本發(fā)明屬于微生檢測技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

血清淀粉樣蛋白A(serum amyloid A protein , SAA)是一種急性時相反應(yīng)蛋白, 屬于載脂蛋白家族中的異質(zhì)類蛋白質(zhì), 相對分子質(zhì)量約為12 000，存在于脊椎動物中，主要由肝細胞合成。SAA是一個多態(tài)性的蛋白的總稱，由相關(guān)但各自獨立蛋白的基因（SAA1-SAA4）組成，是脊椎動物的主要急性反應(yīng)蛋白。血清淀粉樣蛋白A1（SAA1）由104個氨基酸組成，SAA1和SAA2有7個氨基酸的差別，它們均為急性期蛋白,其中主要的是SAA1，在炎癥反應(yīng)中起到的作用相似。SAA3基因由于在第3個外顯子(第41個密碼子處)有1個堿基插入，產(chǎn)生編碼位移，導(dǎo)致在第43個密碼子處產(chǎn)生翻譯終止信號，屬于假基因。SAA4在急性期反應(yīng)不大，出于一個動態(tài)平衡狀態(tài)。

研究表明，SAA1在急性和慢性炎癥患者血清中含量均有變化。SAA1不僅是慢性阻塞性肺病急性加重期的生物標志物，也是急性心梗、冠心病患者的病情診斷和預(yù)后估計具有重要的參考價值。大量的研究表明，在胰腺炎、肝炎、糖尿病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和慢性腎臟疾病病例中，SAA1含量的升高與疾病活動和病程發(fā)展有非常密切的關(guān)系。目前臨床研究表明，所有急性期反應(yīng)蛋白中，SAA1對急性炎癥反應(yīng)最敏感，升值幅度最大。研究表明，在肝癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、子宮內(nèi)膜癌等多種腫瘤患者體內(nèi)SAA1均有不同程度升高，且其水平與腫瘤的活動期、惡性程度及侵襲轉(zhuǎn)移有明顯的相關(guān)性，反映腫瘤患者的療效及預(yù)后 。

在急性時相反應(yīng)中, 經(jīng)白細胞介素(interleukin, IL)-1、IL-6和腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)刺激, SAA在肝臟中由被激活的巨噬細胞和纖維母細胞合成, 可升高到最初濃度的100～1000倍。與C反應(yīng)蛋白 (C reactive protein, CRP) 類似, SAA是反映感染性疾病早期炎癥的敏感指標, 有助于診斷炎癥、評估其活性、監(jiān)控其活動及治療。研究表明在病毒感染性急性期, SAA水平明顯升高, 而CRP升高并不明顯, 因此SAA是判斷病毒感染靈敏而可靠的指標。SAA和CRP聯(lián)合檢測有助于患者細菌感染和病毒感染的鑒別診斷。另外, SAA在診斷病毒感染、腎移植排斥反應(yīng)患者(特別是進行免疫抑制治療的患者)以及用腎上腺皮質(zhì)激素治療的囊性纖維化患者方面比CRP更敏感。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是：提供一種血清淀粉樣蛋白A1的膠體金檢測卡及其制備方法，它能夠定量、快速、成本低地檢測血液中SAA1的含量。

本發(fā)明的技術(shù)方案是：包括PVC 底板，依次粘帖在PVC底板上的樣品墊、金標結(jié)合墊、帶有檢測線和質(zhì)控線的硝酸纖維素膜、吸收墊。

金標結(jié)合墊包被有純化的SAAl 抗體與膠體金的偶聯(lián)標記物，硝酸纖維素膜上平行設(shè)有一條包被有SAA1單克隆抗體的SAA1檢測線和一條包被有羊抗鼠IgG多克隆抗體的質(zhì)控線。

本發(fā)明的制備方法是：

步驟一、血清淀粉樣蛋白A1抗體與膠體金的偶聯(lián)標記物的制備：逐級稀釋法確定人血清淀粉樣蛋白A1抗體與膠體金溶液的用量比例為4.4ug～4.8ug:1ml。

按照此用量比例逐滴加入純化的血清淀粉樣蛋白A1抗體，再加入終濃度為1％的牛血清白蛋白，攪拌后獲得血清淀粉樣蛋白A1抗體與膠體金的偶聯(lián)標記物，采用低溫超速離心法對該偶聯(lián)標記物進行純化；

