圖，其包括以下步驟:
(I) 0.5~lmL, I μΜ 目標 DNA(5，-GGG AGG CAG CCA TTG AGA-3’ )用去離子水配制。
[0026](2)預備納米探針 Cit-UCNPs-ssDNA-SWCNHs 或者 Cit-UCNPs-ssDNA-GO，然后用去離子水稀釋到所需濃度。
[0027](3)熒光恢復實驗中，用移液管吸取2.0mL納米探針Cit-UCNPs-ssDNA-SWCNHs置于1.0cmX 1.0cm石英比色皿中，用微量進樣器向此溶液中逐滴加入目標DNA溶液，每加入一定體積的目標DNA溶液后，室溫下攪拌30~50min然后進行光譜測試，結(jié)果如圖2所示；同樣，向納米探針Cit-UCNPs-ssDNA-GO中加入目標DNA，操作步驟不變，結(jié)果如圖3所示。
[0028]實施例3:
為了證明該納米探針可以專一性識別PML/RARa融合基因片段，本實施例提供納米探針Cit-UCNPs-ssDNA-SWCNHs或者Cit-UCNPs-ssDNA-GO與分別加入單堿基錯配DNA、非互補DNA后的光譜圖，其包括以下步驟:
(1)0.5?lmL，I μΜ 單堿基錯配 DNA(5，-GGG AAG CAG CCA TTGAGA-3’ )、0.5?lmL，I μΜ非互補DNA (5，-AGT TCA TCC TGC GCT CTT-3’ )用去離子水配制。
[0029](2)預備納米探針 Cit-UCNPs-ssDNA-SWCNHs 或者 Cit-UCNPs-ssDNA-GO，然后用去離子水稀釋到所需濃度。
[0030](3)用移液管吸取 2.0mL 納米探針 Cit-UCNPs-ssDNA-SWCNHs 置于 L OcmX 1.0cm石英比色皿中，用微量進樣器向此溶液中逐滴加入單堿基錯配DNA，每加入一定體積的目標DNA溶液后，室溫下攪拌30~50min然后進行光譜測試，結(jié)果如圖4所示；用移液管吸取
2.0mL納米探針Cit-UCNPs-ssDNA-SWCNHs置于1.0cmXl.0cm石英比色皿中，用微量進樣器向此溶液中逐滴加入非互補DNA，每加入一定體積的目標DNA溶液后，室溫下攪拌30~50min然后進行光譜測試，結(jié)果如圖5所示；
(3)用移液管吸取2.0mL納米探針Cit-UCNPs-ssDNA-GO置于1.0cmX 1.0cm石英比色皿中，用微量進樣器向此溶液中逐滴加入單堿基錯配DNA，每加入一定體積的目標DNA溶液后，室溫下攪拌30~50min然后進行光譜測試，結(jié)果如圖6所示；用移液管吸取2.0mL納米探針Cit-UCNPs-ssDNA-GO置于1.0cmX 1.0cm石英比色皿中，用微量進樣器向此溶液中逐滴加入非互補DNA，每加入一定體積的目標DNA溶液后，室溫下攪拌30~50min然后進行光譜測試，結(jié)果如圖7所示；
圖1是本發(fā)明實施例1中UCNPs(A);CS-UCNPs(B);Cit-UCNPs(C) ;Cit-UCNPs-ssDNA⑶的TEM圖。從圖中可以看出，所合成的UCNPs納米粒子分散性良好且尺寸均一，納米粒子的粒徑大小在30nm ；CS-UCNPs粒徑大小在35nm ;納米粒子分散性良好且尺寸均一。Cit-UCNPs、Cit-UCNPs-ssDNA納米粒子與CS-UCNPs的粒徑相比，變化不大且仍具有良好的分散性。
[0031 ] 圖2為是本發(fā)明實施例2中納米探針Cit-UCNPs-ssDNA-SWCNHs中加入不同濃度的目標DNA后在980nm激發(fā)光照射下的上轉(zhuǎn)換熒光光譜圖；圖3為納米探針Cit-UCNPs-ssDNA-GO中加入不同濃度的目標DNA后在980nm激發(fā)光照射下的上轉(zhuǎn)換熒光光譜圖。從圖中可以看出，向溶液中分別加入不同濃度的目標DNA后，在980nm激發(fā)光下，隨著目標DNA濃度的增加，545nm出的熒光強度值逐漸增強，說明探針ssDNA首先與目標DNA夠進行堿基互補配對形成穩(wěn)定的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)，也就是說交替出現(xiàn)的、親水的脫氧核糖基和磷酸基構(gòu)成的鏈的骨架，位于雙螺旋的外側(cè)，而疏水的堿基對則在螺旋分子內(nèi)部，這種結(jié)果最終會導致SWCNHs或GO遠離納米顆粒的表面，能量傳遞過程被禁止，熒光又會恢復，從而實現(xiàn)對急性早幼粒細胞白血病(APL)的PML/RARA融合基因片段的檢測。
