本發(fā)明屬于免疫檢測(cè)分析技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及一種基于光子晶體光纖免疫傳感器及甲胎蛋白抗原的檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

原發(fā)性肝癌(Primary Hepatic Carcinoma PHC) 是臨床上最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。當(dāng)下，肝癌在全球的發(fā)病率都呈上升趨勢(shì)。據(jù)世界衛(wèi)生組織發(fā)表的《全球癌癥報(bào)2014》報(bào)道，中國(guó)新增癌癥病例高居世界第一位，其中肝癌的新增病例和死亡人數(shù)均居世界首位。因此，原發(fā)性肝癌的早期診斷、治療意義重大。

甲胎蛋白(α-fetoprotein 或AFP) 是單一多聚體肽鍵蛋白，由590個(gè)氨基酸組成，分子量約70kD，含糖4％。AFP主要由胎肝和卵黃囊合成，其次是胃腸道粘膜，腎臟也可少量合成。胎兒6周開(kāi)始合成，12～15周達(dá)高峰，出生后l～2年降至成人水平。AFP是迄今為止發(fā)現(xiàn)的原發(fā)性肝癌最靈敏、最特異的腫瘤標(biāo)志物，70.95％的原發(fā)性肝癌患者呈現(xiàn)AFP水平升高。中國(guó)肝癌研究協(xié)會(huì)報(bào)導(dǎo)正常人血清AFP<20ng/ml，而原發(fā)性肝癌患者血清AFP多數(shù)在500ng/ml左右。血液中甲胎蛋白水平對(duì)于腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)，病情的發(fā)展、治療后的評(píng)價(jià)、監(jiān)測(cè)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移等方面都具有一定的應(yīng)用價(jià)值，可以為患者爭(zhēng)取治療時(shí)間，延長(zhǎng)患者生命。其臨床診斷價(jià)值已得到廣泛認(rèn)可，隨著試劑靈敏度的不斷提高，其臨床應(yīng)用價(jià)值也更為廣泛。

熒光免疫檢測(cè)技術(shù)具有專(zhuān)一性強(qiáng)、靈敏度高、實(shí)用性好等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛用于測(cè)量含量很低的生物活性化合物，例如蛋白質(zhì)(酶、接受體、抗體)、激素(甾族化合物、甲狀腺激素、酞激素)、藥物及微生物等。在過(guò)去十年里，毛細(xì)管廣泛被用于制作熒光免疫傳感器，基于毛細(xì)管的免疫分析具有快速、試劑消耗量小、易操作等優(yōu)點(diǎn)，毛細(xì)管作為樣品池的同時(shí)，管壁也可作為光導(dǎo)介質(zhì)。盡管具有以上優(yōu)勢(shì)，毛細(xì)管作為一維的圓柱形，檢測(cè)靈敏度受到了一定限制。

段等人用石英管將8根毛細(xì)管包裹其中，并且用鋁箔片作為反光材質(zhì)更有效的收集熒光，制作出了三維的毛細(xì)管熒光免疫傳感器用來(lái)檢測(cè)癌胚抗原。相比于二維毛細(xì)管熒光免疫傳感器（8根毛細(xì)管排成一排），所設(shè)計(jì)的三維傳感器由于增加了傳感面積，靈敏度提高了3.4倍。（參考文獻(xiàn)：“Capillary-Based Three-Dimensional Immunosensor Assembly for High-Performance Detection of Carcinoembryonic Antigen Using Laser-Induced Fluorescence Spectrometry”，Qiaoling Yu, Xu Wang, Yixiang Duan. Analytical. Chemistry. 2014, 86, 1518?1524.）

