mol/L KOH的10mmol/L K3Fe (CN) 6溶液中(電位范圍為-0.2V?+0.6V的條件下進行循環(huán)伏安掃描，掃描速度100mV/S)，測定結(jié)果見圖 2(A)的曲線 d 和含有 0.0lmol/L K3[Fe (CN)6]/K4[Fe (CN)6] (1:1)的 0.1M KCl 溶液中電極表面電子傳遞電阻(Ret)的變化，測定結(jié)果見圖2(B)曲線d。
[0058]圖2結(jié)果顯示，溶液中不存在靶標(biāo)dsDNA，則捕獲探針、輔助探針與靶標(biāo)互補鏈之間的雜交無法進行，電極面上無法形成“Y”結(jié)點構(gòu)型，內(nèi)切酶無法將b1tin從電極表面切除，此時連接到Cl/MCH/AuE表面的HRP的數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于在含有l(wèi)nmol/L靶標(biāo)dsDNA的情況下經(jīng)過90min酶切后的Cl/MCH/AuE電極表面的HRP數(shù)量。所以氧化還原峰電流降至最低，交流阻抗值增加到最大。
[0059]以上實施例2、3、4、5表明:捕獲探針已經(jīng)成功組裝到工作電極表面，并且在輔助探針的協(xié)助下能很好地區(qū)分待測溶液中是否含有靶標(biāo)dsDNA。
[0060]實施例6:
[0061]基于“Y”結(jié)點探針的雙通道DNA傳感器對目標(biāo)DNA的檢測步驟如下:
[0062](I)將過量的輔助探針加入到含有完全互補DNA序列的雜交溶液中，并將其置于95°C下變性1min后取出放入冰浴中，同時加入一定濃度的限制性內(nèi)切酶Rsa I。然后，將實施例3獲得的固定在表面的探針DNA探針放入到雜交溶液中，接著在37°C下雜交90min后，取出并用pH 7.50的Tris-HCl緩沖液清洗10s，氮氣吹干，用0.1% BSA進行封閉30min后，在電極表面滴加3 yL streptavidin-HRP酶儲備液，37°C下反應(yīng)15min，依次置于含有
0.05%吐溫的 10mmol/L Tris-HCl 洗液和 10mmol/L Tris-HCl 洗液，室溫放置各 5min 后，立即進行電化學(xué)檢測。
[0063](2)將步驟⑴制得的電極浸入到500 μ L的TMB底物溶液(37°C )中，鉑絲電極作為對電極，Ag/AgCl (KCl 3mol/L)為參比電極，記錄電流-時間曲線，讀出電流值，初始電位為100mV，實驗時間100s。測定結(jié)果見圖3的曲線a。
[0064]圖3結(jié)果顯示，當(dāng)固定有捕獲探針與完全互補的目標(biāo)DNA雜交反應(yīng)后，電流信號最強(曲線a)，說明捕獲探針能夠很好的與其完全互補的堿基序列進行雜交，出現(xiàn)強的電流信號。
[0065]實施例7:
[0066]基于“Y”結(jié)點探針的雙通道DNA傳感器對目標(biāo)DNA的檢測步驟如下:
[0067](I)將過量的輔助探針加入到含有單堿基錯配DNA序列的雜交溶液中，并將其置于95°C下變性1min后取出放入冰浴中，同時加入一定濃度的限制性內(nèi)切酶Rsa I。然后，將實施例3獲得的固定在表面的探針DNA探針放入到雜交溶液中，接著在37°C下雜交90min后，取出并用pH 7.50的Tris-HCl緩沖液清洗10s，氮氣吹干，用0.1 % BSA進行封閉30min后，在電極表面滴加3 yL streptavidin-HRP酶儲備液，37°C下反應(yīng)15min，依次置于含有0.05%吐溫的10mmol/L Tris-HCl洗液和10mmol/L Tris-HCl洗液，室溫放置各5min后，立即進行電化學(xué)檢測。
[0068](2)將步驟⑴制得的電極浸入到500 μ L的TMB底物溶液(37°C )中，鉑絲電極作為對電極，Ag/AgCl (KCl 3M)為參比電極，記錄電流-時間曲線，讀出電流值，初始電位為100mV，實驗時間100s。測定結(jié)果見圖3的曲線b。
