本發(fā)明涉及到小分子與蛋白質(zhì)定向連接、小分子成分和檢測(cè)方法，屬于醫(yī)學(xué)免疫體外診斷領(lǐng)域。是基于均相的免疫學(xué)酶法測(cè)定。尤其涉及一種檢測(cè)方法和試劑盒的制備，特別是一種ADMA檢測(cè)試劑及其制備和檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
：不對(duì)稱二甲基精氨酸（NG,NG,dimethyl-L-arginine,asymmetricdimethylarginine，ADMA）也叫非對(duì)稱二甲基精氨酸。1970年Kakimoto首次從人類尿液中分離出不對(duì)稱二甲基精氨酸。ADMA由含有精氨酸殘基的蛋白質(zhì)在蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(proteinargininemethyltransferases,PRMT)的作用下甲基化，甲基化的蛋白水解后即可釋放出ADMA。ADMA能競(jìng)爭(zhēng)性抑制一氧化氮合酶（NOS）使一氧化氮（NO）生成減少，在體內(nèi)起內(nèi)源性NO合成抑制劑的作用，造成血管內(nèi)皮功能發(fā)生紊亂，進(jìn)而導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化等一系列的心腦血管疾病的發(fā)生發(fā)展。ADMA與腦梗死及其危險(xiǎn)因素有顯著相關(guān)性，其對(duì)缺血性腦血管病的發(fā)生率和死亡率有著強(qiáng)大的預(yù)測(cè)能力。血漿ADMA水平在心血管疾病出現(xiàn)臨床表現(xiàn)之前就已經(jīng)開始升高。因此，ADMA作為一種前瞻性，獨(dú)立的心血管病診斷指標(biāo)具有重大意義。同時(shí)ADMA水平的升高不僅能作為心腦血管疾病的先兆，還能作為心衰，高血壓，冠心病，糖尿病，腎衰肝臟衰竭，勃起功能障礙等疾病的一個(gè)重要危險(xiǎn)因子。因此，ADMA作為一種新型的內(nèi)皮功能不全和心血管疾病標(biāo)志物在臨床診斷方面具有重要意義。目前，定量測(cè)定ADMA的方法，有高效液相色譜法（HPLC），液質(zhì)聯(lián)用法（HPLC-MS），酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）、化學(xué)發(fā)光免疫分析法（CLIA）。均存在操作復(fù)雜，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，自動(dòng)化程度低，重復(fù)性較差，不利于儀器自動(dòng)化和標(biāo)準(zhǔn)化。也有報(bào)道，ADMA酶法檢測(cè)，所需反應(yīng)都在3步或以上，所需酶的種類也在3種以上，且有的關(guān)鍵酶如瓜氨酸水解酶未見公開文獻(xiàn)報(bào)道，來(lái)源途徑不明，不易獲得。增加了不確定性和不穩(wěn)定性，不容易實(shí)現(xiàn)儀器的自動(dòng)化和標(biāo)準(zhǔn)化?？笰DMA抗體的制備難度較高，存在特異性不好的缺點(diǎn)。與對(duì)稱二甲基精氨酸，甲基精氨酸以及L-精氨酸等存在較大的交叉反應(yīng)，特異性差，制備的試劑特異性差。有文獻(xiàn)報(bào)道類似ADMA這種小分子的半抗原制備方法決定了制備的抗體的特異性和親和力。小分子同載體蛋白的連接位點(diǎn)決定了制備抗體的特異性，要保證小分子的特異性抗原決定簇不在半抗原偶聯(lián)過(guò)程中被破壞。載體蛋白同半抗原合適的連接臂長(zhǎng)度能夠保證小分子的充分暴露，如果過(guò)長(zhǎng)，會(huì)大大降低小分子的免疫原性，太短，載體蛋白會(huì)影響小分子的結(jié)構(gòu)。本發(fā)明采用特異性的連接臂，通過(guò)連接位點(diǎn)的定向選擇，羧基位點(diǎn)或者氨基位點(diǎn)，充分暴露ADMA的免疫位點(diǎn)，從而獲得高親和力及高特異性的抗體。