[0032]圖4是本發(fā)明實施例3中納米探針Cit-UCNPs-ssDNA-SWCNHs加入不同濃度單堿基錯配DNA后在980nm激發(fā)光照射下的上轉(zhuǎn)換熒光光譜圖；圖5為納米探針Cit-UCNPs-ssDNA-
SffCNHs加入不同濃度非互補DNA后在980nm激發(fā)光照射下的上轉(zhuǎn)換熒光光譜圖；圖6為納米探針Cit-UCNPs-ssDNA-GO加入不同濃度單堿基錯配DNA后在980nm激發(fā)光照射下的上轉(zhuǎn)換熒光光譜圖(C);圖7為納米探針Cit-UCNPs-ssDNA-GO加入不同濃度非互補DNA后在980nm激發(fā)光照射下的上轉(zhuǎn)換熒光光譜圖。從圖中可以看出，在980nm激發(fā)光下，隨著單堿基錯配DNA或非互補DNA濃度的增加，545nm處的熒光強度幾乎沒有發(fā)生變化，說明單堿基錯配DNA或非互補DNA并不能與探針DNA進行堿基互補配對使SWCNHs或GO遠離納米顆粒的表面，因此熒光并沒有恢復，從而證明該探針可以專一性檢測PML/RARA融合基因片段。
[0033]按照本發(fā)明所提供的將探針DNA修飾在稀土上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米晶表面，得到的產(chǎn)物具有粒徑大小均一并且分散性良好、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，上轉(zhuǎn)換熒光較強等優(yōu)點，特別是所得納米探針可應用于專一性檢測PML/RARA融合基因片段。本發(fā)明方法具有工藝簡單，操作方便，結(jié)構(gòu)易控的優(yōu)勢，在細胞遺傳學和分子生物學研宄等領域具有潛在應用價值。
[0034]如本發(fā)明上述實施例所述，采用與其相同或相似方法所得到的其它用于專一性檢測PML/RARA融合基因片段的納米探針，均在本發(fā)明保護范圍內(nèi)。
【主權(quán)項】
1.一種用于急性早幼粒細胞白血病熒光檢測的納米探針，其特征在于該納米探針由能量給體和能量受體組成，所述的能量給體和能量受體通過JT-JT鍵相互作用結(jié)合在一起；所述的能量給體是一端帶有氨基的探針DNA通過共價鍵鍵合的方式嫁接到表面羧基化后的具有核殼結(jié)構(gòu)的上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米晶上而形成的，所述的能量給體與能量受體的質(zhì)量比為20:1~24:1 ;所述的能量受體為:單壁碳納米角、氧化石墨烯或碳納米管；所述的具有核殼結(jié)構(gòu)的上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米晶的表面羧基化率為:30%~60% ;所述的探針DNA為:5’ -NH2-TCTCAA TGG CTG CCT CCC-3’ ；所述的帶有氨基的探針DNA與所述的上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米晶的摩爾比為:1:2000~1:2500 ο
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于急性早幼粒細胞白血病熒光檢測的納米探針的制備方法，其特征在于所述的具有核殼結(jié)構(gòu)的上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米晶為:NaYF4: Yb，EriNaYF4、NaYF4: Yb, EriNaYF4:Yb, Er、NaYF4: Yb, Er觀aGdF4或 NaYF 4:Yb:Er觀aGdF4:Yb, Er。
