本發(fā)明屬于生物檢測領域，具體地說，涉及一種用于定量檢測半胱氨酸蛋白酶抑制劑S的試劑盒、尤其是通過磁微粒化學發(fā)光法定量檢測人半胱氨酸蛋白酶抑制劑S的試劑盒。
背景技術：
：《2015年中國腫瘤登記年報》權威數(shù)據(jù)顯示，2015年中國腫瘤發(fā)病數(shù)為4249，000例，平均每天就有12000例新診斷的腫瘤患者，而腸癌、胃癌均是發(fā)病率最高的五大腫瘤之一。世界衛(wèi)生組織(WHO)指出，防治癌癥關鍵是“早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療”。因此，采用有效的方法實現(xiàn)癌癥的早期診斷、療效評估及術后監(jiān)測對于降低癌癥整體死亡率、提高患者生存期起重大作用。目前，胃腸鏡篩查技術、免疫組化切片試驗、大便隱血試驗、血液CEA指標是醫(yī)院很常規(guī)的檢測項目。雖然通過胃腸鏡篩查技術、大便隱血試驗、血液CEA指標可早期發(fā)現(xiàn)腸癌、胃癌，且通過早期治療，5年生存率提高90％以上，然而這些方法均有不足之處：胃腸鏡篩查及免疫組化切片試驗是侵入性的，檢查痛苦，有出血、穿孔等風險性；大便隱血試驗，不易被民眾接受；CEA指標，靈敏度低，特異性不高。胃癌、腸癌的防治仍存在大量亟待解決的問題，包括如何在更早期發(fā)現(xiàn)并及時干預，如何實現(xiàn)療效評估和監(jiān)測，如何對術后患者做到實時準確的復發(fā)監(jiān)控。半胱氨酸蛋白酶抑制劑S，簡稱為胱抑素S，英文名CystatinS，是人類Cystatin家族成員，由CST4基因編碼，含141個氨基酸，分子中有兩個二硫鍵分子量為16.4Kda，為典型的分泌蛋白，分布于多種體液和分泌物中，如眼淚、唾液、血清、血漿等。CystatinS最早由上海良潤生物醫(yī)藥科技有限公司發(fā)現(xiàn)，其在胃腸癌組織中具有高水平的表達，而在胃腸道正常組織中低表達。胃癌、腸癌患者的血清中CystatinS的表達量也明顯高于正常人血清。表達水平與腫瘤的病變、分化情況呈正相關，這說明其可能在胃腸癌的發(fā)生、發(fā)展過程中扮演重要角色，因此CystatinS是可以作為診斷和預示胃腸癌的標志物，也是我國擁具有自主知識產(chǎn)權的新型胃腸癌腫瘤標志物，參見CN103901205A、CN103901196A、CN103901207A、CN103913574A、CN103913575A、CN103911426A、CN103926409A、CN104558116A。此外，上海良潤生物醫(yī)藥科技有限公司還獲得了一對分泌針對人CystatinS抗原決定簇的特異性抗體5D2F2和5E4G5的雜交瘤細胞，保藏于武漢大學中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號分別為CCTCCNO：C201416和CCTCCNO：C201415。目前，用于人CystatinS的免疫分析方法只有酶聯(lián)免疫分析法。酶聯(lián)免疫法是腫瘤標志物常用的免疫分析方法之一，它具有試劑和儀器成本低、操作的簡單優(yōu)點，但同時存在著靈敏度低、反應時間長、操作步驟繁鎖且不易實現(xiàn)全自動化等缺點。隨著標記免疫技術的迅速發(fā)展，各種新的檢測方法不斷問世?；瘜W發(fā)光免疫分析法是在酶聯(lián)免疫分析基礎上發(fā)展起來的更敏感的微量免疫檢測技術，然而在實際的免疫檢測中，由于待測樣品中所含的雜質(zhì)成分較多，一定程度上影響了檢測的靈敏度和準確度。迄今為止，人半胱氨酸蛋白酶抑制劑S的臨床檢測中缺乏一種操作過程簡單、反應時間短、檢測限低、靈敏度高、特異性好、穩(wěn)定性好的診斷試劑盒。