本發(fā)明還采用特異性的連接載體兔白蛋白、人白蛋白和鼠白蛋白，而不采用通用的連接載體如牛血清白蛋白，血藍(lán)蛋白和甲狀腺球蛋白等，主要是因?yàn)榕c牛血清白蛋白和甲狀腺球蛋白等耦聯(lián)的ADMA刺激產(chǎn)生的抗血清也含有針對(duì)牛血清白蛋白和甲狀腺球蛋白等的抗體，可能導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果；而血藍(lán)蛋白的分子量較大，偶聯(lián)得到的半抗原容易影響甚至屏蔽小分子的抗原表位，造成制備的抗體親和力低。而使用兔血清白蛋白做載體免疫的兔子不太可能產(chǎn)生針對(duì)兔子自身的蛋白的抗體，采用鼠血清蛋白載體篩選得到的鼠抗人ADMA特異性單克隆抗體，親和力和特異性更優(yōu)于其他載體。目前市場(chǎng)上缺乏靈敏度高、特異性強(qiáng)的不對(duì)稱二甲基精氨酸檢測(cè)試劑，尤其是適合自動(dòng)化檢驗(yàn)的試劑。本發(fā)明采用酶偶聯(lián)不對(duì)稱二甲基精氨酸復(fù)合物，與不對(duì)稱二甲基精氨酸特異性抗體免疫學(xué)反應(yīng)，形成抗原抗體復(fù)合物后，酶-ADMA復(fù)合物的活性就受到抑制。樣品中的ADMA與酶-ADMA復(fù)合物競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合抗ADMA特異性抗體。樣品中的ADMA越多，結(jié)合的抗體就越多。酶-ADMA復(fù)合物結(jié)合的抗體就越少，通過(guò)測(cè)定反應(yīng)體系中酶活性的變化,可以得到樣品中ADMA的含量。檢測(cè)速度快、操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、特異性強(qiáng)且可以在全自動(dòng)生化分析儀上實(shí)現(xiàn)對(duì)小分子物質(zhì)的高通量快速化檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)，具有較高的應(yīng)用價(jià)值。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本檢測(cè)方法基于免疫學(xué)反應(yīng)，采用均相免疫的酶學(xué)測(cè)定方法，將小分子ADMA與酶通過(guò)蛋白質(zhì)連接技術(shù)形成復(fù)合物，與樣品中的待測(cè)ADMA與抗ADMA特異性抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，通過(guò)酶活性的高低來(lái)實(shí)現(xiàn)樣品中ADMA濃度的檢測(cè)。該方法可以提供一種既安全又可快速、高效、靈敏、準(zhǔn)確檢測(cè)出待測(cè)樣本中ADMA含量的均相酶免疫檢測(cè)試劑及其制備方法。該試劑可應(yīng)用于臨床中廣泛使用的各種類型的自動(dòng)生化分析儀，從而達(dá)到大規(guī)模樣品的測(cè)定要求，提高了實(shí)用性。本發(fā)明提供了檢測(cè)ADMA的試劑盒，包含試劑R1，試劑R2，緩沖液，穩(wěn)定劑，ADMA參考標(biāo)準(zhǔn)品的液體試劑盒或包含試劑R1，試劑R2，ADMA參考標(biāo)準(zhǔn)品的干粉試劑盒。進(jìn)一步的，一個(gè)優(yōu)選的技術(shù)方案是：一種ADMA均相免疫檢測(cè)試劑，其特征在于，包括：抗ADMA特異性抗體、用于檢測(cè)抗ADMA特異性抗體-ADMA復(fù)合物的檢測(cè)試劑制備及檢測(cè)方法;上述ADMA均相免疫檢測(cè)試劑盒基于以下原理：含有ADMA的生物樣品同ADMA-G6PDH酶復(fù)合物競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抗ADMA特異性抗體；ADMA-G6PDH酶復(fù)合物與抗ADMA特異性抗體形成免疫結(jié)合物后，其催化底物葡萄糖-6-磷酸的活性降低或喪失，反應(yīng)產(chǎn)物NADH的量也降低；測(cè)定樣品中ADMA的濃度量越高，競(jìng)爭(zhēng)到的抗ADMA特異性抗體越多，抗ADMA特異性抗體對(duì)ADMA-G6PDH酶復(fù)合物的活性抑制越低，則反應(yīng)生成的NADH量越多；根據(jù)測(cè)定NADH的量計(jì)算，從而得到樣品中的ADMA含量。