3.一種制備根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的用于急性早幼粒細胞白血病熒光檢測的方法，其特征在于該方法的具體步驟為: a.通過配體交換法將具有核殼結(jié)構(gòu)的上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米晶表面修飾上羧基，得到Cit-UCNPs ;將該Cit-UCNPs經(jīng)N-羥基琥珀酰亞胺和1_(3_ 二甲氨基丙基)_3_乙基碳二亞胺活化，得到活化后的Cit-UCNPs ； b.將步驟a所得活化后的Cit-UCNPs與探針DNADNA分子按照質(zhì)量比260:1~290:1的比例溶于去離子水中，4°C攪拌10~12小時；經(jīng)分離提純得到能量給體即Cit-UCNPs-ssDNA ； c.將步驟b所得能量給體與能量受體按照質(zhì)量比為20:1~24:1的比例溶于去離子水中，4°C攪拌1~2小時，最終得到急性早幼粒細胞白血病熒光檢測的納米探針。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用于急性早幼粒細胞白血病熒光檢測的制備方法，其特征在于所述的步驟a的具體方法為: (1)將具有核殼結(jié)構(gòu)的上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米晶分散在甲苯和氯仿的混合溶劑中，其中，甲苯和氯仿的體積比為1:2~2:3 ;上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米晶與混合溶劑的質(zhì)量體積比為:lmg/mL~3mg/mL ； (2)惰性氣氛下，將無水檸檬酸鈉溶于二乙二醇中配制成濃度為0.1388M-0.1735M的溶液，在100°C ~120°C下保持30~40min，冷卻； (3)將步驟(I)所得納米晶溶液慢慢滴加到步驟(2)所得到的溶液中，加熱至130°C，保持40~50min，蒸發(fā)除掉甲苯、氯仿，加熱至180°C，氬氣環(huán)境下，保持1~2小時，冷卻、離心，用乙醇和水洗滌，即制得水溶性的Cit-UCNPs納米晶； (4)將N-輕基瑭泊酰亞胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺按照質(zhì)量比1:1-3:1加入到l~3mL去離子水中，然后加入步驟(3)所得Cit-UCNPs納米晶，4°C攪拌2~4小時，將所得到的混合物離心，用去離子水洗滌3次，得到活化的Cit-UCNPs納米晶； (5)將步驟(4)得到的Cit-UCNPs納米晶與探針DNA分子按照質(zhì)量比260:1~290:1的比例溶于去離子水中，4°C攪拌10~12小時；將所得到的混合物離心，用去離子水洗3次后得到能量給體即Cit-UCNPs-ssDNA。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種用于急性早幼粒細胞白血病熒光檢測的納米探針及其制備方法。首先合成具有核殼結(jié)構(gòu)的上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米晶，簡稱CS-UCNPs，并以檸檬酸鈉作為配體交換劑，采用配體交換法，將CS-UCNPs表面羧基功能化，得到水溶性納米晶Cit-UCNPs，然后將功能化修飾的可專一性識別PML/RARα融合基因片段的DNA分子與Cit-UCNPs進行共價鍵組裝，得到納米晶Cit-UCNPs-ssDNA，最后將單壁碳納米角或氧化石墨烯與Cit-UCNPs-ssDNA通過π-π相互作用結(jié)合在一起，構(gòu)筑納米探針Cit-UCNPs-ssDNA-SWCNHs和Cit-UCNPs-ssDNA-GO。實現(xiàn)水溶液中PML/RARα融合基因片段的熒光檢測。本發(fā)明方法具有工藝簡單，操作方便，結(jié)構(gòu)易控的優(yōu)勢。所制備的納米熒光探針不僅尺寸均一、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，而且具有毒性低、生物相容性好的特點，在細胞遺傳學和分子生物學研究等領域具有潛在應用價值。
【IPC分類】C12Q1-68, C12N15-10, C12N15-11
【公開號】CN104818325
【申請?zhí)枴緾N201510178685
【發(fā)明人】施利毅, 劉金亮, 徐艷霞, 孫麗寧, 孟憲福
【申請人】上海大學
【公開日】2015年8月5日
【申請日】2015年4月16日