基于“Y”結(jié)點(diǎn)探針的雙通道傳感器檢測急早粒PML/RARα基因序列的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種基于“Y”結(jié)點(diǎn)探針的雙通道傳感器檢測急早粒PML/RARa基因序列的方法，屬于生物傳感技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]急性早幼粒細(xì)胞白血病(APL)是急性髓細(xì)胞白血病(AML) FAB分型中的M3亞型，是嚴(yán)重危害人類健康的惡性血液病之一。它起病急，迅速惡化，表現(xiàn)十分兇險，出血傾向明顯，易發(fā)生彌漫性血管內(nèi)凝血，死亡率高，治療比較困難。白血病早期診斷(基因診斷)水平將直接影響患者的治療效果及生存質(zhì)量，其重要意義不言而喻。
[0003]目前臨床上常用的檢測方法主要有流式細(xì)胞技術(shù)、FISH技術(shù)、染色體分析法、RT-PCR技術(shù)等，但都存在一定的局限性，如價格昂貴、操作繁瑣、靈敏度不高等。因此，研發(fā)一種尚敏感性、尚選擇性的APL相關(guān)基因的檢測技術(shù)具有極其廣闊的臨床應(yīng)用如景。
[0004]APL最為常見的染色體易位為t (15 ;17) (q22 ;q21)，其易位產(chǎn)物PML/RARa融合基因發(fā)生于95%的APL中，是惡性克隆的標(biāo)志基因。
[0005]臨床樣品中，待測DNA通常以雙鏈大片段形式存在，雙鏈片段中與靶標(biāo)ssDNA互補(bǔ)的另一條DNA序列容易對DNA探針分子的檢測造成干擾。利用單通道電化學(xué)DNA生物傳感器檢測基因序列，其單探針捕獲靶標(biāo)dsDNA的過程存在干擾分子識別及降低雜交效率等不足。因此，為解決單通道電化學(xué)DNA生物傳感器的局限性，對原有單組DNA探針分子進(jìn)行優(yōu)化，設(shè)計(jì)了基于雙組探針檢測的新型傳感檢測方法，即將兩組分別與待測靶標(biāo)dsDNA兩條序列部分互補(bǔ)的捕獲探針修飾在雙通道電化學(xué)DNA陣列傳感器不同通道的電極表面，通過雙通道電化學(xué)陣列傳感器實(shí)現(xiàn)對靶標(biāo)dsDNA兩條序列的同時檢測，有利于提高探針與dsDNA的雜交效率，有助于陣列傳感器日后實(shí)現(xiàn)對臨床實(shí)際樣品中dsDNA的直接檢測。
[0006]DNA探針分子作為多通道電化學(xué)DNA陣列傳感器設(shè)計(jì)的關(guān)鍵，其與待測靶標(biāo)DNA之間的序列選擇性對DNA陣列傳感器的性能具有很大的影響，而經(jīng)典傳感器中，所設(shè)計(jì)的ssDNA探針多數(shù)存在穩(wěn)定性差的問題。所以，研制高靈敏度和高特異性的DNA探針，并將其應(yīng)用于與靶標(biāo)DNA序列間雜交信息的檢測具有重要意義。結(jié)點(diǎn)探針檢測技術(shù)是一種新型的DNA探針檢測技術(shù)。該檢測技術(shù)包含有兩條部分互補(bǔ)的探針，在特定的溫度下，如果溶液中不存在靶標(biāo)DNA，則這兩探針互補(bǔ)序列間無法形成雙鏈，當(dāng)溶液中存在靶標(biāo)DNA時，兩條探針會與靶標(biāo)DNA形成一種形似“Y”字型的三元結(jié)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)對靶標(biāo)DNA的檢測。該檢測方法具有很強(qiáng)的特異性，能夠很好的識別單堿基錯配。而如何放大檢測目標(biāo)的量是影響傳感器檢測性能的另一個重要問題。限制性核酸內(nèi)切酶是可以識別DNA的特異序列，并在識別位點(diǎn)或其周圍切割雙鏈DNA的一類內(nèi)切酶，又被簡稱為內(nèi)切酶。將其引入到電化學(xué)DNA生物傳感器的設(shè)計(jì)中，構(gòu)建了基于內(nèi)切酶特異性剪切作用的超靈敏電化學(xué)DNA生物傳感器，可以達(dá)到通過酶催化放大信號的目的。
[0007]下面所述的為本發(fā)明人率先將基于雙“Y”結(jié)點(diǎn)探針的雙通道電化學(xué)傳感檢測方法應(yīng)用于快速檢測PML/RARa融合基因dsDNA片段:本實(shí)驗(yàn)針對APL中PML/RARa融合基因dsDNA的相關(guān)堿基序列，設(shè)計(jì)了兩組“Y”結(jié)點(diǎn)探針(包含了捕獲探針和輔助探針)，并利用限制性內(nèi)切酶循環(huán)剪切作用和酶聯(lián)放大技術(shù)相結(jié)合構(gòu)建一種新型的雙通道電化學(xué)DNA陣列傳感模式，并將其用于人工合成的PML/RARa融合基因dsDNA的檢測。