根據(jù)這一發(fā)明目的，進(jìn)一步的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案：其中制備ADMA免疫原用于制備抗ADMA特異性抗體。優(yōu)選的利用ADMA的羧基基團(tuán)同載體蛋白交聯(lián)，優(yōu)選的連接基團(tuán)氨基己酸；載體蛋白優(yōu)選兔白蛋白和小鼠白蛋白；免疫動(dòng)物優(yōu)選新西蘭大白兔和Balb/c小鼠；化學(xué)偶聯(lián)方式優(yōu)選碳二亞胺法；上述優(yōu)選方法制備的抗ADMA特異性抗體對(duì)ADMA親和力高，特異性好，同對(duì)稱二甲基精氨酸、單甲基精氨酸、L-精氨酸均無(wú)交叉反應(yīng)。根據(jù)這一發(fā)明目的的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中制備ADMA-酶復(fù)合物用于測(cè)定ADMA測(cè)定試劑盒。優(yōu)選的酶為葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（EC1.1.1.49）；優(yōu)選的采用ADMA氨基基團(tuán)同葡萄糖-6-磷酸脫氫酶交聯(lián)，連接基團(tuán)為氨基己酸；ADMA與葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的交聯(lián)方法優(yōu)選戊二醛法；ADMA與葡萄糖-6-磷酸脫氫酶交聯(lián)的酶活保護(hù)劑優(yōu)選葡萄糖-6-磷酸NADH；上述保護(hù)劑葡萄糖-6-磷酸優(yōu)選濃度10-100mM，NADH優(yōu)選濃度為10-100mM；采用合理的酶保護(hù)劑，優(yōu)先占據(jù)G6PDH的酶活性中心，避免ADMA-G6PDH偶聯(lián)過(guò)程中酶活中心的破壞而導(dǎo)致的酶活喪失。根據(jù)這一發(fā)明目的的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中ADMA測(cè)定試劑盒中R1試劑緩沖液優(yōu)選甘氨酸緩沖液；PH優(yōu)選4.0-8.0；葡萄糖-6-磷酸濃度優(yōu)選10-100mM；NaCl濃度優(yōu)選10-200mM；NAD+濃度優(yōu)選10-100mM；0.001%-0.01%疊氮鈉；吐溫-20濃度優(yōu)選的為0.01%-0.1%；BSA優(yōu)選的為0.1%-0.5%；抗ADMA抗體優(yōu)選的為0.01-2%。根據(jù)這一發(fā)明目的的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中ADMA測(cè)定試劑盒中R2試劑緩沖液優(yōu)選TRIS緩沖液；PH優(yōu)選7.0-9.0。根據(jù)這一發(fā)明目的的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中R2的穩(wěn)定劑是0.2%-0.5%牛血清白蛋白，5%-20%甘油，1%-5%甘露醇，0.001%-0.01%疊氮鈉，0.1-2mMEDTA，0.1%-1%PEG20000。根據(jù)這一發(fā)明目的的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中所述的ADMA標(biāo)準(zhǔn)品為添加了ADMA純品人血清或其它類似血清基質(zhì)的液體。優(yōu)選地，選擇添加了ADMA純品的人血清的液體。根據(jù)這一發(fā)明目的的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，利用不對(duì)稱二甲基精氨酸免疫檢測(cè)試劑的檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟:1)將持測(cè)樣本與抗ADMA特異性抗體接觸；2)根據(jù)待測(cè)樣本中ADMA與抗ADMA特異性抗體的結(jié)合情況；優(yōu)選利用自動(dòng)分析儀測(cè)定NADH產(chǎn)生速率，判斷樣本中ADMA的含量;所述待測(cè)樣本為血清、血漿、唾液或尿液。本發(fā)明和已有技術(shù)比較，其技術(shù)進(jìn)步是顯著的。