步驟二、試紙條的組裝：采用噴金儀將血清淀粉樣蛋白A1抗體與膠體金的偶聯(lián)標記物噴在玻璃纖維素膜上，室溫37℃條件下自然干燥，密封，獲得金標結(jié)合墊；采用劃膜儀將純化的SAA1單克隆抗體、羊抗鼠IgG 分別劃膜于硝酸纖維素膜上的檢測線和質(zhì)控線上；將處理好的樣品墊、金標結(jié)合墊、硝酸纖維素膜依次粘帖在PVC 底板上，切條、組裝、密封，獲得血清淀粉樣蛋白A1膠體金檢測試紙條，室溫保存。

進一步的，所述膠體金溶液采用檸檬酸三鈉還原法制備：取1％氯金酸溶液1ml，加入99ml 的超純水配置成終濃度為0.01％的氯金酸溶液，加熱至沸騰后，加入1％檸檬酸三鈉1ml 并繼續(xù)加熱，溶液由淡黃色轉(zhuǎn)為藍黑色最終變?yōu)榫萍t色，顏色穩(wěn)定后繼續(xù)加熱10分鐘，室溫冷卻，獲得膠體金溶液，4℃保存?zhèn)溆?，膠體金顆粒直徑為40nm。

進一步的，步驟一中，述逐級稀釋法確定血清淀粉樣蛋白A1抗體與膠體金溶液的用量比例的具體過程如下：用0.1mol/L 的碳酸鹽溶液調(diào)節(jié)膠體金溶液的PH 值為8.5，向11 支離心管中分別加入1ml 膠體金溶液；將血清淀粉樣蛋白A1抗體逐級稀釋后即含量分別為1ug、2ug、4ug、8ug、10ug、12ug、14ug、16ug、18ug、20ug，按照上述順序加入到2 號管至11 號管中，并與離心管中的膠體金溶液混勻，10分鐘后在2 號管至11 號管中分別加入10％的氯化鈉溶液1ml 混勻，室溫靜置2小時以上觀察結(jié)果，1 號管為空白對照；

2號、3號、9號管至11號管中，出現(xiàn)由紅變藍的聚沉現(xiàn)象，4號管至8號管中，保持膠體金的紅色不變；因此，膠體金紅色不變且血清淀粉樣蛋白A1抗體加入量最低的離心管即4號管中的血清淀粉樣蛋白A1抗體含量，即為穩(wěn)定1ml 膠體金溶液所需的最低穩(wěn)定量，在該最低穩(wěn)定量的基礎(chǔ)上再加上10％～ 20％即為穩(wěn)定1ml 膠體金溶液所需的血清淀粉樣蛋白A1抗體1的實際使用量，即血清淀粉樣蛋白A1抗體與膠體金溶液的用量比例為：4.4ug～4.8ug:1ml。

進一步的，步驟一中，采用低溫超速離心法對該偶聯(lián)標記物進行純化的具體過程如下：首先將體積為V 的血清淀粉樣蛋白A1抗體在4℃下以3000rpm/min 離心30 分鐘，吸取上清液，棄沉淀；再將上清液在4℃下以10000rpm/min 離心30 分鐘，棄去上清，用0.01mol/L、pH7.4 的PBS 緩沖液溶解沉淀至原體積即血清淀粉樣蛋白A1抗體的體積V，穩(wěn)定后過夜：4℃下，再以10000rpm/min 離心40 分鐘，棄上清，用0.01mol/L pH7.4 的PBS 緩沖液溶解沉淀至原體積即血清淀粉樣蛋白A1抗體的體積V 的1/10，獲得純化的血清淀粉樣蛋白A1抗體，4℃保存?zhèn)溆茫凰鯬BS 緩沖液中含有1％ BSA 和0.02％疊氮鈉。

本發(fā)明的有益效果是：將酶聯(lián)免疫原理與膠體金層析技術(shù)結(jié)合，制備檢測血清淀粉樣蛋白A1的膠體金檢測試紙條并擬應(yīng)用于臨床，具有操作簡單快速、檢測結(jié)果清楚易于判斷、特異性強、敏感性高、無需儀器設(shè)備等優(yōu)點，因此，非常適用于現(xiàn)場、門診等實驗條件有限的場所進行臨床樣品檢測。本發(fā)明提供了上述試紙條的制備方法，適用于工業(yè)生產(chǎn)。

