本發(fā)明涉及一種金-上轉(zhuǎn)換納米粒子三聚體的制備方法及其應(yīng)用，屬于分析化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

甲胎蛋白（α-fetoprotein，AFP），是一種致癌糖蛋白，是診斷原發(fā)性肝癌的特異性腫瘤標(biāo)志物，具有確立診斷、早期診斷、鑒別診斷的作用。大量的臨床發(fā)現(xiàn)，70%-95% 的原發(fā)性肝癌患者的AFP 升高。粘蛋白-1（Mucin-1）發(fā)生在許多腺癌，包括胰腺癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌和其它組織。粘蛋白也過(guò)度表達(dá)在肺疾病，如哮喘、支氣管炎、慢性阻塞性肺病或囊性纖維化。Mucin-1正診斷標(biāo)記為惡性腫瘤和其他疾病過(guò)程中，通常會(huì)過(guò)度或錯(cuò)誤表達(dá)。

傳統(tǒng)檢測(cè)癌癥標(biāo)志物的方法有：酶聯(lián)免疫法、電化學(xué)和基于儀器的液質(zhì)聯(lián)用、高效液相色譜等。酶聯(lián)免疫法檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物時(shí)，因蛋白質(zhì)容易熱變性，所以很難檢測(cè)蛋白類腫瘤標(biāo)志物，另外酶聯(lián)免疫法的靈敏度較低，而且耗力耗時(shí)；電化學(xué)對(duì)樣品的基質(zhì)要求較高，很難實(shí)施；而用儀器檢測(cè)時(shí)成本很高，并且對(duì)操作人員的操作技能有很高的要求。

所以，本發(fā)明提出了一種新型的、簡(jiǎn)便的、靈敏的檢測(cè)方法，把納米材料作為一種新型探針，進(jìn)行AFP和Mucin-1的超靈敏檢測(cè)。

通過(guò) DNA 雜交將20nm粒徑的金納米粒子和20nm粒徑的上轉(zhuǎn)換納米粒子組裝成三聚體結(jié)構(gòu)。目標(biāo)物AFP和其適配體部分互補(bǔ)序列修飾的上轉(zhuǎn)換納米粒子競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，熒光信號(hào)增強(qiáng)；而目標(biāo)物Mucin-1和其適配體部分互補(bǔ)序列修飾的金納米粒子競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，拉曼信號(hào)減弱。將熒光信號(hào)與目標(biāo)物AFP的濃度建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，拉曼信號(hào)與目標(biāo)物Mucin-1的濃度建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，以此來(lái)定量檢測(cè)癌癥標(biāo)志物甲胎蛋白及粘蛋白-1。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種金-上轉(zhuǎn)換納米粒子三聚體的制備方法及其應(yīng)用，其提供的新型的、簡(jiǎn)便的、靈敏的檢測(cè)方法，把納米材料作為一種新型探針，進(jìn)行AFP和Mucin-1的超靈敏檢測(cè)。

本發(fā)明的技術(shù)方案，一種金-上轉(zhuǎn)換納米粒子三聚體的制備方法，具體包括金納米粒子的合成，上轉(zhuǎn)換納米粒子的提供，金-上轉(zhuǎn)換納米粒子三聚體的組裝及結(jié)構(gòu)表征，熒光、拉曼信號(hào)測(cè)試，用金-上轉(zhuǎn)換納米粒子三聚體檢測(cè)AFP和Mucin-1。具體步驟如下：

（1）金納米粒子的合成：進(jìn)行20nm 粒徑金納米粒子的合成；48.75mL超純水在攪拌下加入1.25mL 4g/L的氯金酸，使其沸騰，沸騰狀態(tài)保持2-3min，加入1.2mL 10mg/mL的檸檬酸鈉水溶液，觀察顏色變化，待顏色不變后冷卻至室溫，放入冰箱中待用：

（2）上轉(zhuǎn)換納米粒子的提供：由北京萬(wàn)德高科技發(fā)展有限公司購(gòu)買(mǎi)；

（3）金-上轉(zhuǎn)換納米粒子三聚體的組裝：取兩管50mL步驟（1）制備的已濃縮好的 10nM 20nm粒徑金納米粒子，分別與巰基修飾的Mucin-1的適配體及互補(bǔ)序列進(jìn)行偶聯(lián)，金納米粒子︰巰基修飾的Mucin-1的適配體/互補(bǔ)序列的摩爾比為1︰3；再將50mL上轉(zhuǎn)換納米粒子與巰基修飾的AFP的適配體偶聯(lián)，其中上轉(zhuǎn)換納米粒子︰巰基修飾的AFP摩爾比為1︰5；三管試劑均在室溫下過(guò)夜反應(yīng)，13000r/min 離心15min，棄上清，然后用50mL的TBE緩沖液分散沉淀，分別得到Au-Mucin-1適配體、Au-互補(bǔ)序列及UCNP- AFP適配體，待用；

將50mL Au-Mucin-1適配體、50mL Au-互補(bǔ)序列和50mL UCNP- AFP適配體雜交反應(yīng)12h，得到組裝產(chǎn)物金-上轉(zhuǎn)換納米粒子三聚體Au-Au-UCNP；離心15min，棄上清，后用100mL的超純水分散，進(jìn)行TEM、熒光和拉曼表征。