技術實現(xiàn)要素：為了克服現(xiàn)有的人半胱氨酸蛋白酶抑制劑S檢測技術的上述缺陷，本發(fā)明基于磁微?；瘜W發(fā)光法，設計了一種全新的試劑盒，能夠?qū)ι飿悠分邪腚装彼岬鞍酌敢种苿㏒的含量進行精確測量，從而為胃癌、腸癌的早期診斷提供可靠依據(jù)。因此，本發(fā)明提供了一種用于定量檢測半胱氨酸蛋白酶抑制劑S的試劑盒，其包括：偶聯(lián)有鏈霉親和素的磁性微粒；生物素標記的半胱氨酸蛋白酶抑制劑S第一單克隆抗體；酶標記的半胱氨酸蛋白酶抑制劑S第二單克隆抗體；半胱氨酸蛋白酶抑制劑S校準品和/或半胱氨酸蛋白酶抑制劑S質(zhì)控品。在一種實施方式中，上述試劑盒中，所述半胱氨酸蛋白酶抑制劑S第一單克隆抗體和所述半胱氨酸蛋白酶抑制劑S第二單克隆抗體不同，兩者之一是單克隆抗體5D2F2或者單克隆抗體5E4G5，其中單克隆抗體5D2F2是保藏號為CCTCCNO：C201416的雜交瘤細胞分泌的人CystatinS特異性單克隆抗體；單克隆抗體5E4G5是保藏號為CCTCCNO：C201415的雜交瘤細胞分泌的人CystatinS特異性單克隆抗體。在一種優(yōu)選的實施方式中，上述試劑盒中的所述半胱氨酸蛋白酶抑制劑S第一單克隆抗體與所述半胱氨酸蛋白酶抑制劑S第二單克隆抗體不同，分別選自半胱氨酸蛋白酶抑制劑S單克隆抗體5D2F2和半胱氨酸蛋白酶抑制劑S單克隆抗體5E4G5。單克隆抗體5D2F2和單克隆抗體5E4G5的效價達1：107以上，親和力達10-9Ka以上。在一種實施方式中，上述試劑盒中的半胱氨酸蛋白酶抑制劑S校準品和半胱氨酸蛋白酶抑制劑S質(zhì)控品是真核細胞表達的重組半胱氨酸蛋白酶抑制劑S蛋白或大腸桿菌表達的重組半胱氨酸蛋白酶抑制劑S蛋白。比如CystatinS校準品或CystatinS質(zhì)控品可以為通過將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到真核細胞，培養(yǎng)后收集陽性細胞上清，分離出真核表達的CystatinS蛋白；也可以為通過基因工程的手段及大腸桿菌表達系統(tǒng)獲得的原核CystatinS蛋白。CystatinS校準品可用于制作標準曲線，從而使得CystatinS檢測定量化。在一種優(yōu)選的實施方式中，上述磁性微粒的粒徑是0.1-10微米、優(yōu)選0.2-5微米、優(yōu)選0.2-3微米、更優(yōu)選0.3-2微米、更優(yōu)選0.5-1微米，以便在試劑盒使用時的檢測體系形成接近均相的反應體系。在一種優(yōu)選的實施方式中，所述磁性微粒是表面帶有活性基團、以四氧化三鐵為內(nèi)核的聚合物。所述活性基團可以是氨基、羧基、IDA(亞氨基二乙酸)、環(huán)氧基等，優(yōu)選氨基或羧基。在一種優(yōu)選的實施方式中，上述試劑盒中的偶聯(lián)有鏈霉親和素的磁性微粒呈磁珠懸液形式，即鏈霉親和素磁珠懸液作為磁分離試劑。本發(fā)明的試劑盒中的半胱氨酸蛋白酶抑制劑S檢測體系采用酶催化的底物化學發(fā)光法，從而通過進行光電信號檢測而確定樣品中的半胱氨酸蛋白酶抑制劑S含量。在一種實施方式中，上述試劑盒中的酶優(yōu)選是過氧化物酶、堿性磷酸酶、磷酸酯酶或熒光素酶，更優(yōu)選辣根過氧化物酶(Horseradishperoxidase，簡稱HRP)或者堿性磷酸酶，更優(yōu)選辣根過氧化物酶。作為辣根過氧化物酶的作用底物，可以選自下組：氨基苯二酰一肼(魯米諾)、異氨基苯二酰一肼、氨基丁基乙基異氨基苯二酰一肼(ABEI)、氨基己基乙基異氨基苯二酰一肼(AHEI)、7-二甲基氨基萘-l,2-二羧酸酰肼、環(huán)取代的氨基鄰苯二甲酰肼、蒽-2,3-二羧酸酰肼、菲-1,2-二羧酸酰肼、芘二羧酸酰肼、5-羥基-鄰苯二甲酰肼、6-羥基鄰苯二甲酰肼、2,3-二氮雜萘二酮類似物、9,10-二氫化吖啶類化合物比如9,10-二氫化吖啶酯、9,10-二氫化吖啶酯、9,10-二氫化吖啶硫酯、9,10-二氫化吖啶磺酰胺、9,10-二氫化吖啶二硫縮烯酮化合物。