1996年，英國(guó)南安普頓大學(xué)光電研究中心和丹麥技術(shù)大學(xué)電磁系首次成功制備出光子晶體光纖。由于其獨(dú)特的光學(xué)特性，已廣泛被用于通訊、非線性設(shè)備、高功率激光器等領(lǐng)域。除此之外，光子晶體光纖也可被當(dāng)成一束具有多個(gè)微通道的毛細(xì)管，從而作為一種微反應(yīng)器或生物傳感器。本文擬研制基于光子晶體光纖的甲胎蛋白熒光免疫傳感器，由于微通道大大地增加了比表面積，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)肝癌腫瘤標(biāo)志物進(jìn)行快速、方便、靈敏檢測(cè)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種基于光子晶體光纖免疫傳感器及其制備方法，另一目的是提供甲胎蛋白抗原的檢測(cè)方法。

鑒于腫瘤標(biāo)志物在腫瘤檢測(cè)中的重要地位、光子晶體光纖獨(dú)特的多通道結(jié)構(gòu)以及熒光免疫技術(shù)的優(yōu)勢(shì)。我們將結(jié)合光子晶體光纖和熒光免疫兩種技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)甲胎蛋白抗原的定量檢測(cè)。預(yù)處理過(guò)的光子晶體光纖內(nèi)表面富含醛基，可以和甲胎蛋白單克隆抗體(Ab₁) 的氨基反應(yīng)，從而使Ab₁共價(jià)結(jié)合于光子晶體光纖表面。熒光標(biāo)記的甲胎蛋白抗體（Ab₂）、甲胎蛋白抗原和結(jié)合在光子晶體光纖表面的甲胎蛋白抗體(Ab₁) 通過(guò)抗體抗原之間的作用，形成一種夾心結(jié)構(gòu)Ab₁-AFP-Ab₂。通過(guò)測(cè)量熒光強(qiáng)度的大小即可對(duì)甲胎蛋白抗原進(jìn)行定量檢測(cè)。

本發(fā)明的具體技術(shù)方案如下：

1.光子晶體光纖免疫傳感器的制作方法：

1) 光子晶體光纖的預(yù)處理

依次用0.1M HCl，0.1M NaOH清洗PCF，使內(nèi)表面硅羥基進(jìn)行活化。 然后用水清洗、N₂吹干。通入1% v/v氨丙基二乙氧基甲基硅烷（3-ADMS）的甲苯溶液，通過(guò)相互反應(yīng)使得PCF內(nèi)表面覆蓋一層氨基。清洗后，再通入2.5% 戊二醛（GA）水溶液，其中一端的醛基與PCF內(nèi)壁的氨基相互作用，另外一端的醛基用來(lái)結(jié)合包被抗體Ab₁。

2）抗體Ab₁的固定

向醛基活化的PCF中通入15 μg/mL 甲胎蛋白抗體Ab₁，置于4℃冰箱過(guò)夜，0.1M pH 7.4 PBS溶液洗去未結(jié)合的Ab₁。

3）消除非特異性吸附

通入10mg/mL 氧化型谷胱甘肽（GSSG）溶液至PCF中，室溫放置2h，消除非特異性吸附。PBS清洗后，置于4℃冰箱，待用。

2.甲胎蛋白抗原的檢測(cè)方法，采用權(quán)利要求1所述的PCF免疫傳感器，包括如下步驟：

1）將待測(cè)樣品通入所述PCF中，37℃免疫反應(yīng)60min，PBST（含0.05% v/v Tween-20的PBS）洗去未結(jié)合的AFP。

2）將AF-488標(biāo)記的甲胎蛋白抗體（Ab₂）通入PCF中，37℃免疫反應(yīng)60min，PBST洗去未結(jié)合的Ab₂。

3）除去PCF表面的丙烯酸酯涂層（長(zhǎng)度約1cm），作為檢測(cè)窗口。

3.采用激光誘導(dǎo)熒光（LIF）作為檢測(cè)方法檢測(cè)， LIF檢測(cè)激發(fā)波長(zhǎng)為488nm，發(fā)射波長(zhǎng)為520nm。

