本發(fā)明涉及一種用于檢測眼科疾病的試劑盒及其檢測方法。
背景技術(shù)：
：格雷夫斯病(Graves'disease)是一種常見病，女性發(fā)病率為1/1000人/年。除甲狀腺功能亢進(jìn)以外，25-50％患有格雷夫斯病的個體病情發(fā)展到在臨床上累及眼睛，即甲狀腺眼病。格雷夫斯眼病(Graves'Ophthalmopathy,GO或TAO)是甲狀腺眼病的典型形式。雖然一些GO患者只患有輕微的眼睛不適，但是3-5％患有劇烈疼痛和炎癥伴有復(fù)視乃至視力喪失。目前由于本病原因未明，臨床主要以激素、免疫抑制劑、生長激素類似物、抗甲狀腺藥物、眶內(nèi)放射、眼眶減壓術(shù)等綜合治療為主，但由于種種原因，效果并不盡人意，迄今為止尚無任何一種藥物能有效治療TAO，并獲長期緩解。因此，研究治療甲狀腺相關(guān)眼病的藥物是亟待解決的技術(shù)問題。而檢測所述疾病更是本領(lǐng)域積極研究的方向。近年來的研究表明，人瘦素蛋白(rh-leptin)對TAO患者眼眶前脂肪成纖維細(xì)胞增殖、移行以及細(xì)胞分化過程中細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)形成具有重要的作用。因此，檢測人瘦素蛋白的表達(dá)情況，可以直接用于鑒定甲狀腺相關(guān)眼病。然而傳統(tǒng)的檢測人瘦素蛋白的表達(dá)情況具有操作復(fù)雜，費(fèi)時的缺點。核酸適體(Aptamer,又稱適配體,適配子)是能高親和性、高特異性的結(jié)合某種生物革El標(biāo)的單鏈寡核酸分子(ssDNA或ssRNA)。核酸適體是通過指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(Systemat1cEvolut1onofL1gandsbyExponent1alenr1chment,SELEX)從人工合成的DNA/RNA文庫中篩選得到的能夠高度特異性結(jié)合靶標(biāo)分子的單鏈DNA/RNA。已報道核酸適體的靶標(biāo)包括金屬離子、有機(jī)小分子、多肽、蛋白質(zhì)、細(xì)胞甚至組織等。核酸適體的分子識別功能與抗體類似，具有與抗體分子相當(dāng)甚至更強(qiáng)的靶標(biāo)識別能力，但與抗體相比具有很多優(yōu)良的特性，如分子量小，能批量生產(chǎn)，不易失活，無免疫原性、容易合成與標(biāo)記、快速的穿透組織、良好的代謝動力學(xué)、不同批次之間產(chǎn)品不會存在差異和具有很好化學(xué)穩(wěn)定性，在生物檢測、疾病診斷治療等領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用前景。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種特異結(jié)合leptin的核酸適體及其試劑盒。本發(fā)明提供的核酸適體，是序列表的序列1-15所示的單鏈DNA。所述核酸適體與leptin蛋白具有較好的親和能力。還可將所述核酸適體進(jìn)行修飾或改造，得到所述核酸適體的衍生物。所述核酸適體的衍生物可為如下任意一種：a)將所述核酸適體刪除部分或增加部分互補(bǔ)的核苷酸，得到的與所述核酸適體具有相同功能的核酸適體的衍生物；b)將所述核酸適體進(jìn)行核苷酸取代或部分修飾，得到的與所述核酸適體具有相同功能的核酸適體的衍生物；c)將所述核酸適體的骨架改造為硫代磷酸酯骨架，得到的與所述核酸適體具有相同功能的核酸適體的衍生物；d)將核酸適體改造為肽核酸，得到的與所述核酸適體具有相同功能的核酸適體的衍生物；e)將所述核酸適體連接上熒光、放射性和治療性物質(zhì)后，得到的與所述核酸適體具有相同功能的核酸適體的衍生物。所述核酸適體可用于制備檢測leptin的試劑盒。利用本發(fā)明的核酸適體，可以捕獲血液中的leptin，從而用于甲狀腺相關(guān)眼病篩查。利用本發(fā)明的核酸適體，部分代替單克隆抗體捕獲leptin進(jìn)行檢測，具有高靈敏、成本低、易制備、易保存的優(yōu)點。本發(fā)明具有很高的應(yīng)用價值。具體實施方式以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。實施例1、核酸適體的篩選和制備設(shè)計兩端包含大約20個核苷酸、中間包括39個核苷酸的隨機(jī)核酸文庫如下：5’-TAGACTATCATGTGACTT(N39)GAGTGCTCGATGCTACTAG-3’；N39代表39個隨機(jī)核苷酸。將單鏈DNA文庫擴(kuò)增為雙鏈DNA,產(chǎn)物經(jīng)2％瓊脂糖凝膠電泳并切膠回收純化；以回收的雙鏈DNA為模板，體外轉(zhuǎn)錄出單鏈RNA隨機(jī)文庫，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物經(jīng)PAGE純化。75μgRNA文庫經(jīng)硝酸纖維素膜反篩去除與膜結(jié)合的RNA分子，然后與2ugleptin蛋白(利用CN100366738C公開的方法，表達(dá)得到的目的蛋白)，37℃孵育30min，反應(yīng)液經(jīng)硝酸纖維素膜濾過，洗滌濾膜；然后將濾膜剪碎，置于洗脫緩沖液(6mol/L尿素，0.55mol/L醋酸銨，l.5mmol/LEDTA,0.15％SDS)中煮沸5min，離心，取上清，無水乙醇沉淀RNA，并重新溶解于20μ1DEPC水中；以RNA為模板RT-PCR擴(kuò)增雙鏈DNA，體外轉(zhuǎn)錄出RNA文庫用于下一輪篩選；每輪篩選過程中RT-PCR得到雙鏈DNA文庫，以該雙鏈DNA為模板體外轉(zhuǎn)錄出RNA適配子庫，篩選共進(jìn)行12輪。