[0008]該傳感器包含有兩組檢測探針，每組探針各包含有一條兩端分別修飾巰基和生物素的捕獲探針(Capture probe, C)和一條存在部分序列與捕獲探針相互互補(bǔ)的輔助探針(Assistant probe, A)。且這兩組探針(C1/A1和C2/A2)分別與革El標(biāo)dsDNA中相應(yīng)的兩條序列(Sla和Slb)部分互補(bǔ)。以探針Cl/Al/Sla為例，捕獲探針Cl的3’端和5’端分別修飾有生物素和巰基，其5’端半片段與靶標(biāo)dsDNA中的Sla序列3’端部分互補(bǔ)且具有較高的解鏈溫度，3’端半片段與輔助探針Al的5’端半片段序列互補(bǔ)且解鏈溫度較低，內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)就在C1/A1的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)中。而輔助探針基因Al的3’端半片段又與靶標(biāo)dsDNA中的Sla序列5’端序列互補(bǔ)。同樣的探針C2/A2與Slb之間也存在著兩兩間互補(bǔ)，且C2與A2之間互補(bǔ)部分的解鏈溫度遠(yuǎn)低于其它互補(bǔ)部分的解鏈溫度，而C2/A2的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)中內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)序列與C1/A1相同。實(shí)驗(yàn)前，先把過量的輔助探針基因Al和A2加入到含有待測靶標(biāo)dsDNA (Sla和Slb)的雜交溶液中進(jìn)行熱變性，然后置于冰浴中待測。接著通過巰基自組裝過程將Cl和C2分別固定到不同通道中的工作電極表面，然后將修飾了 Cl和C2的兩個工作電極放入含有輔助探針基因Al、A2和靶標(biāo)dsDNA(Sla和Slb)的待測溶液中進(jìn)行雜交反應(yīng)，同時在雜交溶液中加入限制性內(nèi)切酶(Rsa I)。輔助探針基因Al和A2分別與靶標(biāo)dsDNA中相應(yīng)的Sla和Slb形成兩個穩(wěn)定雜交體，有效阻止了靶標(biāo)DNA的自身復(fù)性，同時這兩個雜交體(Al/Sla和A2/Slb)中各自一側(cè)輔助探針與靶標(biāo)DNA其余序列又可與固定在電極上的相應(yīng)的捕獲探針雜交，在兩個工作電極表面分別形成特殊的“Y”結(jié)點(diǎn)構(gòu)型，此時限制性內(nèi)切酶Rsa I能夠識別捕獲探針基因與輔助探針基因(C1/A1和C2/A2)所形成的雙鏈結(jié)構(gòu)中特定的酶切位點(diǎn)，對其進(jìn)行剪切，使得捕獲探針修飾的生物素游離了出來，同時也破壞了 “Y”結(jié)點(diǎn)構(gòu)型的穩(wěn)定性，Sla和Slb被釋放到溶液中，開始新一輪的雜交過程。隨著“雜交-剪切-釋放”過程不斷循環(huán)，經(jīng)過一定時間后，電極表面上存在的生物素越來越少，進(jìn)而使得能夠固定到電極表面的親和素修飾的辣根過氧化物酶(avidin-HRP)數(shù)量急劇減少，因此，雙通道電化學(xué)DNA陣列傳感器檢測到的電流信號也隨之降低。若溶液中不存在靶標(biāo)dsDNA，則無法形成穩(wěn)定的“Y”結(jié)點(diǎn)構(gòu)型，由于捕獲探針基因與輔助探針基因(C1/A1和C2/A2)之間的互補(bǔ)序列解鏈溫度較低，因此無法進(jìn)行雜交，Rsa I尋找不到酶切位點(diǎn)就無法將生物素從電極表面剪切下來，于是avidin-HRP能夠固定到電極面上產(chǎn)生較大的電流信號。該傳感模式通過“Y”結(jié)點(diǎn)檢測探針、限制性內(nèi)切酶特異性循環(huán)剪切作用和酶的催化功能，極大地增強(qiáng)了該檢測方法測定雙鏈DNA的特異性及靈敏度，從而建立了高靈敏度、高特異性的急性早幼粒細(xì)胞白血病基因檢測方法，應(yīng)用于有效解決急性早幼粒細(xì)胞白血病早期診斷這一臨床迫切的實(shí)際問題，無疑具有極其重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明的目的在于提供一種基于雙“Y”結(jié)點(diǎn)探針的雙通道電化學(xué)傳感器以及檢測急性早幼粒細(xì)胞白血病雙鏈PML/RARa融合基因序列的方法，旨在解決臨床實(shí)際樣品中DNA多以雙鏈片段形式存在，雙鏈片段中與靶標(biāo)單鏈DNA相互補(bǔ)的另一條DNA鏈容易對探針的檢測造成干擾，影響檢測效果，且現(xiàn)有檢測方法靈敏度低、檢測周期長、價格昂貴等。
