本發(fā)明涉及基于神經(jīng)激肽1受體(NK1R)的一種白血病檢測試劑盒的開發(fā)與應(yīng)用。具體地，本發(fā)明涉及：檢測受試者中NK1R表達(dá)水平的方法；受試者中NK1R的表達(dá)水平在白血病病人檢測中的用途；以及涉及一種試劑盒產(chǎn)品，其包括作為活性成分的NK1R的抗體和包括涉及該產(chǎn)品的說明書。
背景技術(shù)：
癌癥是一類嚴(yán)重危害人類健康的疾病，目前全球癌癥死亡人數(shù)高于艾滋病、結(jié)核病和瘧疾死亡人數(shù)的總和，已成為全球頭號殺手。2015年6月2日，美國臨床腫瘤學(xué)會議落幕，根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)發(fā)布的《全球癌癥報告2014》，2012年全球癌癥患者和死亡病例均有所增加，新增癌癥病例有近一半出現(xiàn)在亞洲，其中大部分在中國，中國新增癌癥病例高居第一位。該報告預(yù)測全球癌癥病例將呈現(xiàn)迅猛增長態(tài)勢，由2012年的1400萬人，逐年遞增至2025年的1900萬人，到2035年將達(dá)到2400萬人。而白血病是一類造血系統(tǒng)的惡性疾病，是國內(nèi)十大高發(fā)惡性腫瘤之一，占腫瘤發(fā)病率的第六位，在我國各年齡組惡性腫瘤的死亡率中分別占男性的第6位和女性的第8位，在兒童及35歲以下的死亡率中占第1位。WHO預(yù)計，在全球范圍內(nèi)，新增癌癥病例和癌癥患者死亡率也將會以每年1％的速度遞增，而在中國、俄羅斯和印度這些國家增長速度會更快，估計到2030年全球?qū)⒖赡苡?500萬人遭受癌癥的折磨，將新增2700萬癌癥病例，死于癌癥的人數(shù)將達(dá)到1700萬人，這一數(shù)字對許多國家的健康護(hù)理體系來說是難以承受的。
神經(jīng)激肽受體(Neurokinin Receptors)是由七個疏水跨膜區(qū)構(gòu)成的G蛋白偶聯(lián)受體家族成員，有三種亞型，分別為神經(jīng)激肽受體1，神經(jīng)激肽受體2和神經(jīng)激肽受體3。神經(jīng)激肽受體1在中樞和外周的神經(jīng)元、血管內(nèi)皮細(xì)胞、肌肉和不同類型的免疫細(xì)胞呈現(xiàn)特異性表達(dá)。神經(jīng)激肽受體2主要在外周表達(dá)，在中樞只有在特定腦區(qū)有表達(dá)。相反，神經(jīng)激肽受體3主要在中樞神經(jīng)系統(tǒng)表達(dá)，在外周的表達(dá)被限制在特定的組織中。
由于神經(jīng)激肽1受體的序列已經(jīng)明確，神經(jīng)激肽1受體的商業(yè)化抗體已成熟，該抗體的產(chǎn)生對于研究基于神經(jīng)激肽1受體的相關(guān)疾病提供了諸多便利。目前還未見關(guān)于神經(jīng)激肽1受體作為試劑盒在白血病檢測領(lǐng)域的相關(guān)研究報道。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
為了向在正常體檢中的人們提供檢測發(fā)現(xiàn)白血病可能性的新途徑或提供更廣泛的選擇，本發(fā)明的發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)：與健康人相比，神經(jīng)激肽1受體在白血病患者外周血白細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá)。
因此，本發(fā)明一方面提供了一種檢測受試者可能患白血病的方法，其包括在所述受試者施中檢測神經(jīng)激肽1受體的表達(dá)水平。
本發(fā)明的另一方面提供了神經(jīng)激肽1受體的抗體在制備用于檢測受試者是否患有白血病或是否具有患有白血病風(fēng)險的試劑盒中的用途。優(yōu)選地，所述的檢測是通過檢測受試者外周血中神經(jīng)激肽1受體表達(dá)水平而進(jìn)行的。示例性地，如果受試者周血中神經(jīng)激肽1受體表達(dá)水平是正常對照組的1.3-100倍或更高，則可以判定該受試者患有白血病或具有患有白血病風(fēng)險。例如，本發(fā)明所述的高表達(dá)是指是對照組(健康組)表達(dá)水平的1.3倍、1.31倍、1.32倍、1.33倍、1.34倍、1.35倍、1.36倍、1.37倍、1.38倍、1.39倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍或更高。