本發(fā)明中通過(guò)蛋白質(zhì)定向連接技術(shù)所獲得的ADMA免疫原特異性強(qiáng)、免疫原性高。通過(guò)載體蛋白的優(yōu)選，采用兔白蛋白定向偶聯(lián)ADMA小分子，獲得抗ADMA多克隆抗體。采用鼠白蛋白定向偶聯(lián)ADMA小分子，獲得抗ADMA單克隆抗體。所制備出的抗ADMA特異性抗體特異性強(qiáng)、親和力高。本發(fā)明通過(guò)將載體蛋白與ADMA羧基和氨基位點(diǎn)的定向選擇性連接，同時(shí)中間加入連接臂，大大提高了ADMA抗體的特異性識(shí)別能力，與結(jié)構(gòu)類似的對(duì)稱二甲基精氨酸、單甲基精氨酸、精氨酸無(wú)交叉反應(yīng)。并且ADMA半抗原的合成和ADMA酶復(fù)合物的制備采用ADMA上不同的連接位點(diǎn)，制備的ADMA均相酶免測(cè)定試劑具有很高的特異性。含有上述抗ADMA特異性抗體的均相酶免疫檢測(cè)試劑可以方便、快速、準(zhǔn)確地確定樣品中的ADMA含量，本試劑為液體雙試劑，可用于檢測(cè)血清或血漿中ADMA的濃度，適用于臨床全自動(dòng)生化分析儀。附圖說(shuō)明圖1：ADMA免疫原結(jié)構(gòu)圖；圖2：ADMA衍生物1的合成路徑；圖3：ADMA衍生物2的合成路徑；圖4：ADMA均相酶免疫反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；圖5：ADMA均相酶免疫相關(guān)性分析圖。具體實(shí)施方式實(shí)施例一：ADMA衍生物1的合成及其結(jié)構(gòu)確認(rèn)以下實(shí)施例中使用的ADMA衍生物1的生物化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖2中的化合物3所示，合成路線如圖2。具體合成步驟：1)稱取900mg化合物1（ADMA）溶解于90ml吡啶中，立即加入360mgEDC(1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimidehydrochloride)和540mgNHS（N-hydroxysuccinimide），將此溶液在室溫下攪拌30小時(shí)，得到化合物2的合成溶液；2）向上述溶液中加入126ul的β-巰基乙醇，室溫?cái)嚢?0min，滅活過(guò)量的EDC，脫鹽至pH7.2的PBS中；3）取15.00g的氨基己酸溶于10mLpH7.2的PBS溶液，取50mL上述合成溶液緩慢滴加到氨基己酸的溶液中，室溫?cái)嚢?，滴加完成后繼續(xù)室溫反應(yīng)2h。合成溶液用水稀釋后再用乙酸乙酯（EtOAc）萃取，使用水和鹵水沖洗有機(jī)層，使用Na2SO4干燥，通過(guò)減壓方法使溶劑蒸發(fā)，最后得到白色固體化合物3。對(duì)上述白色固體純化產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定利用色譜/質(zhì)譜技術(shù)(LCMS)對(duì)得到的衍生物進(jìn)行分析鑒定，采用安捷倫公司的串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜儀LC/MSD1200系列，離子源采用正離子或負(fù)離子化模式。色譜柱規(guī)格為:SymmetryC18(70×4.6mm,5μm)，柱溫為30℃，流速為0.6mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為224nm，流動(dòng)相為10-70%乙腈。LCMS結(jié)果顯示：純度>95%；保留時(shí)間3.012min。上述結(jié)果，可以確定該白色固體化合物為上述的ADMA衍生物1。實(shí)施例二：ADMA衍生物2的合成及其結(jié)構(gòu)確認(rèn)以下實(shí)施例中使用的ADMA衍生物2的生物化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖3中的化合物8所示，其合成路線如如圖3。具體合成路線如下：1）稱取100mg的ADMA溶于濃硫酸中，加入1200mg甲醇，加熱回流2h。