得到了15個適配子，其序列分別為SEQIDNO:1-15所示。具體序列如下所示：leptin-1：TAGACTATCATGTGACTTCCTTAACTATATACAATTATGTCATATCTTACAAGTACTGAGTGCTCGATGCTACTAG(SEQIDNO:1)leptin-2：TAGACTATCATGTGACTTTACAAGATACATTCATCCCGCAACACACTCAACCAACTCGAGTGCTCGATGCTACTAG(SEQIDNO:2)leptin-3：TAGACTATCATGTGACTTTCTACCTAATAATAACCTATACCTCCCTCAGTAATCACAGAGTGCTCGATGCTACTAG(SEQIDNO:3)leptin-4：TAGACTATCATGTGACTTACCTATTAACTTGTACTCCTACAAACCCAGAACAACACAGAGTGCTCGATGCTACTAG(SEQIDNO:4)leptin-5：TAGACTATCATGTGACTTTCACTGTTAACACAGATAATTAACATAACAACGTCTATAGAGTGCTCGATGCTACTAG(SEQIDNO:5)leptin-6：TAGACTATCATGTGACTTAAACATCCTCCCTATACCTATCCGTATACCGCTTCCTCTGAGTGCTCGATGCTACTAG(SEQIDNO:6)leptin-7：TAGACTATCATGTGACTTAACACCGCCTAATATTAATATCCCCTTCTTCATAGATCAGAGTGCTCGATGCTACTAG(SEQIDNO:7)leptin-8：TAGACTATCATGTGACTTCCGACTTCATACATACTCCTCTTCATCCTGTAATCAACCGAGTGCTCGATGCTACTAG(SEQIDNO:8)leptin-9：TAGACTATCATGTGACTTATATATCCTCCACTTAGATAACAATCTTCAGACACTCCAGAGTGCTCGATGCTACTAG(SEQIDNO:9)leptin-10：TAGACTATCATGTGACTTCCTCCTTCTTCCTCCGATTCATCCTCAATAGATACTATTGAGTGCTCGATGCTACTAG(SEQIDNO:10)leptin-11：TAGACTATCATGTGACTTTTCACGCTCAATCATAAATCTTAGAATCCAATAATTACCGAGTGCTCGATGCTACTAG(SEQIDNO:11)leptin-12：TAGACTATCATGTGACTTCCGCCACTCCTCATCACATCGCCACACCCAAATTCACAAGAGTGCTCGATGCTACTAG(SEQIDNO:12)leptin-13：TAGACTATCATGTGACTTCGCTCCTCTCTTGTTTACTACACATATCTTGTTATCTTAGAGTGCTCGATGCTACTAG(SEQIDNO:13)leptin-14：TAGACTATCATGTGACTTACCTATTCCGCCCTCACCTTCCTCTACTAGATCATAACTGAGTGCTCGATGCTACTAG(SEQIDNO:14)leptin-15：TAGACTATCATGTGACTTATAATTCTATATATATCGCACTACATCAAACGCCATAAAGAGTGCTCGATGCTACTAG(SEQIDNO:15)實施例2蛋白結(jié)合適配子的性能測定將RNA適配子分別取2.0μg，用牛小腸堿性磷酸酶(CIP)37℃消化lh，純化回收去磷酸化的RNA；通過T4多核苷酸激酶標(biāo)記[γ-32P]ATP于去磷酸化的RNA分子末端。10nmol放射性標(biāo)記的RNA適配子分別與不同濃度(1-200nM)的leptin37℃孵育30min，各組反應(yīng)液經(jīng)硝酸纖維素膜濾過，洗滌濾膜，干燥濾膜，液閃計數(shù)儀測定濾膜上殘留的放射量，同一樣品平行做兩次測定。計算各個適配子與leptin的解離常數(shù)。結(jié)果如下：名稱解離常數(shù)Kd(單位nM)leptin-110.9leptin-210.8leptin-39.9leptin-410.3leptin-510.5leptin-69.6leptin-79.8leptin-810.0leptin-910.3leptin-109.9leptin-119.8leptin-1210.1leptin-1310.6leptin-149.7leptin-159.7PBS空白對照無結(jié)合能力實施例3所述適配子特異性分析以及穩(wěn)定性分析分別采用人血白蛋白，免疫血清球蛋白，霍亂弧菌VgrG3C蛋白，大腸桿菌外膜蛋白A，Lp-PLA2蛋白,leptin，與14條適配子進(jìn)行特異性檢測，經(jīng)過結(jié)合試驗發(fā)現(xiàn)，這些適配子都不與這些蛋白相結(jié)合，而只與leptin結(jié)合保持較高的特異性。將所述的適配子，取0.2ug，分別置于常溫的血清、水溶液中，放置二周。通過RT-PCR檢測，發(fā)現(xiàn)二周的放置其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，沒有被降解。實施例4所述適配子疾病的診斷將14個適配子分別與12個格雷夫斯眼病患者以及正常人的血液混合30min，通過生物素分離，定量分析其中的leptin蛋白的含量，通過分析發(fā)現(xiàn)，12個格雷夫斯眼病患者中l(wèi)eptin蛋白的含量相對于正常人顯著增加2倍。以上僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所做的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。