附圖說(shuō)明

圖1是本發(fā)明所使用的光子晶體光纖橫截面的掃描電鏡圖片

圖2是本發(fā)明的檢測(cè)甲胎蛋白抗原的原理圖

圖3是本發(fā)明的甲胎蛋白抗原的LIF檢測(cè)示意圖

圖4是不同濃度GSSG的非特異性吸附值大小

圖5是Ab1濃度的優(yōu)化圖

圖6本發(fā)明制備的基于光子晶體光纖的甲胎蛋白(AFP) 樣品定量檢

測(cè)擬合曲線。

圖7傳統(tǒng)ELISA檢測(cè)結(jié)果

圖8是不同干擾試劑對(duì)測(cè)定的影響

圖9不同方法檢測(cè)臨床血清樣品的結(jié)果對(duì)比

本發(fā)明的優(yōu)勢(shì)在于：

1. 采用光子晶體光纖作為免疫反應(yīng)載體，由于具有排列均勻的多通道結(jié)構(gòu)（126個(gè)直徑為4-5μm的微通道），使其具有大的比表面積（約為相同截面積毛細(xì)管的10-12倍），一方面可以結(jié)合更多的Ab₂，使其熒光信號(hào)增強(qiáng)；另一方面，光子晶體光纖的三維結(jié)構(gòu)，可以更有效地收集熒光信號(hào)。

2.采用氧化型谷胱甘肽作為封閉劑消除非特異性吸附，由于其分子量小，可以提供足夠的空間使抗原抗體有效結(jié)合。

3. 采用光子晶體光纖內(nèi)壁的醛基和抗體的氨基之間的反應(yīng)形成的牢固的化學(xué)鍵，而非傳統(tǒng)的靜電吸附作用，提高了抵抗非特異性吸附的能力，熒光強(qiáng)度和甲胎蛋白濃度之間正相關(guān)關(guān)系可同時(shí)實(shí)現(xiàn)定性和定量檢測(cè)，且靈敏度高，最低可檢測(cè)出0.1ng/mL。

具體實(shí)施方式

下面通過(guò)具體實(shí)施方式來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該明了，所述實(shí)施例僅僅是幫助理解本發(fā)明，不應(yīng)視為對(duì)本發(fā)明的具體限制。

圖2是本發(fā)明的檢測(cè)甲胎蛋白抗原的原理圖，圖3是本發(fā)明的甲胎蛋白抗原的LIF檢測(cè)示意圖。

實(shí)施例1

所用的試劑儀器設(shè)備來(lái)源：

1 甲胎蛋白抗原及其抗體：北京博奧森生物技術(shù)有限公司；

2 抗原稀釋液：北京科躍中楷生物技術(shù)有限公司；

3 氧化型谷胱甘肽：西格瑪奧德里奇；

4 氨丙基二乙氧基甲基硅烷、戊二醛：西格瑪奧德里奇；

5 LMA-20 光子晶體光纖：NKT 光子學(xué)(丹麥)

6 二極管激光器：Cobolt AB, (瑞典)

7 光學(xué)元件：北京卓立漢光儀器有限公司

8 光電倍增管：北京濱松光子學(xué)商貿(mào)（中國(guó)）有限公司

9 色譜工作站：上海萬(wàn)象儀器有限公司

光子晶體光纖免疫傳感器的制備

1) 光子晶體光纖的預(yù)處理

依次用0.1M HCl，0.1M NaOH清洗PCF，時(shí)間分別為30min和60min，使內(nèi)表面硅羥基進(jìn)行活化。 用水清洗30min后，N₂吹干。注射泵推入1% v/v氨丙基二乙氧基甲基硅烷（3-ADMS）的甲苯溶液，反應(yīng)1h，使得PCF內(nèi)表面具有氨基。依次用甲苯、水各清洗15min后，再通入2.5% 戊二醛（GA）水溶液反應(yīng)1h，其中一端的醛基與PCF內(nèi)壁的氨基相互作用，另外一端的醛基用來(lái)結(jié)合包被抗體Ab₁。