合成溶液用水稀釋后，通過(guò)減壓方法使溶劑蒸發(fā)，最后得到白色固體化合物4；2)稱取500mg化合物5（氨基己酸）溶解于50ml吡啶中，立即加入400mgEDC(1-ethyl-3-3-dimethylaminopropyl]carbodiimidehydrochloride)和600mgNHS（N-hydroxysuccinimide），將此溶液在室溫下攪拌30小時(shí)，得到化合物6的合成溶液；3）向上述溶液中加入90ul的β-巰基乙醇，室溫?cái)嚢?0min，滅活過(guò)量的EDC，脫鹽至pH7.2的PBS中；4）50mg的化合物4溶于5mLpH7.2的PBS溶液，向其中緩慢滴加50mL上述化合物6合成溶液，室溫?cái)嚢?，滴加完成后繼續(xù)室溫反應(yīng)2h。合成溶液用水稀釋后再用乙酸乙酯（EtOAc）萃取，使用水和鹵水沖洗有機(jī)層，使用Na2SO4干燥，通過(guò)減壓方法使溶劑蒸發(fā)，最后得到白色固體化合物7；5)50mg化合物7溶解在5mLDMF中，加入5ml甲醇，1g的NaOH，加熱反應(yīng)2小時(shí)，得到合成溶液；6）將上述合成溶液用水稀釋后再用乙酸乙酯（EtOAc）萃取，使用水和鹵水沖洗有機(jī)層，使用Na2SO4干燥，通過(guò)減壓方法使溶劑蒸發(fā)，最后得到白色固體化合物8。對(duì)上述白色固體純化產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定利用色譜/質(zhì)譜技術(shù)(LCMS)對(duì)得到的衍生物進(jìn)行分析鑒定，采用安捷倫公司的串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜儀LC/MSD1200系列，離子源采用正離子或負(fù)離子化模式。色譜柱規(guī)格為:SymmetryC18(70×4.6mm,5μm)，柱溫為25℃，流速為0.6mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為224nm，流動(dòng)相為10-70%乙腈。LCMS結(jié)果顯示：純度>95%；保留時(shí)間2.336min。上述結(jié)果，可以確定該白色固體化合物8即為ADMA衍生物2。實(shí)施例三：ADMA免疫原合成ADMA免疫原由兔白蛋白或小鼠白蛋白與圖1所示的ADMA衍生物的連接基團(tuán)連接而成，在本實(shí)施例中，以連接臂為氨基己酸的ADMA衍生物為例詳細(xì)說(shuō)明該免疫原的合成方法。兔白蛋白-ADMA羧基衍生物A1免疫原合成：具體步驟如下：1）將40mg兔白蛋白溶解于4mL0.1MpH5.0的MES緩沖液中，上述溶液置于燒杯A中；2）將30mgADMA衍生物1溶于6mL0.1MpH5.0的MES緩沖液中，加入到燒杯A中；3）加入50mgEDC到燒杯A中，得到混合溶液，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)2小時(shí)；將上述攪拌后的混合溶液經(jīng)過(guò)中性PBS緩沖液透析純化，得到兔白蛋白-ADMA免疫原，儲(chǔ)存于-70℃。鼠白蛋白-ADMA羧基衍生物A1免疫原合成：具體步驟如下：1）將40mg鼠白蛋白溶解于4mL0.1MpH5.0的MES緩沖液中，上述溶液置于燒杯A中；2）將30mgADMA衍生物1溶于6mL0.1MpH5.0的MES緩沖液中，加入到燒杯A中；3）加入50mgEDC到燒杯A中，得到混合溶液，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)2小時(shí)；將上述攪拌后的混合溶液經(jīng)過(guò)中性PBS緩沖液透析純化，得到鼠白蛋白-ADMA免疫原，儲(chǔ)存于-70℃。類似的，當(dāng)ADMA衍生物為甘氨酸、賴氨酸、氨基己酸，以及連接基團(tuán)-(CH2)n-O-CH2-COO-時(shí)，用同樣的方法可以制備出如式1所示的ADMA免疫原。當(dāng)然，載體仍為具有免疫原性的蛋白質(zhì)。