本發(fā)明的再一方面提供了一種檢測受試者是否患有白血病或是否具有患有白血病風(fēng)險的試劑盒，其包括作為活性成分的神經(jīng)激肽1受體的抗體；以及包括該涉及抗體產(chǎn)品的說明書。
在本發(fā)明中，其中所述的神經(jīng)激肽1受體的抗體是指與神經(jīng)激肽1受體特異性結(jié)合的抗體，例如特異性與神經(jīng)激肽1受體結(jié)合的單克隆抗體或者多克隆抗體。
對于本發(fā)明所述的受試者，其優(yōu)選為哺乳動物，更優(yōu)選為人。
本發(fā)明的發(fā)明人出乎意料的發(fā)現(xiàn)，受試者外周血中神經(jīng)激肽1受體的表達(dá)水平與該受試者是否患有白血病或者是否具有患白血病的風(fēng)險顯著相關(guān)。例如，如果受試者外周血中神經(jīng)激肽1受體的表達(dá)水平相對健康受試者是高表達(dá)的，則可診斷為該受試者患有白血病或者具有患白血病的風(fēng)險。這對于早發(fā)現(xiàn)白血病并進(jìn)行及時治療贏得了時間。
示例性地，本發(fā)明的試劑盒、檢測或者用途可以作為診斷白血病的輔助手段。也就是說，醫(yī)生或者其他醫(yī)務(wù)人員可以結(jié)合受試者其他的理化指標(biāo)或影像結(jié)果給出受試者的診斷結(jié)果。
如本文所使用的，“包含”、“包括”、“含有”或“特征在于”同義，并且是包括在內(nèi)的或開放性的，并且不排除另外的未陳述的元件或方法步驟。術(shù)語“包含”在本文中的任何表述，特別是在描述本發(fā)明的方法、用途或產(chǎn)品時，應(yīng)理解為包括基本上由所述組分或元件或步驟組成和由所述組分或元件或步驟組成的那些產(chǎn)品、方法和用途。本文示例性描述的本發(fā)明適當(dāng)?shù)乜梢栽诓淮嬖诒疚奈淳唧w公開的任何一種或多種元件、一種或多種限制的情況下進(jìn)行實踐。
本文已采用的術(shù)語和表述用作描述性而不是限制性術(shù)語，并且在此種術(shù)語和表述的使用中不預(yù)期排除所示和所述特征或其部分的任何等價物，但應(yīng)認(rèn)識到各種修飾在請求保護(hù)的本發(fā)明的范圍內(nèi)是可能的。因此，應(yīng)當(dāng)理解盡管本發(fā)明已通過優(yōu)選實施方案和任選特征具體公開，但本領(lǐng)域技術(shù)人員可以采用本文公開的概念的修飾和變化，并且此類修飾和變化被視為在如由附加權(quán)利要求定義的本發(fā)明的范圍內(nèi)。
附圖說明
圖1為受試者外周血中神經(jīng)激肽1受體表達(dá)水平的代表性Western blotting圖片，其中P代表patient，指白血病患者；V代表volunteers，指健康志愿者。
為更清楚地說明本發(fā)明，現(xiàn)結(jié)合如下實施例進(jìn)行詳細(xì)說明，但這些實施例僅僅是對本發(fā)明的示例性描述，并不能解釋為對本申請的限制。
實施例
1.材料和方法
1.1細(xì)胞株及抗體
人慢性粒性白血病細(xì)胞K562購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤細(xì)胞庫。神經(jīng)激肽1受體的兔源一抗抗體購自巴傲德生物科技有限公司，使用時按1：1000比例稀釋，辣根過氧化物酶偶聯(lián)的羊抗兔的二抗購自巴傲德生物科技有限公司，使用時按1：5000稀釋。內(nèi)參抗體GAPDH同樣購自巴傲德，使用時按1：10000稀釋。
1.2白血病病人和正常人血液樣品
白血病病人外周血取自浙江省人民醫(yī)院血液科。正常人外周血取自浙江省中醫(yī)院下沙院區(qū)體檢中心。
1.2實驗方法
1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)