優(yōu)選是魯米諾。酶的作用底物可以單獨作為試劑盒的組成部分，即，底物溶液。優(yōu)選地，所述底物溶液含有魯米諾。相對應地，上述試劑盒進一步包含引發(fā)劑溶液，該引發(fā)劑溶液包含過氧化氫，比如是雙氧水溶液。在一種優(yōu)選的實施方式中，上述試劑盒用于測定生物樣品中的半胱氨酸蛋白酶抑制劑S，所述生物樣品來源于受測對象、尤其是有胃癌、腸癌的嫌疑的患者。樣本可以包含多種形式，比如全血、血漿、血清、尿液、唾液、眼淚、體液、胃液、糞便。其中優(yōu)選血清。本發(fā)明將化學發(fā)光和磁性微粒結(jié)合起來，提供了一種接近均相的反應體系，可以定量檢測出半胱氨酸蛋白酶抑制劑S含量。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的試劑盒具有操作過程簡單、反應時間短、檢測限低、靈敏度高等諸多優(yōu)點，在臨床檢驗中可以根據(jù)CystatinS的含量進行胃腸癌輔助診斷、療效評估及復發(fā)監(jiān)測。附圖說明圖1是CystatinS檢測標準曲線。圖2是本發(fā)明實施例中血清CystatinS檢測的ROC曲線。具體實施方式以下結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步詳細說明。應理解，以下實施例僅用于說明本發(fā)明而非用于限定本發(fā)明的范圍。本文中涉及到多種物質(zhì)的添加量、含量及濃度，其中所述的百分含量，除特別說明外，皆指質(zhì)量百分含量。磁微粒免疫檢測技術是利用高分子材料合成一定粒度大小的磁性固相微粒，作為載體，以物理吸附、化學偶聯(lián)等方法包被具有特異性親和力的抗體或抗原等各種免疫活性物質(zhì)。磁微粒具有順磁性，在磁場下具有磁場響應性，將磁微粒應用于免疫檢測固相，增加包被表面積，從而增加抗原或抗體吸附量及接觸面積，提高反應靈敏度，同時使得抗原-抗體結(jié)合物與游離抗體的分離更容易，即清洗更方便；而且磁微粒反應體系更接近于均相反應體系，加快了反應的速度，縮短了反應時間。本發(fā)明的試劑盒的作用原理是基于磁微?；瘜W發(fā)光免疫檢測機制。CystatinS檢測體系中，酶標記的CystatinS第二單克隆抗體和抗原CystatinS結(jié)合形成抗原抗體復合物，并加入生物素標記的CystatinS第一單克隆抗體，形成生物素標記抗體-抗原-HRP標記抗體的雙抗夾心免疫復合物，隨后加入偶聯(lián)有鏈霉親和素的磁性微粒，通過鏈霉親和素與生物素的親和性使抗原抗體復合物連接到磁珠上，形成磁珠免疫復合物，然后利用磁場分離出該磁珠免疫復合物，加入酶促反應的化學發(fā)光底物液并借助化學發(fā)光信號來測定CystatinS含量，其中的酶用于催化或激活化學發(fā)光反應。在本發(fā)明中，術語“磁性微?！?、“磁微?！薄ⅰ按胖椤焙汀按判灶w?！北硎鞠嗤囊饬x，都是指用于將親和素、生物素、抗原/抗體、酶、核酸/寡核苷酸、小分子藥物等固定在其表面的具有超順磁性的膠態(tài)復合材料，可均勻分散于一定基液中，在磁場中富集。至于磁性微粒，可以使用生物檢測領域中常用的磁性微粒。作為一種選擇方式，可以根據(jù)需要在磁性微粒表面覆蓋高分子成分比如PEI(聚醚酰亞胺Polyetherimide)、PVA(聚乙烯醇)、PS(聚苯乙烯)等聚合物，包括硅化物、多聚糖、蛋白、纖維素或樹脂等。磁微?