序列表〈110〉李倩〈120〉一種用于檢測眼科疾病的試劑盒及其檢測方法〈160〉15〈210〉1〈211〉76〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉leptin-1：TAGACTATCATGTGACTTCCTTAACTATATACAATTATGTCATATCTTACAAGTACTGAGTGCTCGATGCTACTAG〈210〉2〈211〉76〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉leptin-2：TAGACTATCATGTGACTTTACAAGATACATTCATCCCGCAACACACTCAACCAACTCGAGTGCTCGATGCTACTAG（SEQIDNO:2）〈210〉3〈211〉76〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉leptin-3：TAGACTATCATGTGACTTTCTACCTAATAATAACCTATACCTCCCTCAGTAATCACAGAGTGCTCGATGCTACTAG（SEQIDNO:3）〈210〉4〈211〉76〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉leptin-4：TAGACTATCATGTGACTTACCTATTAACTTGTACTCCTACAAACCCAGAACAACACAGAGTGCTCGATGCTACTAG（SEQIDNO:4）〈210〉5〈211〉76〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉leptin-5：TAGACTATCATGTGACTTTCACTGTTAACACAGATAATTAACATAACAACGTCTATAGAGTGCTCGATGCTACTAG（SEQIDNO:5）〈210〉6〈211〉76〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉leptin-6：TAGACTATCATGTGACTTAAACATCCTCCCTATACCTATCCGTATACCGCTTCCTCTGAGTGCTCGATGCTACTAG（SEQIDNO:6）〈210〉7〈211〉76〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉leptin-7：TAGACTATCATGTGACTTAACACCGCCTAATATTAATATCCCCTTCTTCATAGATCAGAGTGCTCGATGCTACTAG（SEQIDNO:7）〈210〉8〈211〉76〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉leptin-8：TAGACTATCATGTGACTTCCGACTTCATACATACTCCTCTTCATCCTGTAATCAACCGAGTGCTCGATGCTACTAG（SEQIDNO:8）〈210〉9〈211〉76〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉leptin-9：TAGACTATCATGTGACTTATATATCCTCCACTTAGATAACAATCTTCAGACACTCCAGAGTGCTCGATGCTACTAG（SEQIDNO:9）〈210〉10〈211〉76〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉leptin-10：TAGACTATCATGTGACTTCCTCCTTCTTCCTCCGATTCATCCTCAATAGATACTATTGAGTGCTCGATGCTACTAG（SEQIDNO:10）〈210〉11〈211〉76〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉leptin-11：TAGACTATCATGTGACTTTTCACGCTCAATCATAAATCTTAGAATCCAATAATTACCGAGTGCTCGATGCTACTAG（SEQIDNO:11）〈210〉12〈211〉76〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉leptin-12：TAGACTATCATGTGACTTCCGCCACTCCTCATCACATCGCCACACCCAAATTCACAAGAGTGCTCGATGCTACTAG（SEQIDNO:12）〈210〉13〈211〉76〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉leptin-13：TAGACTATCATGTGACTTCGCTCCTCTCTTGTTTACTACACATATCTTGTTATCTTAGAGTGCTCGATGCTACTAG（SEQIDNO:13）〈210〉14〈211〉76〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉leptin-14：TAGACTATCATGTGACTTACCTATTCCGCCCTCACCTTCCTCTACTAGATCATAACTGAGTGCTCGATGCTACTAG（SEQIDNO:14）〈210〉15〈211〉76〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉leptin-15：TAGACTATCATGTGACTTATAATTCTATATATATCGCACTACATCAAACGCCATAAAGAGTGCTCGATGCTACTAG（SEQIDNO:15）當(dāng)前第1頁1 2 3