2）抗體Ab₁的固定

向醛基活化的PCF中通入15 μg/mL 甲胎蛋白抗體Ab₁，用橡皮塞將其兩端封口，置于4℃冰箱過(guò)夜，PBS溶液沖洗10min，洗去未結(jié)合的Ab₁。

3）消除非特異性吸附

通入10mg/mL 氧化型谷胱甘肽（GSSG）至PCF中，兩端封口，室溫放置2h，消除非特異性吸附。PBS清洗后，將其截為多根，每根長(zhǎng)度為6cm，置于4℃冰箱，待用。

實(shí)施例2

1、甲胎蛋白抗原標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

1）用抗原稀釋液配置將一系列不同濃度的甲胎蛋白抗原標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，依次通入不同根PCF中，37℃免疫反應(yīng)60min，PBST洗去未結(jié)合的AFP。

2）將AF-488標(biāo)記的甲胎蛋白抗體（Ab₂）通入PCF中，37℃免疫反應(yīng)60min，PBST洗去未結(jié)合的Ab₂。

3）用小刀除去PCF表面的丙烯酸酯涂層（長(zhǎng)度約1cm），作為L(zhǎng)IF檢測(cè)窗口。

4）設(shè)置激光器功率為1mW，光電倍增管（PMT）收集520nm處熒光強(qiáng)度。

5）以熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，AFP濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。該抗原的最低檢出限為0.1ng/mL，如圖6所示。而毛細(xì)管熒光免疫傳感器的最低檢出限為0.5ng/mL，傳統(tǒng)的ELISA的最低檢出限為3.5 ng/mL，如圖7所示，說(shuō)明本發(fā)明的PCF熒光免疫傳感器具有更高的靈敏度。

本發(fā)明所提出的檢測(cè)方法能夠放大信號(hào)，提高檢測(cè)靈敏度，在實(shí)際應(yīng)用中，對(duì)于特定的目標(biāo)物具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

2、樣品檢測(cè)

1）將樣品溶液通入PCF中，37℃免疫反應(yīng)60min，PBST洗去未結(jié)合的AFP。

2）將AF-488標(biāo)記的甲胎蛋白抗體（Ab₂）通入PCF中，37℃免疫反應(yīng)60min，PBST洗去未結(jié)合的Ab₂。

3）用小刀除去PCF表面的一小塊丙烯酸酯涂層（長(zhǎng)度約1cm），作為L(zhǎng)IF檢測(cè)窗口。

4）設(shè)置激光器功率為1mW，光電倍增管（PMT）收集520nm處熒光強(qiáng)度。

5）測(cè)得的熒光強(qiáng)度代入甲胎蛋白抗原標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出樣品中甲胎蛋白抗原濃度。

3、干擾測(cè)定

用抗原稀釋液配置濃度為50 ng/mL的AFP溶液，將其作為溶劑配置一系列濃度為5μg/mL的干擾試劑（抗壞血酸，葡萄糖，亮氨酸，甘氨酸，谷氨酸，癌胚抗原，免疫球蛋白G），濃度比AFP: 干擾試劑=1:100。按照上述方法測(cè)其熒光強(qiáng)度，計(jì)算含不同干擾試劑與不含干擾試劑的熒光強(qiáng)度比值，如圖8所示，比值在87.0%-107.2%之間，說(shuō)明在干擾試劑存在下不影響甲胎蛋白的檢測(cè)。

實(shí)施例3

實(shí)際樣品檢測(cè)

取一份血清樣品，加入不同已知濃度的AFP標(biāo)樣，計(jì)算加標(biāo)回收率。結(jié)果列于下表。

用本發(fā)明所制備的傳感器對(duì)10份已知濃度的實(shí)際血清樣本進(jìn)行檢測(cè)。將熒光強(qiáng)度代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，所得結(jié)果與已知濃度進(jìn)行比較，如圖9所示，說(shuō)明該方法具有較高的準(zhǔn)確性。