；瘜W發(fā)光免疫檢測所使用的磁珠具有超順磁和相應的磁場響應性，根據(jù)磁珠表面基團類型，所述磁珠包括羧基磁珠、氨基磁珠、硅基磁珠、巰基磁珠、IDA(亞氨基二乙酸)磁珠、環(huán)氧基磁珠、醛基磁珠、鏈霉素親和素磁珠等，本發(fā)明所提供試劑盒中優(yōu)選鏈霉素親和素磁珠。在本發(fā)明的一種實施方式中，上述磁性微粒A和磁性微粒B的粒徑范圍是0.1-10微米。磁性微粒的平均粒徑的下限為0.1微米，優(yōu)選為0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5、0.55、0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9、0.95或1微米；其上限為10微米，優(yōu)選為9.5、9、8.5、8、7.5、7、6.5、6、5.5、5、4.5、4、3.5或3微米。更優(yōu)選0.2-5微米、優(yōu)選0.2-3微米、更優(yōu)選0.3-2微米、更優(yōu)選0.3-1微米。比如磁性微粒的平均粒徑可以為0.2-5微米，優(yōu)選0.2-3微米、更優(yōu)選0.3-2微米、更優(yōu)選0.5-1微米。如果平均粒徑小于0.1微米，則價格過高，并可能造成上述免疫復合物的分離困難，可能影響CystatinS含量的測定精確性；另一方面，如果平均粒徑大于10微米，則不利于CystatinS檢測體系形成接近均相的反應體系，進而可能影響到CystatinS含量的測定精確性。在本發(fā)明中，術語“單克隆抗體”、“單抗”和“抗體”表示相同的意義，尤其是指單克隆抗體5D2F2和單克隆抗體5E4G5。這兩種單克隆抗體在中國發(fā)明專利申請CN104558116A中有描述。在本發(fā)明中，術語“半胱氨酸蛋白酶抑制劑S”、“胱抑素S”和“CystatinS”表示相同的意義，可以互換使用。為了實現(xiàn)化學發(fā)光檢測，本發(fā)明的試劑盒中采用酶作為催化劑來催化底物的化學發(fā)光反應，所使用的酶能夠催化或者激活化學發(fā)光化合物或者熒光染料，從而快速地將無色的底物轉(zhuǎn)變成有色的產(chǎn)物、或者引起光變化，或者將非熒光的熒光染料轉(zhuǎn)變成強烈的熒光產(chǎn)物。在一種實施方式中，酶選自含有過渡金屬的過氧化物酶、堿性磷酸酶、磷酸酯酶和熒光素酶，更尤其優(yōu)選是過氧化物酶。其中過氧化物酶可以包括：乳過氧化物酶、微小過氧化物酶、髓過氧化物酶、鹵素過氧化物酶例如釩溴過氧化物酶、辣根過氧化物酶、真菌的過氧化物酶比如木質(zhì)素過氧化物酶和在白腐真菌中產(chǎn)生的依賴Mn的過氧化物酶、以及大豆過氧化物酶。其他氧化物酶的模擬化合物并不是酶，而是具有類似過氧化物酶的活性，其包括鐵絡合物比如亞鐵原卟啉和Mn-TPPS4(Y.X.Ci等，Mikrochem.J.，52，257-62(1995))，已知該化合物可以催化底物的化學發(fā)光氧化，這種化合物也被包含在本發(fā)明所使用的過氧化物酶含義的范圍內(nèi)?？紤]到ELISA在蛋白質(zhì)檢測中的普遍適用性，優(yōu)選酶是過氧化物酶、堿性磷酸酶、磷酸酯酶或熒光素酶，更優(yōu)選辣根過氧化物酶(Horseradishperoxidase，簡稱HRP)。作為酶催化的底物，這些底物是適用于化學發(fā)光檢測、顯色檢測或者熒光檢測的化合物。因此，在本發(fā)明的一個實施方式中，優(yōu)選酶能夠催化或者激活化學發(fā)光化合物或者熒光染料，從而快速地將無色的底物轉(zhuǎn)變成有色的產(chǎn)物、或者引起光變化，或者將非熒光的熒光染料轉(zhuǎn)變成強烈的熒光產(chǎn)物。