將K562細(xì)胞培養(yǎng)于含10％FBS(Fetal bovine serum)的DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)培養(yǎng)基中(含谷氨酰胺、10mM HEPES(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid)、1.0mM丙酮酸鈉、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素)，于37℃、5％CO2、飽和濕度下培養(yǎng)，每3天傳代一次，取對數(shù)生長期細(xì)胞制備蛋白樣品并于-80度保存，用于與白血病病人蛋白樣品以及健康志愿者蛋白樣品一起做Western blotting檢測。
1.2.2全血樣品中白細(xì)胞分離方法
將正常人或白血病患者的外周血樣4℃,450g(約2300rpm)離心10min，取血清于干凈的1.5mL的EP管中，于—80℃下保存；往剩余血紅色沉淀中加約3倍體積的紅細(xì)胞裂解液，輕輕渦旋或顛倒搖勻后，冰上裂解15min，其間輕輕渦旋混勻兩次；再4℃450g離心10min以沉淀白細(xì)胞，小心吸棄上清液。重復(fù)此步驟1-2次直到得到白色沉淀。再加1mL PBS，450g，4℃離心5min，棄上清，重復(fù)1-2次。再按所得的白細(xì)胞的量加適量的RIPA全細(xì)胞裂解液(含有10mM的PMSF10％)。在震動器上劇烈震蕩后，于冰上充分裂解30min，再于—80℃下保存后與K562細(xì)胞蛋白樣品同時做Western blotting檢測。
2.實驗結(jié)果
神經(jīng)激肽1受體(NK1R)在正常體檢志愿者和白血病患者外周血白細(xì)胞中的表達(dá)水平
Western blotting檢測結(jié)果顯示：正常志愿者外周血白細(xì)胞中
NK1R呈現(xiàn)低水平的表達(dá)或不表達(dá)，而相比于正常志愿者，白血病患者外周血白細(xì)胞中NK1R呈現(xiàn)高表達(dá)(見圖1)。
表1綜合了所研究的26例白血病病人的相關(guān)資料，包括患者年齡、性別、白血病分型，以及外周血白細(xì)胞中NK1R的表達(dá)水平，如圖1中P2是V1的1.43倍，P3是V1的1.39倍，P8是V3的3.38倍，P8是V4的2.89倍，P8是V5的2.59倍，P8是V6的3.28倍，P8是V7的3.49倍，P9是V3的8.70倍，P9是V4的7.46倍，P9是V5的6.66倍，P9是V6的8.44倍，P9是V7的8.99倍，P20是V8的2.75倍，P20是V9的1.42倍，P20是V10的2.21倍，P20是V11的2.14倍，P20是V12的1.41倍，P20是V13的1.55倍，P21是V8的3.50倍，P21是V9的1.81倍，P21是V10的2.81倍，P21是V11的2.72倍，P21是V12的1.80倍，P21是V13的1.97倍。
從表1中可以看出NK1R在白血病患者中呈現(xiàn)高陽性率的檢出，陽性率高達(dá)73.1％。
表1：所檢測的34例白血病病人中神經(jīng)激肽1受體的表達(dá)水平
由此可見，將NK1R的抗體做成一種ELISA試劑盒，利用該試劑盒來在體檢中檢測受試者外周血中NK1R的表達(dá)水平，通過該檢測可以高準(zhǔn)確率的檢測出受試者是否患有白血病的可能性。
本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以在本發(fā)明的實踐中采用除具體例示那些外的方法和原材料等而無需過度實驗。任何此類方法和原材料等的所有的本領(lǐng)域已知的功能等價物都預(yù)期包括在本發(fā)明中。本領(lǐng)域技術(shù)人員還應(yīng)當(dāng)理解，可對本說明書及權(quán)利要求書中描述的本發(fā)明進(jìn)行各種變動和修飾，且本發(fā)明包括所有此類變動和修飾。本發(fā)明還包括本說明書中單獨(dú)或同時提及或指出的所有步驟、特征、組合物和化合物，以及所述步驟或特征中的任何2個或更多個的任何和所有組合。