[0069]圖3結(jié)果顯示，單堿基錯配的DNA序列電流信號(曲線b)相對于完全互補序列的信號(曲線a)有明顯減弱，這說明捕獲探針不能與存在一個堿基錯配的序列進行完全雜交，故電流信號較低。
[0070]實施例8:
[0071]基于“Y”結(jié)點探針的雙通道DNA傳感器對目標(biāo)DNA的檢測步驟如下:
[0072](I)將過量的輔助探針分別加入到①含有三堿基錯配DNA序列的雜交溶液中，②含有五堿基錯配DNA序列雜交溶液中，③含有正常人PML部分的DNA序列雜交液中，④含有正常人RARa部分的DNA序列雜交液中。并將其置于95°C下變性1min后取出放入冰浴中，同時加入一定濃度的限制性內(nèi)切酶Rsa I。然后，將實施例3獲得的固定在表面的探針DNA探針放入到雜交溶液中，接著在37°C下雜交90min后，取出并用pH 7.50的Tris-HCl緩沖液清洗10s，氮氣吹干，用0.1% BSA進行封閉30min后，在電極表面滴加3yL str印tavidin-HRP酶儲備液，37°C下反應(yīng)15min，依次置于含有0.05 %吐溫的1mMTris-HCl洗液和10mmol/L Tris-HCl洗液，室溫放置各5min后，立即進行電化學(xué)檢測。
[0073](2)將步驟⑴制得的電極浸入到500 μ L的TMB底物溶液(37°C )中，鉑絲電極作為對電極，Ag/AgCl (KCl 3mol/L)為參比電極，記錄電流-時間曲線，讀出電流值，初始電位為lOOmV，實驗時間100s。測定結(jié)果見圖3的曲線c、d、e、f。
[0074]圖3結(jié)果顯示，當(dāng)檢測對象為三堿基錯配dsDNA (C)、五堿基錯配dsDNA (d)、正常人PML部分dsDNA序列(e)和正常人RARa部分dsDNA序列(f)時，其最終計算出Σ Λ I值遠(yuǎn)低于互補靶標(biāo)dsDNA (a)所檢測信號，其檢測信號接近空白背景電流值，說明捕獲探針不能與三堿基錯配、五堿基錯配、正常人PML部分和正常人RARa部分堿基序列發(fā)生雜交，故電流信號很低。
[0075]以上實施例6、7、8表明:該方法構(gòu)建的DNA電化學(xué)傳感器，Y”結(jié)點探針具有更高的雜交選擇專一性，且基于內(nèi)切酶特異性剪切作用和“Y”結(jié)點探針技術(shù)的雙通道電化學(xué)DNA陣列傳感器具有很好的DNA序列特異性和選擇性，能實現(xiàn)對靶標(biāo)dsDNA中單堿基對突變的識別和檢測。
[0076]實施例9:
[0077]基于“Y”結(jié)點探針的雙通道DNA傳感器的制備以及對PML/RARa融合基因的檢測步驟如下:
[0078](I)將金電極用Piranha溶液(30 %的H2O2和H 2S04，以1:3的體積比混合)超聲1min后，分別用去離子水超聲清洗2次，每次lOmin，然后置于KOH溶液中進行電化學(xué)清洗，接著依次用I μπκΟ.3 μπι、0.05 μ m粒徑的Al2O3混懸液拋光至鏡面，再先后用無水乙醇、去離子水超聲清洗。接著將超聲好的電極置于0.5M H2SO4S液中循環(huán)掃描至穩(wěn)定，用去離子水清洗，N2吹干備用。
[0079](2)將處理好的裸金電極分別浸沒在含有不同序列的巰基修飾捕獲探針溶液(Cl或者C2)中，在室溫下反應(yīng)2h后，用pH 7.50的Tris-HCl緩沖液清洗10s，氮氣吹干。
[0080](3)將步驟⑵中處理好的電極置于lmmol/L MCH水溶液中封閉lh，即可得到修飾有捕獲探針和巰基己醇的金電極，然后用PH 7.50的Tris-HCl緩沖液清洗10s，氮氣吹干。