比如，當酶是辣根過氧化物酶時，相應的顯色化合物例如是常用的鄰苯二胺(OPD)、四甲基聯(lián)苯胺(TMB)比如3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺、或2,2′-聯(lián)氨-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺鹽(ABTS)；當酶是磷酸酯酶(AP)時，相應的顯色化合物例如是常用的對硝基苯磷酸酯(p-NPP)或者相應的熒光底物例如是(磷酸4-甲基傘酮)。優(yōu)選的化學發(fā)光化合物是能夠被氧化從而當存在酶和引發(fā)劑溶液時產(chǎn)生化學發(fā)光，其示例性化合物種類包括氨基苯二酰一肼(魯米諾)、異氨基苯二酰一肼、氨基丁基乙基異氨基苯二酰一肼(ABEI)、氨基己基乙基異氨基苯二酰一肼(AHEI)、7-二甲基氨基萘-l,2-二羧酸酰肼、環(huán)取代的氨基鄰苯二甲酰肼、蒽-2,3-二羧酸酰肼、菲-1,2-二羧酸酰肼、芘二羧酸酰肼、5-羥基-鄰苯二甲酰肼、6-羥基鄰苯二甲酰肼、2,3-二氮雜萘二酮類似物、9,10-二氫化吖啶類化合物比如9,10-二氫化吖啶酯、9,10-二氫化吖啶酯、9,10-二氫化吖啶硫酯、9,10-二氫化吖啶磺酰胺、9,10-二氫化吖啶二硫縮烯酮化合物。一般來講，任何已知可以在過氧化氫和過氧化物酶的作用下產(chǎn)生化學發(fā)光的化合物都可在本發(fā)明中被用做化學發(fā)光化合物來產(chǎn)生化學發(fā)光，這樣的化合物包括占辛染料、芳香胺和雜環(huán)胺?？稍诒景l(fā)明中使用的熒光染料包括可用于蛋白質(zhì)的熒光免疫測定的化合物，其可共軛于蛋白質(zhì)比如抗體。優(yōu)選的熒光染料包括螢火蟲熒光素化合物。熒光素是熒光素酶的底物，其在熒光素酶存在的條件下被氧化從而產(chǎn)生氧化熒光素并發(fā)光。在一種實施方式中，酶是辣根過氧化物酶，并且作用底物都是魯米諾。上述試劑盒進一步包含引發(fā)劑溶液比如雙氧水，用于實現(xiàn)酶催化反應。引發(fā)劑溶液提供了為產(chǎn)生對于化學發(fā)光所需激發(fā)態(tài)化合物所需要的反應物。該反應物可以是一種對于通過直接與化學發(fā)光化合物反應而進行化學發(fā)光反應所必需的反應物。例如，當催化劑是過氧化物酶時，將會發(fā)生這種情況。在一種優(yōu)選實施方式中，引發(fā)劑溶液包含過氧化物化合物。該過氧化物成分是任何能夠與過氧化物酶反應的過氧化物或者烷基氫過氧化物。優(yōu)選的過氧化物包括過氧化氫(雙氧水)、過氧化脲和過硼酸鹽。該過氧化物與過氧化物酶反應，估計可能是在酶的活性部位將鐵的氧化態(tài)變成了不同的氧化態(tài)。所述引發(fā)劑溶液還可以包含選自下組的過氧化物酶增強子：苯酚化合物、芳香胺、芳基硼酸化合物、芳基硼酸酯化合物、芳基硼酸酸酐化合物。在優(yōu)選的實施方式中，上述試劑盒中可進一步包括輔助試劑，比如，顯色劑(底物溶液和引發(fā)劑溶液)、酶抑制劑、緩沖液、穩(wěn)定劑、稀釋劑、洗滌試劑、以及CystatinS校準品和/或CystatinS質(zhì)控品。比如，所述緩沖液用于增加檢測試劑的穩(wěn)定性、提高檢測靈敏度以及檢測特異性。所述稀釋劑用于稀釋樣本，是含有BSA的溶液。所述洗滌試劑用于洗滌磁珠，除去沒有偶聯(lián)到磁珠上的物質(zhì)。洗滌試劑可以是含有磷酸鹽、氯化鈉以及表面活性劑的緩沖液。在優(yōu)選的實施方式中，上述試劑盒還可分別包括下述物品中的至少之一：攜帶工具，其空間劃分為可以收容一種或多種容器、96孔板或板條的限定空間，該容器例如是藥瓶、試管、和類似物，每樣容器都含有一個單獨的用于本發(fā)明方法的組分；說明書，其可以寫在瓶子、試管和類似物上，或者寫在一張單獨的紙上，或者在容器的外部或內(nèi)部；也可以是多媒體的形式，比如CD、電腦光盤、錄像等等。