本發(fā)明僅公開了連接基團(tuán)為氨基己酸的不對(duì)稱二甲基精氨酸衍生物的合成實(shí)施例并進(jìn)行了相關(guān)后續(xù)實(shí)驗(yàn)，連接基團(tuán)主要起小分子衍生物與載體的連接作用，但是不同長(zhǎng)度連接臂對(duì)ADMA結(jié)構(gòu)暴露程度不同；免疫原性強(qiáng)弱與所合成的ADMA衍生物分子結(jié)構(gòu)及所選載體種類有關(guān)，并且不同的載體類型對(duì)小分子的結(jié)構(gòu)影響也不同，另外使用不同的連接臂制備出的抗原，相應(yīng)制備的特異性抗體均具有不同的性能。實(shí)施例四：ADMA-葡萄糖-6-磷酸脫氫酶復(fù)合物的制備本發(fā)明實(shí)例中，制備ADMA-G6PDH酶復(fù)合物由ADMA衍生物2（實(shí)施例一中）同G6PDH酶偶聯(lián)得到，不同于本發(fā)明實(shí)施例三中合成ADMA免疫原所用到的ADMA衍生物1。大量文獻(xiàn)及試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，在制備小分子多克隆抗體時(shí)候，會(huì)產(chǎn)生一部分抗體是識(shí)別載體蛋白與小分子的連接處的，因此這部分抗體能夠同小分子免疫原結(jié)合，但是卻不能識(shí)別測(cè)定樣品中的小分子，因此會(huì)大大影響小分子免疫檢測(cè)試劑的性能，而利用小分子不同的位點(diǎn)進(jìn)行免疫原和酶偶聯(lián)物的制備則可以避免該問題發(fā)生。戊二醛法制備ADMA-葡萄糖-6-磷酸脫氫酶復(fù)合物1）稱取20mg規(guī)格為300KU的G6PDH，室溫溶解于5ml含有0.1MMES、3mMMgCl2、100mgNADH、150mg葡萄糖-6-磷酸（G-6-P）和0.9%NaCl的溶液中，該溶液pH=8.0；2）稱取30mg的ADMA衍生物2，溶于1mL的二甲基亞砜；3)將ADMA衍生物2溶液同G6PDH溶液混合；4）緩慢滴加1%的戊二醛60ul；5）加入10mL的PBS，并繼續(xù)攪拌反應(yīng)2h；6)純化產(chǎn)物。通過(guò)透析純化連接產(chǎn)物，獲得的最終產(chǎn)物為葡萄糖-6-磷酸脫氫酶-ADMA酶復(fù)合物，于2-8℃下儲(chǔ)存。實(shí)施例五：ADMA免疫檢測(cè)試劑的制備ADMA均相酶免疫檢測(cè)試劑，包括：上述抗ADMA特異性抗體、用于檢測(cè)抗ADMA特異性抗體-ADMA復(fù)合物的酶試劑，包括：ADMA-G6PDH酶復(fù)合物和酶的底物。ADMA均相酶免疫檢測(cè)試劑在使用之前，為了避免酶試劑中的酶復(fù)合物和酶的底物發(fā)生反應(yīng)，酶復(fù)合物和酶的底物是分開放置的，不混合，所以將酶的底物與上述抗ADMA特異性抗體混合在一起。也就是說(shuō)，ADMA均相酶免疫檢測(cè)試劑包括兩種分開設(shè)置的試劑，具體如下:試劑R1的制備：20mMNAD，30mM葡萄糖-6-磷酸G6P、100mMpH=6.0的甘氨酸緩沖液溶解制成均相酶底物；加入0.1%-1%的抗ADMA特異性單克隆抗體到上述均相酶底物中，在本實(shí)施例中具體比例為0.5%；加入0.2%BSA、0.01%Twen20、0.01%疊氮鈉；試劑R2的制備：0.1M、pH=9的Tris緩沖液中加入0.01%-1%制備的ADMA-G6PDH酶復(fù)合物，在本實(shí)施例中具體比例為0.05%；加入0.2%BSA、2%甘油、1mMEDTA、0.1%PEG20000、疊氮鈉0.01%。上述ADMA免疫檢測(cè)試劑的使用方法，包括以下步驟:1)將持測(cè)樣本與抗ADMA特異性抗體接觸;2)根據(jù)待測(cè)樣本中ADMA與抗ADMA特異性抗體的結(jié)合情況，利用酶試劑判斷樣本中ADMA的含量;具體的，檢測(cè)時(shí)，將待測(cè)樣本加到試劑R1中，待測(cè)樣本中的ADMA與試劑A中的抗ADMA特異性抗體發(fā)生特異性結(jié)合，生成抗ADMA特異性抗體-ADMA復(fù)合物;再加入試劑R2，此時(shí)試劑R2中的ADMA-G6PDH酶復(fù)合物與試劑R1中抗ADMA特異性抗體發(fā)生特異性結(jié)合，未與抗ADMA特異性抗體結(jié)合的ADMA-G6PDH酶復(fù)合物與底物混合、接觸，發(fā)生酶促反應(yīng)，構(gòu)成檢測(cè)抗ADMA特異性抗體-ADMA復(fù)合物的酶試劑，酶試劑根據(jù)待測(cè)樣本中ADMA上述抗ADMA特異性抗體的結(jié)合情況判斷待測(cè)樣本中ADMA的含量。