[0010]本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的，所述的基于“Y”結(jié)點(diǎn)探針的雙通道電化學(xué)傳感器，包含有兩組檢測探針，其特征在于I)所述兩組檢測探針采用兩組“Y”結(jié)點(diǎn)檢測探針，其中一組是捕獲探針和輔助探針，另一組是捕獲探針和輔助探針，所述一組捕獲探針的基因采用，3’ 修飾生物素，5’端巰基標(biāo)記:5’ -SH-TTTT TTT TTT GGG TCT CAA TGG TGT ACAG-b1tin-3’ ；一組的輔助探針的基因采用:5’ -CTG TAC ACT GCC TCC CC-3’ ；另一組的捕獲探針的基因采用，3’修飾生物素，5’端巰基標(biāo)記:5’-SH-TTTT TTT TTT GGG AGG CAG AAGTAC TA-b1tin-3’ ；另一組的輔助探針的基因采用:5’ -TAG TAC TTC CAT TGA GAC CC-3’ ；將兩個捕獲探針的基因通過其修飾有的巰基分別自組裝固定在不同通道上的兩個型號相同的金電極表面，對兩個金電極表面未結(jié)合的位點(diǎn)通過封閉劑進(jìn)行封閉；2)將上述兩個輔助探針的基因提前混于含有靶標(biāo)dsDNA的雜交溶液中，通過高溫變性使靶標(biāo)雙鏈DNA解鏈成單鏈，并將變性后的雜交溶液置于冰浴中保持雜交溶液中DNA單鏈狀態(tài)，同時加入一定量的限制性內(nèi)切酶Rsa I ;3)將分別修飾了兩個捕獲探針的基因的兩個金電極工作電極放入上述的含有限制性內(nèi)切酶Rsa I和兩個輔助探針的基因的靶標(biāo)dsDNA待測雜交溶液中進(jìn)行雜交反應(yīng)；上述的兩個輔助探針的基因分別與靶標(biāo)dsDNA中相應(yīng)的DNA片段Sla和DNA片段Slb形成兩個穩(wěn)定雜交體，有效阻止了靶標(biāo)DNA的自身復(fù)性，同時這兩個穩(wěn)定雜交體中各自雜交有的輔助探針的基因與靶標(biāo)DNA其余未雜交的序列又可與固定在金電極表面上的相應(yīng)的捕獲探針雜交，在每個工作電極表面分別形成特殊的“Y”結(jié)點(diǎn)構(gòu)型，在“Y”結(jié)點(diǎn)構(gòu)型中金電極表面上的捕獲探針作為“Y的下部支撐桿”，兩個穩(wěn)定雜交體分別與不同捕獲探針相應(yīng)的互補(bǔ)部分進(jìn)行雜交后，其中含有的輔助探針的基因的雜交體部分作為“Y的兩分叉”)，此時限制性內(nèi)切酶Rsa I能夠識別捕獲探針的基因與輔助探針的基因所形成的雙鏈結(jié)構(gòu)中特定的酶切位點(diǎn)，對其進(jìn)行剪切，使得捕獲探針修飾的生物素游離了出來，同時也破壞了 “Y”結(jié)點(diǎn)構(gòu)型的穩(wěn)定性，DNA片段Sla和DNA片段Slb被釋放到雜交溶液中，開始新一輪的雜交過程，隨著“雜交-剪切-釋放”過程不斷循環(huán)，經(jīng)過一定時間后，金電極表面上存在的生物素越來越少；4)在雜交溶液中加入親和素修飾的辣根過氧化物酶，通過辣根過氧化物酶(HRP)上的親和素(avidin)，根據(jù)親和素與生物素之間的親和作用，將辣根過氧化物酶結(jié)合到金電極上去，所述的金電極置于由3，3’，5，5’ -四甲基聯(lián)苯胺(TMB)和H2O2組成的檢測底液中，通過辣根過氧化物酶HRP催化使得H2O2氧化TMB產(chǎn)生電化學(xué)信號，利用電化學(xué)雙通道工作站同時采集電信號。
[0011 ] 所述的靶標(biāo)dsDNA為待檢測APL的PML/RAR α融合基因dsDNA，其型別為長型融合基因。
[0012]本發(fā)明所述的雙通道電化學(xué)傳感器檢測急性早幼粒細(xì)胞白血病雙鏈PML/RARa融合基因序列的方法，包括如下步驟:待檢測基因序列為急性早幼粒細(xì)胞白血病(APL)的PML/RARa融合基因，95%的APL病人為t (15 ; 17) (q22 ;q21)，在PML和RARα基因發(fā)生斷裂時，RARa基因斷裂點(diǎn)較為固定，發(fā)生在第2內(nèi)含子，在與RARa基因發(fā)生融合時，PML基因的斷裂點(diǎn)通常集中在三個區(qū)域，分別稱為bcrl (break cluster reg1n I)、bcr2和bcr3。Bcrl位于PML的第6內(nèi)含子，形成長型(即L型)融合基因，約占病人的55% ；bcr2位于PML的第6外顯子，在與RARa第3外顯子融合區(qū)內(nèi)常常插入RARα第2內(nèi)含子中的3?127bp，形成變異型(即V型)融合基因，約占病人的5% ;bcr3位于PML的第3內(nèi)含子，形成短