本發(fā)明的試劑盒在醫(yī)學領域的具體應用，主要體現(xiàn)在胃癌、腸癌的鑒別診斷、預后評估、治療效果監(jiān)測或病程監(jiān)測方面。以下以個體的血清為樣本進行胃癌鑒別診斷為例，對本發(fā)明作進一步詳細說明。實施例材料和儀器磁性微粒，為磁微粒懸液，濃度為1mg/mL，磁微粒含羧基活性基團，每毫克(mg)磁微粒羧基含量不低于0.05毫摩爾(mmol)。購自河南惠爾納米科技(生物)有限公司，型號：HRCZ-04N200。CystatinS蛋白凍干粉(CystatinS蛋白為cos-7細胞表達的真核蛋白，純度>95％)，上海良潤生物醫(yī)藥科技有限公司。CystatinS單克隆抗體(克隆號：5D2F2，純度>95％，效價或滴度達1：107，親和力達10-9Ka，濃度2mg/mL)，上海良潤生物醫(yī)藥科技有限公司。實施例中用作CystatinS第一單克隆抗體。CystatinS單克隆抗體(克隆號：5E4G5，純度>95％，效價或滴度達1：107，親和力達10-9Ka，濃度2mg/mL)，上海良潤生物醫(yī)藥科技有限公司。實施例中用作CystatinS第二單克隆抗體?；罨备^氧化物酶(HRP)標記試劑盒，購自北京泰天河生物科技有限公司，型號：MD010A。2-嗎啉乙磺酸一水合物(MES)：購自上海芃碩生物科技有限公司，貨號：PM105074-500g。碳二亞胺(EDC)：購自北京華邁科生物技術有限責任公司，貨號：E046101。吐溫-20：購自生工生物工程(上海)股份有限公司，貨號：T0777-500ml。Proclin300：購自閃晶生物公司，型號：ZB116。濃縮洗液：0.15％PBST，pH7.4。用前以純化水作25倍稀釋?；瘜W發(fā)光底物液：購自ThermoScientific，貨號：34080，分為A液(作為HRP底物的魯米諾溶液)和B液(作為引發(fā)劑的雙氧水)。其他化學試劑均為分析純，均購自中國醫(yī)藥(集團)上海化學試劑公司。為簡要起見，實施例中，有時將辣根過氧化物酶稱為“酶”或者“HRP”；有時將辣根過氧化物酶標記的CystatinS單克隆抗體稱為“酶標抗體”；有時將“生物素標記的CystatinS單克隆抗體”稱為“生物素標記抗體”；有時將“洗滌緩沖液”稱為“洗液”、“濃縮洗液”。磁力架，購自Corning公司?；瘜W發(fā)光型免疫分析儀，安圖生物，型號：LUMO。全自動磁微?；瘜W發(fā)光儀，江蘇澤成生物技術有限公司，型號：CIA600。實施例1磁分離試劑(鏈霉親和素磁珠懸液)制備鏈霉親和素磁珠懸液制備包括如下步驟：(1)取50mg(1mg/mL)磁微粒懸液，磁分離去上清，用0.05mol/L、pH4.5的MES緩沖液清洗3次；(2)用5mL的0.1mol/L、pH4.5的MES緩沖液重懸磁微粒，濃度為10mg/mL；(3)加入5-7.5mg鏈霉親和素，室溫攪拌30min；(4)加入20-30μL新鮮配制的10mg/mL的EDC水溶液，4℃下攪拌過夜；(5)磁分離，去上清，用0.01mol/LPBS洗滌3次；(6)用含2％BSA的0.01mol/LPBS(pH＝7.4)室溫封閉2-3小時；(7)用含0.5％BSA的0.01mol/LPBS(pH＝7.4)清洗3次；(8)用含0.5％BSA的0.01mol/LPBS(pH＝7.4)配制成1mg/mL的工作液，用時輕輕搖勻即得，于4℃冰箱保存。實施例2生物素標記的CystatinS第一單克隆抗體制備生物素標記的CystatinS第一單克隆抗體制備包括如下步驟：(1)取2mg的5D2F2單克隆抗體，用0.1mol/L、pH9.6碳酸鹽緩沖液在2～8℃下攪拌透析6-8小時，中間換一次液；(2)按照5D2F2抗體分子與生物素分子比為1:20的比例在透析后的抗體溶液中加入生物素溶液，并加入DMSO至終濃度為10％，混勻；(3)緩慢振蕩，37℃避光反應2h；(4)加入60-80μL的3mol/L乙醇胺溶液，室溫避光反應30min；(5)用0.01mol/LPBS溶液在2～8℃下攪拌透析，5-6小時換一次液，共換液3～4次；(6)向透析后的抗體溶液加入等體積甘油，混勻、分裝，濃度為0.5mg/mL，-20℃保存。