由于ADMA-G6PDH酶復(fù)合物與待測(cè)樣本中的ADMA競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合抗ADMA特異性抗體，所以，待測(cè)樣本中ADMA的量越多，均相酶溶液中游離的ADMA-G6PDH酶復(fù)合物的量越多，酶促反應(yīng)越快，導(dǎo)致OD340上升。上述待測(cè)樣本為生理樣本，例如血清、血漿、尿液、唾液等。作為一種優(yōu)選的方案，上述待測(cè)樣本為血清或血漿。實(shí)施例六：不對(duì)稱二甲基精氨酸均相酶免疫檢驗(yàn)1、獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線：設(shè)置日立7060全自動(dòng)生化分析儀反應(yīng)參數(shù)(見表1)。操作過(guò)程為：先加試劑R1，再加入標(biāo)準(zhǔn)品，37度孵育5min，最后加入試劑R2。加入試劑R2后，測(cè)定不同時(shí)間點(diǎn)的OD340吸光值，算出不同標(biāo)準(zhǔn)品濃度時(shí)的反應(yīng)速率，得到較理想的反應(yīng)曲線如圖4所示。表1日立7060全自動(dòng)生化分析儀反應(yīng)參數(shù)項(xiàng)目名稱ADMA試劑R11600ul試劑R240ul樣本量15ul分析方法兩點(diǎn)速率法主波長(zhǎng)340nm副波長(zhǎng)405nm反應(yīng)時(shí)間15min孵育時(shí)間5min反應(yīng)方向向上定標(biāo)方法Spline校準(zhǔn)品濃度0、0.63、1.25、2.50、5.00、10.00μmol/L2、樣本的測(cè)定、精密度和回收率評(píng)估通過(guò)本發(fā)明的均相酶免疫檢測(cè)試劑得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線，重復(fù)測(cè)定低、中、高濃度質(zhì)控樣本10次，本實(shí)例中，質(zhì)控樣本為ADMA標(biāo)準(zhǔn)品溶解在人血清中，濃度至分別為0.63、2.50、10.00μmol/L，結(jié)果如表2所示。表2ADMA均相酶免試劑的分析性能評(píng)價(jià)檢測(cè)結(jié)果表明：本發(fā)明制備的ADMA均相酶免試劑精密度高，CV<6%，準(zhǔn)確度高，回收率在95%-105%之間。實(shí)施例七：干擾物試驗(yàn)內(nèi)源性的L-精氨酸（L-arg）、單甲基精氨酸（MMA）、對(duì)稱二甲基精氨酸（SDMA）、膽酸(CA)和鵝去氧膽酸（CD-CA）是影響ADMA準(zhǔn)確測(cè)定的幾種重要干擾物。用本發(fā)明中的ADMA均相酶免試劑測(cè)定上述三種干擾物，結(jié)果見表3表3干擾物試驗(yàn)化合物名稱測(cè)試濃度交叉反應(yīng)率ADMA10μmol/L100%L-精氨酸100μmol/L<0.01%單甲基精氨酸100μmol/L<0.01%對(duì)稱二甲基精氨酸100μmol/L<0.09%膽酸100μmol/L<0.05%鵝去氧膽酸100μmol/L<0.08%檢測(cè)結(jié)果說(shuō)明上述干擾物的交叉反應(yīng)率均小于0.1%，表明本發(fā)明制備的ADMA均相酶免試劑能夠準(zhǔn)確測(cè)定ADMA的含量。實(shí)施例八：相關(guān)性分析將本發(fā)明的ADMA均相酶免測(cè)定試劑與高效液相色譜法測(cè)定人血清中ADMA方法比較，結(jié)果見表4。表4ADMA均相酶免測(cè)定同高效液相色譜測(cè)定結(jié)果相關(guān)性分析相關(guān)性曲線見圖5，可見二者擬合良好。需要說(shuō)明的是，以上所述僅為本發(fā)明的實(shí)施例，并非因此限制本發(fā)明的專利范圍，凡是利用本發(fā)明說(shuō)明書及附圖內(nèi)容所做的等效結(jié)構(gòu)或等效流程變換，或直接或間接運(yùn)用在其他相關(guān)
技術(shù)領(lǐng)域：
，均同理包括在本發(fā)明的專利保護(hù)范圍內(nèi)。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3