附圖說明

圖1 為本發(fā)明的血清淀粉樣蛋白A1膠體金檢測試紙條的結(jié)構(gòu)示意圖。

圖2 為本發(fā)明的血清淀粉樣蛋白A1膠體金檢測試紙條陽性結(jié)果判定示意圖。

圖3 為本發(fā)明的血清淀粉樣蛋白A1膠體金檢測試紙條陰性結(jié)果判定示意圖。

圖4為本發(fā)明的血清淀粉樣蛋白A1膠體金檢測試紙條無效結(jié)果判定示意圖。

具體實施方式

圖中：1是PVC 底板，2是樣品墊，3是金標結(jié)合墊，4是硝酸纖維素膜，5是檢測線，6是質(zhì)控線，7是吸收墊。

本發(fā)明的血清淀粉樣蛋白A1膠體金檢測試紙條，包括PVC底板1、樣品墊2、金標結(jié)合墊3、帶有檢測線5和質(zhì)控線6的硝酸纖維素膜4和吸收墊7，樣品墊2、金標結(jié)合墊3、帶有檢測線5和質(zhì)控線6的硝酸纖維素膜4、吸收墊7依次粘帖在PVC底板1上，金標結(jié)合墊3包被有純血清淀粉樣蛋白A1膠體金的偶聯(lián)標記物，硝酸纖維素膜4上的檢測線5包被血清淀粉樣蛋白A1的單克隆抗體，硝酸纖維素膜4上的質(zhì)控線6 包被有羊抗鼠IgG。

本發(fā)明的血清淀粉樣蛋白A1膠體金檢測試紙條的使用方法如下：

1、用毛細玻璃管采血1～2滴，待血清自然析出后折斷毛細玻璃管使血清( 或血液) 自然流出到干凈的玻璃板上，用移液器取5ul 樣品用于檢測。

2、將吸取的5ul 樣品加入試紙條的樣品孔前端，隨之滴加兩滴稀釋液于樣品孔中，3～10 分鐘即可顯示結(jié)果，10分鐘時讀取結(jié)果。

結(jié)果判斷如圖2 所示：

1、陽性：在檢測線5 和質(zhì)控線6 處各出現(xiàn)一條紅色條帶，判定為陽性；檢測線5 條帶色澤的深淺依檢測樣品中血清淀粉樣蛋白A1效價的高低而變化，效價越高色帶越深，反之越淺。

2、陰性：在質(zhì)控線6 出現(xiàn)一條紅色條帶，檢測線5未出現(xiàn)紅色條帶，說明檢測樣品中血清淀粉樣蛋白A1存在。

3、無效：僅在檢測線5 有條帶或在檢測線5 和質(zhì)控線6 均無明顯條帶出現(xiàn)，視為試紙條檢測無效。

以下結(jié)合實施例和附圖對本發(fā)明做進一步詳細說明。

實施例1

一、膠體金溶液的制備

采用檸檬酸三鈉還原法制備：：取1％氯金酸溶液1ml，加入99ml 的超純水配置成終濃度為0.01％的氯金酸溶液，加熱至沸騰后，加入1％檸檬酸三鈉1ml 并繼續(xù)加熱，溶液由淡黃色轉(zhuǎn)為藍黑色最終變?yōu)榫萍t色，顏色穩(wěn)定后繼續(xù)加熱10分鐘，室溫冷卻后4℃保存?zhèn)溆?，獲得膠體金溶液。吸取少量膠體金顆粒用透射電鏡觀察，膠體金顆粒大小基本一致，分布均勻，直徑約40nm 方為合格。

二、 血清淀粉樣蛋白A1抗體與膠體金的偶聯(lián)標記物( 金標血清淀粉樣蛋白A1抗體) 的制備

(1) 逐級稀釋法確定血清淀粉樣蛋白A1抗體與膠體金溶液的用量比例：用0.1mol/L 的碳酸鹽溶液調(diào)節(jié)膠體金溶液的PH 值為8.5，取11 支潔凈的離心管，編號為1號管至11 號管，每管加入膠體金溶液1ml ；將血清淀粉樣蛋白A1抗體逐級稀釋后( 由1ug 稀釋至20ug，即血清淀粉樣蛋白A1抗體含量分別為1ug、2ug、4ug、8ug、10ug、12ug、14ug、16ug、18ug、20ug)，按照逐級稀釋順序加入到2號管至11號管中，并與離心管中的膠體金溶液混勻，5 分鐘后在2號管至11號管中分別加入10％的氯化鈉溶液1ml混勻，室溫靜置2 小時以上觀察結(jié)果，1號管為空白對照管。

血清淀粉樣蛋白A1抗體加入量不足以穩(wěn)定膠體金的離心管(2號、3號、9號管至11號管)，即出現(xiàn)由紅變藍的聚沉現(xiàn)象，而血清淀粉樣蛋白A1抗體加入量達到或超過最低穩(wěn)定量的離心管(4號管至8號管)，則保持膠體金的紅色不變。因此，膠體金紅色不變且血清淀粉樣蛋白A1抗體加入量最低的離心管(3號管) 中的血清淀粉樣蛋白A1抗體含量(4ug)，即為穩(wěn)定1ml 膠體金溶液所需的最低穩(wěn)定量，在該最低穩(wěn)定量的基礎(chǔ)上再加上10％～20％即為穩(wěn)定1ml 膠體金溶液所需的血清淀粉樣蛋白A1抗體的實際使用量，即血清淀粉樣蛋白A1抗體與膠體金溶液的用量比例為：4.4ug～4.8ug:1ml。