實施例3辣根過氧化物酶標記的CystatinS第二單克隆抗體制備辣根過氧化物酶標記的CystatinS第二單克隆抗體制備包括如下步驟：(1)稱取2.5mg辣根過氧化物酶(HRP凍干粉，純度為約99％，比活性為約1500U/mg)溶解于1mL雙蒸水中；(2)加入100μL新配的0.1MNaIO4溶液，室溫避光攪拌30min；(3)加入10μL的0.2M、pH9.6碳酸鹽緩沖液，使步驟(2)中醛化的HRP溶液pH升高到9.0-9.5；(4)加入5mg的5E4G5抗體在1ml0.01M碳酸鹽緩沖液中，室溫避光輕攪拌反應2小時；(5)加入50μL新配的4mg/mLNaBH4溶液，混勻，置于4℃靜置反應2小時；(6)將上述反應液裝入透析袋中，置于0.15M、pH值為7.4的PBS緩沖液中，4℃條件下攪拌過夜；(7)取出透析袋中的液體，在攪拌下逐滴加入等體積的飽和硫酸銨溶液，后置于4℃靜置1小時；(8)將步驟(7)所得溶液于3000離心30min，棄上清。將沉淀物用半飽和硫酸銨洗兩次后，將沉淀物溶于少量0.15M、pH7.4的PBS中；(9)將上述溶液用0.15M、pH7.4的PBS緩沖液透析，以去除銨離子，后將溶液置于10000rpm離心30min，去除沉淀，上清液即為酶結(jié)合物；(10)用蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑將5E4G5-HRP酶結(jié)合物稀釋至100X濃度儲液，分裝，-20℃保存，使用時100倍稀釋。實施例4CystatinS校準品制備CystatinS校準品制備包括如下步驟：(1)將CystatinS蛋白用含1％BSA的校準品稀釋液配制成校準品濃儲液；(2)用上海良潤生物醫(yī)藥科技有限公司的企業(yè)參考品為其定值，按企業(yè)標準品標定值，用校準品稀釋液將校準品濃儲液稀釋至各工作濃度點，分別為0、25U/mL、50U/mL、100U/mL、200U/mL、400U/mL、800U/mL，再將各工作濃度點用企業(yè)參考品標定，儲存于-20℃。實施例5CystatinS質(zhì)控品制備CystatinS質(zhì)控品制備包括如下步驟：(1)將CystatinS蛋白用含1％BSA的校準品稀釋液配制成校準品濃儲液；(2)用上海良潤生物醫(yī)藥科技有限公司的企業(yè)參考品為其定值，按企業(yè)標準品標定值，用校準品稀釋液將校準品濃儲液稀釋至100U/mL，用企業(yè)參考品標定，儲存于-20℃。實施例6CystatinS測定標準曲線繪制以實施例1-5中所得的試劑、必要的輔助試劑為基礎，可組合成試劑盒。按下述步驟繪制CystatinS測定標準曲線：(1)將待檢試劑盒在室溫(18～25℃)下平衡30分鐘；(2)配制洗液：用蒸餾水將濃縮洗液按1:25稀釋(1mL洗液加24mL蒸餾水)。若濃縮洗液有結(jié)晶，可將濃縮洗液置于室溫或37℃，待結(jié)晶溶解后再進行稀釋；(3)在反應管中加入25μL待測樣本(或校準品及質(zhì)控品)，然后加入50μL生物素標記的CystatinS抗體、50μL辣根過氧化物酶標記的CystatinS抗體，混勻，37℃條件下溫育20min；加入20μL磁分離試劑，混勻，37℃條件下溫育15min；(4)洗滌：使磁微粒在磁場中沉降，去除上清，加入300μL的清洗液，去除磁場，震蕩使磁微粒充分混懸，然后磁分離，去除上清；此步驟重復3-4次；(5)反應管中加入100μL發(fā)光底物A液和B液的混合溶液，震蕩，使磁微粒充分混懸，10min內(nèi)測定各管的光強度。