[0081](4)將過量的輔助探針基因(A1、A2)加入到含有待測dsDNA的雜交溶液中，并將其置于95°C下變性1min后取出放入冰浴中，同時加入一定濃度的限制性內(nèi)切酶Rsa I。然后，將步驟(3)處理好的電極(分別組裝有Cl和C2的金電極)一同放入到雜交溶液中，接著在37°C下雜交90min后，取出并用pH 7.50的Tris-HCl緩沖液清洗10s，氮氣吹干。
[0082](5)將步驟(4)處理好的電極用0.1 % BSA進行封閉30min后，在電極表面滴加3 yL streptavidin-HRP酶儲備液，37 °C下反應(yīng)15min，依次置于含有0.05%吐溫的10mmol/L Tris-HCl 洗液和 10mmol/L Tris-HCl 洗液，室溫各放置 5min。
[0083](6)將步驟(5)浸入到500 μ L的TMB底物溶液(37°C )中，鉑絲電極作為對電極，Ag/AgCl (KCl 3M)為參比電極，記錄電流-時間曲線，讀出電流值，初始電位為100mV，實驗時間10s0
[0084](7)利用雙通道電化學(xué)工作站通過安培電流時間曲線法能夠?qū)崿F(xiàn)對靶標(biāo)dsDNA鏈中兩條互補序列的同時檢測，將檢測所得信號結(jié)果進行計算疊加，可以得到靶標(biāo)dsDNA的檢測最終電流信號，比較雜交前后電信號的差異，可說明溶液中是否存在靶標(biāo)dsDNA。電流與目標(biāo)DNA濃度關(guān)系見圖4。
[0085]從圖4的結(jié)果可以看出，在一定濃度范圍內(nèi)，隨著靶標(biāo)dsDNA濃度增加，電極表面雜交形成的“Y”結(jié)點構(gòu)型DNA的數(shù)量不斷增加，經(jīng)過N個“雜交-剪切-釋放”循環(huán)后，其最終檢測出來的IdsraJf號隨之減小。通過對電流信號的計算整理后，從圖4(C)可以看出，與單組探針(C1/A1或者C2/A2)組成的雙通道電化學(xué)DNA陣列傳感器相比，當(dāng)靶標(biāo)dsDNA溶度低至1.0X 10_13mol/L時，兩組探針(C1/A1+C2/A2)組成的雙通道電化學(xué)DNA陣列傳感器仍能將其測定出來，且在1.0\10_13?2.0父10_1211101/1范圍呈較好的線性關(guān)系(圖4(D))，其相關(guān)的回歸方程為Σ Λ Ι(ηΑ) = 1019.1737+1172.9564CdsDNA(pmol/L)，r = 0.9939，檢測限可達(dá)4.7X10_14mol/L。而單組探針(C1/A1或者C2/A2)的檢測范圍僅為1.0 X 10_1CI?
1.0X 10_8mol/L。該實驗結(jié)果表明該傳感器通過組裝兩組“Y”結(jié)點探針，能夠較為有效的阻止靶標(biāo)dsDNA的自身復(fù)性，提高探針與靶標(biāo)dsDNA的雜交效率，且利用限制性內(nèi)切酶酶切放大信號的策略，可以實現(xiàn)對APL中人工合成的PML/RARa dsDNA片段的定量檢測，且具有較高的靈敏度。
[0086]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改，等同替換和改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項】
1.一種基于“Y”結(jié)點探針的雙通道電化學(xué)傳感器，包含有兩組檢測探針，其特征在于I)所述兩組檢測探針采用兩組“Y”結(jié)點檢測探針，其中一組是捕獲探針(I)和輔助探針(1-1)，另一組是捕獲探針(2)和輔助探針(2-1)，所述一組捕獲探針(I)的基因(Cl)采用3’ 修飾生物素，5’ 端巰基標(biāo)記:5’ -SH- TTTT TTT TTT GGG TCT CAA TGG TGT ACA G-b1tin - 3’； 一組輔助探針(1-1)的基因(Al)采用:5’ -CTG TAC ACT GCC TCC CC- 3’；另一組捕獲探針(2)的基因(C2)采用，3’修飾生物素，5’端巰基標(biāo)記:5’-SH- TTTT TTTTTT GGG