(2) 用0.1mol/L 碳酸鉀溶液調(diào)節(jié)膠體金溶液的PH 值為8.5，在磁力攪拌下，按照上述確定的血清淀粉樣蛋白A1抗體與膠體金溶液的用量比例(4.4ug～ 4.8ug:1ml)向膠體金溶液中逐滴加入血清淀粉樣蛋白A1抗體，繼續(xù)攪拌20分鐘，加入終濃度為1％的牛血清白蛋白(BSA)，再攪拌15 分鐘，獲得血清淀粉樣蛋白A1抗體與膠體金的偶聯(lián)標記物即金標血清淀粉樣蛋白A1抗體，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(3) 金標血清淀粉樣蛋白A1抗體的純化

采用低溫超速離心法純化金標血清淀粉樣蛋白A1抗體，以去除溶液中未標記的血清淀粉樣蛋白A1抗體和未充分標血清淀粉樣蛋白A1抗體記的膠體金以及在標記中可能形成的各種聚合物。首先將金標血清淀粉樣蛋白A1抗體(體積為V)在4℃下，以3000rpm/min 低速離心30分鐘，小心吸取上清液，棄去沉淀；再將上清液在4℃下，以10000rpm/min 離心30分鐘，棄去上清，用0.01mol/L、pH7.4的PBS 緩沖液( 內(nèi)含1％ BSA 和0.02％疊氮鈉) 溶解沉淀至原體積(指的是金標血清淀粉樣蛋白A1抗體的體積V)，充分穩(wěn)定后過夜：4℃下，再以10000rpm/min 離心40分鐘，棄去上清，用0.01mol/L、pH7.4的PBS 緩沖液( 內(nèi)含1％ BSA 和0.02％疊氮鈉) 溶解沉淀至原體積( 指的是金標血清淀粉樣蛋白A1抗體的體積V) 的1/10，獲得純化的金標血清淀粉樣蛋白A1抗體，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

三、試紙條的組裝

(1) 采用噴金儀 將血清淀粉樣蛋白A1抗體與膠體金的偶聯(lián)標記物噴在玻璃纖維素膜上，血清淀粉樣蛋白A1抗體與膠體金的偶聯(lián)標記物為4.4ug ～4.8ug:1ml，室溫37℃條件下自然干燥，密封，獲得金標結(jié)合墊3，4℃保存?zhèn)溆茫?/p>

(2) 采用劃膜儀將血清淀粉樣蛋白A1的單克隆抗體、羊抗鼠IgG分別劃膜于硝酸纖維素膜4上的檢測線5 和質(zhì)控線6上，血清淀粉樣蛋白A1的單克隆抗體、羊抗鼠IgG的標記量分別1.2μg/cm、2μg/cm，室溫條件下自然干燥，密封，獲得帶有檢測線5(包被血清淀粉樣蛋白A1的單克隆抗體)和質(zhì)控線6(包被有羊抗鼠IgG)的硝酸纖維素膜4，4℃保存?zhèn)溆茫?/p>

(3) 將上述處理好的樣品墊2、金標結(jié)合墊3、帶有檢測線5 和質(zhì)控線6 的硝酸纖維素膜4、吸收墊7 等材料依次粘帖在PVC底板1 上，切條、組裝、密封，獲得本發(fā)明的血清淀粉樣蛋白A1膠體金檢測試紙條，室溫保存?zhèn)溆?。組裝后的試紙條如圖1所示。

四、 重復(fù)性試驗

(1) 組內(nèi)重復(fù)性檢測：

用同一批次的本發(fā)明的試紙條檢測血清淀粉樣蛋白A1陰性血清、血清淀粉樣蛋白A1陽性血清各30 份樣本( 三次重復(fù)試驗)。結(jié)果顯示，本發(fā)明的試紙條檢測的陰性、陽性結(jié)果分別為30 例，這表明本發(fā)明的試紙條具有良好的重復(fù)性。

(2) 組間重復(fù)性檢測：

用3個不同批次的本發(fā)明的試紙條檢測血清淀粉樣蛋白A1陰性血清、血清淀粉樣蛋白A1陽性血清各30 份樣本( 三次重復(fù)試驗)。結(jié)果顯示，每個批次試紙條檢測的陰性、陽性結(jié)果分別為30 例，再次表明本發(fā)明的試紙條具有良好的重復(fù)性。