并擬合出標準曲線，進行樣本值的計算，標準曲線見圖1。實施例7本發(fā)明試劑盒臨床應用一、試劑盒用于胃腸癌輔助診斷：從北京協(xié)和醫(yī)院收集了術前胃癌血清100例，正常體檢人員血清100例，每例血1mL。使用本發(fā)明CystatinS血清檢測試劑盒分別檢測胃癌及正常人血清中CystatinS濃度。結(jié)果：正常對照組血清CystatinS范圍是92.26-292U/mL，均值為147.02U/mL；胃癌患者血清CystatinS范圍是84.64-950.65U/mL，均值為470.08U/mL；ROC曲線統(tǒng)計結(jié)果如圖2所示。然后根據(jù)ROC曲線(圖2)，統(tǒng)計CystatinS的曲線下面積，結(jié)果如表1所示。結(jié)果顯示，用于區(qū)分胃癌與正常人的cutoff值為212U/mL，曲線下面積為0.892，診斷靈敏度為79％，特異性為90％。表1.ROC曲線下的面積a.在非參數(shù)假設下，b.零假設：實面積＝0.5。二、試劑盒用于療效評估取北京協(xié)和醫(yī)院胃癌患者10例，治療前檢測CystatinS濃度，療程結(jié)束后再檢測CystatinS濃度。CystatinS濃度與治療前相比下降小于50％，判斷為治療無效；CystatinS濃度與治療前相比下降大于50％，判斷為病情改善；CystatinS濃度與治療前相比下降大于90％，判斷為有效；CystatinS濃度下降至值以下，判斷為治療效果顯著。表2、評估胃癌療效結(jié)果患者編號治療前后濃度變化百分比臨床評價01降低25％無效02降低23％無效03降低53％改善04升高37％無效05降低72％改善06降低56％改善07降低96％有效08降低56％改善09升高28％無效10降低81％有效由表2可知，CystatinS磁微?；瘜W發(fā)光定量檢測試劑盒的療效評估結(jié)果是，10例患者中，2例患者治療有效，4例患者治療后病情得到改善，其余4例患者無治療效果，與臨床判斷結(jié)果一致。三、試劑盒用于轉(zhuǎn)移復發(fā)監(jiān)控北京協(xié)和醫(yī)院早期胃癌患者10例化療療程結(jié)束后，檢測血清CystatinS濃度，并對患者進行跟蹤隨訪。治療后六周首次檢測血清CystatinS濃度，以后每三個月檢測一次，跟蹤九個月，檢測四次。表3、監(jiān)控胃癌轉(zhuǎn)移復發(fā)結(jié)果患者編號6周U/mL3個月U/mL6個月U/mL9個月U/mL臨床評價01241.03234.09215.19244.09無進展生存02137.14166.27129.34157.95無進展生存03183.56108.60105.6195.93無進展生存04143.95156.80174.94130.34無進展生存05203.15300.29323.47428.24轉(zhuǎn)移復發(fā)06175.21196.17140.51120.06無進展生存07251.40279.99224.12219.70無進展生存08145.72195.28161.89172.36無進展生存09120.88320.59398.61549.92轉(zhuǎn)移復發(fā)10249.28202.27276.90240.91無進展生存由表3可知，結(jié)果顯示，通過本發(fā)明的試劑盒檢測血清CystatinS濃度變化，可早于臨床癥狀和體征發(fā)現(xiàn)胃癌患者是否復發(fā)轉(zhuǎn)移，為醫(yī)生可提前進行干預提供指導。綜上所述，本發(fā)明的試劑盒可用于精確測定CystatinS，為胃癌、腸癌的早期鑒別診斷、療效評估提供有效的參考。當前第1頁1 2 3