Mucin-1適配體：5’-GCAGTTGATC CTTTGGATAC CCTGG-SH-3’；

互補(bǔ)序列：5’-GATCAACTGC ACAGCACCAC AGACC-SH-3’；

AFP適配體：5’-SH-GGCAGGAAGA CAAACAGGAC CGGGTTGTGT GGGGTTTTAA GAGCGTCGCC TGTGTGTGGT CTGTGGTGCT GT-3’。

金-上轉(zhuǎn)換納米粒子三聚體的應(yīng)用，用于癌癥標(biāo)志物的多重超靈敏檢測(cè)，具體采用金-上轉(zhuǎn)換納米粒子三聚體檢測(cè)甲胎蛋白AFP和粘蛋白-1Mucin-1。

（4）AFP的檢測(cè)：取100mL的金-上轉(zhuǎn)換納米粒子三聚體Au-Au-UCNP，加入1mL不同濃度的甲胎蛋白（AFP），使其終濃度在0-100aM（具體為 0、1、2、5、10、20、50、100 aM），反應(yīng) 10min，進(jìn)行熒光測(cè)試，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（5） Mucin-1的檢測(cè)：取100mL的金-上轉(zhuǎn)換納米粒子三聚體Au-Au-UCNP，加入1mL不同濃度的粘蛋白-1（Mucin-1），使其終濃度在0-10fM（具體為 0、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10 fM），反應(yīng) 10min，進(jìn)行拉曼測(cè)試，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（6）樣品測(cè)試：從無(wú)錫市第二人民醫(yī)院獲取三名病人的血清樣品，稀釋后取1mL，加入100mL Au-Au-UCNP組裝體，進(jìn)行熒光和拉曼測(cè)試，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出樣品所含AFP及Mucin-1的濃度，并與標(biāo)準(zhǔn)濃度進(jìn)行比較。

本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明基于熒光和拉曼作為檢測(cè)信號(hào)，可以分別檢測(cè)兩種癌癥標(biāo)志物甲胎蛋白AFP及粘蛋白-1Mucin-1。與傳統(tǒng)的檢測(cè)手段相比，具有靈敏度高、檢測(cè)限低、方便、快捷的優(yōu)點(diǎn)，有非常好的應(yīng)用前景。

附圖說(shuō)明

圖1金-上轉(zhuǎn)換納米粒子三聚體Au-Au-UCNP組裝結(jié)構(gòu)的 TEM 圖。

圖 2 不同濃度AFP下金-上轉(zhuǎn)換納米粒子三聚體的熒光信號(hào)。

圖 3 基于金-上轉(zhuǎn)換納米粒子三聚體組裝結(jié)構(gòu)進(jìn)行AFP檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖 4 不同濃度Mucin-1下金-上轉(zhuǎn)換納米粒子三聚體的拉曼信號(hào)。

圖 5 基于金-上轉(zhuǎn)換納米粒子三聚體組裝結(jié)構(gòu)進(jìn)行Mucin-1檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例中的上轉(zhuǎn)換納米粒子購(gòu)自北京萬(wàn)德高科技發(fā)展有限公司。

實(shí)施例 1 基于金-上轉(zhuǎn)換納米粒子三聚體的癌癥標(biāo)志物的多重超靈敏檢測(cè)方法。

（1）金納米粒子的合成：將48.75mL超純水在攪拌下加入1.25mL 4g/L的氯金酸，使其沸騰，沸騰狀態(tài)保持2-3min，加入1.2mL 10mg/mL的檸檬酸鈉水溶液，觀察顏色變化，待顏色不變后冷卻至室溫，放入冰箱中待用。

（2）上轉(zhuǎn)換納米粒子的提供：由北京萬(wàn)德高科技發(fā)展有限公司購(gòu)買(mǎi)。

（3）金-上轉(zhuǎn)換納米粒子三聚體的組裝：取兩管50mL已濃縮好的20nm粒徑金納米粒子，分別與巰基修飾的Mucin-1的適配體及互補(bǔ)序列進(jìn)行偶聯(lián)，偶聯(lián)摩爾比為1︰3；再將50mL上轉(zhuǎn)換納米粒子與巰基修飾的AFP的適配體偶聯(lián)，偶聯(lián)摩爾比為1︰5，三管在室溫下過(guò)夜反應(yīng)，13000r/min 離心15min，棄上清，然后用50 mL的TBE緩沖液分散沉淀，待用；將50 mL Au-Mucin-1適配體、50 mL Au-互補(bǔ)序列、50 mL UCNP- AFP適配體雜交反應(yīng)12h，組裝產(chǎn)物為金-上轉(zhuǎn)換納米粒子三聚體Au-Au-UCNP，離心15min，棄上清，后用100mL的超純水分散，進(jìn)行TEM、熒光和拉曼表征。

（4）AFP的檢測(cè)：取100mL的金-上轉(zhuǎn)換納米粒子三聚體，加入1 mL 不同濃度的AFP溶液，使其終濃度范圍分別為 0、1、2、5、10、20、50、100 aM，反應(yīng) 10min，進(jìn)行熒光測(cè)試。最低檢測(cè)限達(dá)0.059aM。

（4） Mucin-1的檢測(cè)：取100mL的金-上轉(zhuǎn)換納米粒子三聚體，加入1 mL不同濃度的Mucin-1溶液，使其終濃度范圍分別為0、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10 fM，反應(yīng) 10min，進(jìn)行拉曼測(cè)試。最低檢測(cè)限達(dá)4.1aM。